1、微生物生長測量方法,個(gè)體計(jì)數(shù)法,重 量 法,生理指標(biāo)法,1.個(gè)體計(jì)數(shù)法,a.直接法,利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,缺點(diǎn)： 不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,b.簡接法,原理是每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。,2.重量法,通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量的測定間接推算 微生物群體的生物量；,測定多細(xì)胞及絲狀真菌生長情況的有效方法,以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；,3.生理指標(biāo)測定法,樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯， 因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏

2、呼吸儀、微量量 熱計(jì)等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。,常用于對(duì)微生物的快速鑒定與檢測,微生物的生理指標(biāo)，如呼吸強(qiáng)度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。,生物個(gè)體由小到大的增長，即表現(xiàn)為細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加,生長,指生物個(gè)體數(shù)目的增加,繁殖,在單細(xì)胞微生物中，生長繁殖的速度很快，而且兩者始終交替進(jìn)行，個(gè)體生長與繁殖的界限難以劃清，因此實(shí)際上常群體生長作為衡量微生物生長的指標(biāo)。,群體生長的實(shí)質(zhì)是包含著個(gè)體細(xì)胞生長與繁殖交替進(jìn)行的過程,個(gè)體生長 個(gè)體繁殖 群體生長 群體生長 個(gè)體生長+個(gè)體繁殖 由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長來反映個(gè)體生長的狀況,第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律,一、細(xì)

3、菌群體生長規(guī)律,在不補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個(gè)培養(yǎng)液體積不變條件下，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)細(xì)菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。,生長曲線,生長曲線可分：,延滯期,對(duì)數(shù)期,衰亡期,穩(wěn)定期,1.延滯期,將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時(shí)間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應(yīng)期。,遲緩期的特點(diǎn)：分裂遲緩、代謝活躍,通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短； 利用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞作為“種子”； 盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大； 適當(dāng)擴(kuò)大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良的影響。,在工業(yè)

4、發(fā)酵和科研中通常采取一定的措施縮短延滯期：,2.對(duì)數(shù)期,指數(shù)期的特點(diǎn) 細(xì)菌數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加 生長速度常數(shù)R最大 細(xì)胞進(jìn)行平衡生長 酶系活躍，代謝旺盛 影響指數(shù)期微生物增代時(shí)間的因素 菌種 營養(yǎng)成分 營養(yǎng)物的濃度 發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度,細(xì)菌研究中常用的三個(gè)參數(shù),（1）繁殖代數(shù)（n） 指數(shù)生長方式： 1 2 4 8 2n 設(shè)接種時(shí)細(xì)胞數(shù)為x1, 時(shí)間為t1, 到時(shí)間t2后，繁殖n代，細(xì)胞數(shù)為x2，它們之間的相互關(guān)系為： x2 = x1*2n 以對(duì)數(shù)表示： x2 = x1 + n2 x2 - x1 n = = 3.322( x2 - x1 ) 2,（2）生長速度常數(shù)（R） n

5、x2 - x1 R = = t2 t1 log2( t2 t1 ) （3）代時(shí)(G) 1 t2 t1 G = = R 3.322( x2 - x1),特點(diǎn)： 1 生長速率常數(shù)R等于0 2 菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高值 3 合成次生代謝產(chǎn)物 4 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)儲(chǔ)藏物質(zhì)，芽孢菌內(nèi)開始 產(chǎn)生芽孢 產(chǎn)生原因： 營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡 營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適 有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等） 物化條件（pH、氧化還原勢等）不合適,通過補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對(duì)好氧菌進(jìn)行通氣、攪拌或振蕩等 獲得更多的代謝產(chǎn)物,3.穩(wěn)定期,4.衰亡期,特點(diǎn)： 1 R為負(fù)值 2 細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變

6、化，出現(xiàn)不規(guī)則的衰退形 3 釋放次生代謝產(chǎn)物，芽孢等 4 菌體開始自溶 產(chǎn)生原因： 生長條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡,二、同步培養(yǎng),1.概念,同步培養(yǎng)(synchronous culture)：是一種培養(yǎng)方法，它能使群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時(shí)進(jìn)行生長或分裂的群體細(xì)胞。,同步生長：以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長階段，并同時(shí)進(jìn)行分裂的生長方式,同步培養(yǎng)物常被用來研究在單個(gè)細(xì)胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業(yè)發(fā)酵的種子，它是一種理想的材料。,同步培養(yǎng)方法,機(jī)械方法,環(huán)境條件控制技術(shù),離心方法,過濾分離法,硝酸纖維素濾膜法,溫度,培養(yǎng)基成份控

