1、.在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測(cè)兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?。雙重免疫熒光標(biāo)記法 (double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。(1)直接法雙重免疫熒光標(biāo)記：將標(biāo)記有兩種不同熒光素的抗體( 如抗 A和抗 B) 以適當(dāng)比例混合，滴加在標(biāo)本上孵育，然后洗去未結(jié)合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察， 即可對(duì)兩種抗原進(jìn)行定位和定量。直接法簡(jiǎn)便可靠，但靈敏度較低。(2)間接法雙重免疫熒光標(biāo)記： 用未標(biāo)記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細(xì)胞，洗去多余的第一抗體后， 再用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記的第二抗體孵育組織或細(xì)胞，

2、洗去多余的第二抗體，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察，從而對(duì)兩種抗原進(jìn)行定位和定量。 使用此法應(yīng)注意兩種特異性第一抗體必須來源于不同種屬， 且熒光標(biāo)記第二抗體的種屬必須與第一抗體的種屬相匹配。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)一、免疫熒光技術(shù)中標(biāo)本制作的基本程序近似于酶免疫組化， 不同點(diǎn)如下：1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。4、免疫熒光在封片時(shí)常使用專用封片劑或甘油：0.01M PBS (1 ：1)。條件許可，建議購買抗淬滅的封

3、片液，使標(biāo)本可以保存更久。.5 、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。6 、熒光抗體染色假陽性可能會(huì)多，需要分別設(shè)定陽性和陰性對(duì)照。二、注意事項(xiàng)1、熒光染色后一般在1h 內(nèi)完成觀察，或于4 保存 4h，時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)使熒光提前衰退。2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對(duì)照：(1) 陽性對(duì)照：陽性血清 +熒光標(biāo)記物 ;(2) 陰性對(duì)照：陰性血清 +熒光標(biāo)記物 ;(3) 熒光標(biāo)記物對(duì)照： PBS+ 熒光標(biāo)記物。三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談1、選取一抗時(shí)，要求來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于家兔和大鼠的抗體，二 抗則 是不同熒光信 號(hào)標(biāo) 記的，我用的是donkeyanti -rabbit -FITC(

4、綠)和 donkey anti -rat-Tex-Red( 紅)。2、我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育。 抗體濃度、孵育時(shí)間要自我摸索， 我感覺一抗 4孵育過夜比較好， 背景比較清晰。3、我的陽性對(duì)照采用的是陽性組織切片，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的 IgG ，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+ 熒光標(biāo)記物。4、封閉血清是二抗來源動(dòng)物的正常血清，我用的是10% 正常 donkey血清。5、其余事項(xiàng)同免疫熒光單標(biāo)操作。免疫組化雙重染色方法和步驟在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究實(shí)踐中，經(jīng)常需要檢測(cè)兩種不同物質(zhì)是否在同一.樣品中共存或同一種細(xì)胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重染色。此方法有幾種類型，包括

5、免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合;同一切片的再度染色法(先對(duì)第一種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對(duì)第二種抗原染色、拍照);兩種酶標(biāo)抗體3 又重染色 (分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標(biāo)記第二抗體.用間接法分別顯示 A 和 B 抗原，如兩種一抗來自同一種屬，常有重疊染色);不同種屬來源的抗體雙重染色。目前，最常用的是最后一種方法。不同種屬來源的抗體雙重染色，兩種抗體間無交又反應(yīng).特異性較高，即使細(xì)胞內(nèi)抗原量很少也能檢測(cè)。 但是，當(dāng)兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高， 占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)將妨礙另一種抗原染色， 此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐

6、富的抗原。在該方法中應(yīng)用最多的是把 SABC 法或 SP 法的實(shí)驗(yàn)流程重復(fù)兩次， 其中兩種不同特異性抗體 (可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個(gè)組合 )，與一抗對(duì)應(yīng)的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來。 該方法用于石蠟切片時(shí)應(yīng)考慮所選擇的兩個(gè)抗體的修復(fù)方法應(yīng)該一致或一個(gè)抗體的修復(fù)對(duì)另一個(gè)