7、制,光照和黑暗交替培養(yǎng),硝酸纖維素濾膜法,離心法,三、連續(xù)培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)(continous culture of microorganisms)是在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。,連續(xù)培養(yǎng)的基本原則：微生物培養(yǎng)過程中不斷的補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物,連續(xù)培養(yǎng)類型,恒濁連續(xù)培養(yǎng),恒化連續(xù)培養(yǎng),(一)恒化連續(xù)培養(yǎng),在整個(gè)培養(yǎng)過程中通過控制培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度基本恒定的方式，保持細(xì)菌的比生長速率恒定，使生長“不斷”進(jìn)行。,生長速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機(jī)鹽，生長

8、因子等物質(zhì),恒化器連續(xù)培養(yǎng)通常用于微生物學(xué)的研究，篩選不同的變種。,(二)恒濁連續(xù)培養(yǎng),通過連續(xù)培養(yǎng)裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細(xì)菌生長連續(xù)進(jìn)行的一種培養(yǎng)方式。,用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè),(三)連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比,優(yōu)點(diǎn)：縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率； 便于自動(dòng)控制； 降低動(dòng)力消耗及體力勞動(dòng)強(qiáng)度； 產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；,缺點(diǎn)：雜菌污染和菌種退化,第三節(jié) 環(huán)境因素對(duì)微生物的影響,影響因素：,氧,溫 度,PH 值,(一) 溫 度,根據(jù)微生物生長的最適溫度不同，可以將微生物分為嗜冷、兼性嗜冷、嗜溫、嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型。它們都有各自的最低、最適和最高生

9、長溫度范圍。,最適生長溫度：某菌分裂代時(shí)最短或生長速率最高時(shí)的培養(yǎng)溫度,(二) PH,微生物生長過程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個(gè)最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長速率最大，因此微生物生長也有一個(gè)最適生長的pH范圍。,(三) 氧,根據(jù)氧與微生物生長的關(guān)系可將微生物分為,好氧,微好氧,耐氧型,兼性厭氧,專性厭氧,自由基是一種強(qiáng)氧化劑，它與生物大分子互相作用，可導(dǎo)致產(chǎn)生生物分子自由基，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷或突變作用，直至死亡。氧之所以對(duì)專性厭氧微生物以外的其他四種類型微生物不產(chǎn)生致死作用，是因?yàn)樗鼈兙哂谐跷锲缁?，可催化起氧化基化合物分?/p>

10、，最終分解成水。,氧對(duì)于好氧微生物生長雖然可以通過好氧呼吸產(chǎn)生更多的能量，滿足機(jī)體的生長需要，但另一方面，氧對(duì)一切生物都會(huì)使其產(chǎn)生有毒害作用的代謝產(chǎn)物，如超氧基化合物與H2O2，這兩種代謝產(chǎn)物互相作用還會(huì)產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的自由基OH.。,第四節(jié) 微生物生長繁殖的控制,一、基本概念,防腐(antisepsis)：在某些化學(xué)物質(zhì)或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施,消毒(disinfection)：利用某種方法殺死或滅活物質(zhì)或物體中所有病原微生物的一種措施,滅菌(sterilization)：指利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內(nèi)的所有微生物的一種措施,化療(chemotherapy)：利

11、用具有選擇毒性的化學(xué)物質(zhì)如磺胺、抗生素等對(duì)生物體內(nèi)部被微生物感染的組織成病受細(xì)胞進(jìn)行治療，以殺死組織內(nèi)的病原微生物或病變細(xì)胞，但對(duì)機(jī)體本身無毒害作用的治療措施。,二、控制微生物的化學(xué)物質(zhì),1抗微生物劑,抗微生物劑(antimicrobial agcnt)是一類能夠殺死微生物或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì),根據(jù)它們抗微生物的特性可分為：,抑菌劑,殺菌劑,溶菌劑,用機(jī)理是這類物質(zhì)結(jié)合到核糖體上抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致生長停止，由于它們同核糖體結(jié)合不緊，它們?cè)跐舛冉档蜁r(shí)又會(huì)游離出來，核糖體合成蛋白質(zhì)的能力恢復(fù)，使生長恢復(fù),它們是緊緊地結(jié)合到細(xì)胞的作用靶上，即使在濃度降低時(shí)也不能游離出來，因此生長不能恢復(fù),能

12、抑制細(xì)胞壁合成或損傷細(xì)胞質(zhì)膜,抗微生物劑通常又將它們分為,消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。,防腐劑：能殺死微生物或抑制其生長，但對(duì)人及動(dòng)物的體表組 織無毒性或毒性低，可作為外用抗微生物藥物。,HgCl2、CuSO4、碘液、氯氣、乙烯氧化物、甲醛劑、臭氧,有機(jī)汞、0.1%-1硝酸銀、碘液、70%乙醇、3過氧化氫,各種抗微生物化學(xué)制劑殺菌能力的比較標(biāo)準(zhǔn)：,石炭酸系數(shù)： 指在一定時(shí)間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度和達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規(guī)定處理時(shí)間為10分鐘，而供試菌定為Salmonella typhi（傷寒沙門氏菌）。,在臨床上最早使用的消毒劑-石炭

13、酸,2抗代謝物 (Antimetabolite),有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以至可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙了酶的功能，干擾了代謝的正常進(jìn)行，這些物質(zhì)稱為抗代謝物。,葉酸對(duì)抗物（磺胺）、 嘌呤對(duì)抗物（6-巰基嘌呤）、 苯丙氨酸對(duì)抗物（對(duì)氟苯丙氨酸）、 尿嘧啶對(duì)抗物（5-氟尿嘧啶） 胸腺嘧啶對(duì)抗物（5-溴胸腺嘧啶）,磺胺藥物是最早發(fā)現(xiàn)，也是最常見的化學(xué)療劑，抗菌譜廣，能治療多種傳染性疾病。,大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌（如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等） 某些革蘭氏陰性細(xì)菌（如痢疾桿菌、腦膜炎球菌、流感桿菌等） 對(duì)放線菌也有一定的作用。,作用機(jī)理：磺胺是葉酸組成部分對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似

14、物,磺胺的抑菌作用是因?yàn)楹芏嗉?xì)菌需要自己合成葉酸而生長。,磺胺對(duì)人體細(xì)胞無毒性，因?yàn)槿巳狈膶?duì)氨基苯甲酸合成葉酸的 相關(guān)酶-二氫葉酸合成酶，不能用外界提供的對(duì)氨基苯甲酸自行 合成葉酸，而必須直接利用葉酸為生長因子進(jìn)行生長。,3抗生素,抗生素(Antibiotic) 是由某些生物合成或半合成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物或衍生物，它們?cè)诤艿蜐舛葧r(shí)就能抑制或影響它種生物的生命活動(dòng)，如殺死微生物或抑制其生長。,(1)概念,自本世紀(jì)40年代以來，已找到上萬種新抗生素，合成了近10萬種半合成抗生素，但其中在臨床上常用的僅幾十種。,(2)作用機(jī)制,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成,破壞細(xì)胞質(zhì)膜,作用于呼吸鏈以干擾氧化磷酸化,抑制蛋

15、白質(zhì)和核酸合成,(3)細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生,抗性菌株特點(diǎn)：,細(xì)胞質(zhì)膜透性改變，使抗生素不進(jìn)入細(xì)胞或進(jìn)入細(xì)胞 后被細(xì)胞主動(dòng)排出； 藥物作用靶改變； 合成了修飾抗生素的酶； 抗性菌株發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致合成新的多聚體，以取 代或部分取原來的多聚體；,(4)應(yīng)用抗生素注意,(1)第一次使用的藥物劑量要足； (2)避免在一個(gè)時(shí)期或長期多次使用同種抗生素； (3)不同的抗生素(或與其他藥物)混合使用； (4)對(duì)現(xiàn)有抗生素進(jìn)行改造； (5)篩選新的更有效的抗生素；,三、控制微生物的物理因素,溫度,輻射作用,過濾,滲透壓,干燥,超聲波,1.高溫滅菌,高壓蒸汽滅菌法,高壓蒸汽滅菌的溫度越高，微生物死亡越快。通常情況下溫度為121.3。,衡量滅菌效果的指標(biāo),十倍致死時(shí)間 (decimal reduction time)：即在一定的溫度條件下，微生物數(shù)量十倍減少所需要的時(shí)間。 熱致死時(shí)間(thennaldeathtime)：即在一定溫度下殺死所有某一濃度微生物所需要的時(shí)間,干熱滅菌,烘箱內(nèi)熱空氣滅菌 火焰灼燒,干熱滅菌,溫度：150-170 ； 時(shí)間：1-2h 對(duì)象：金屬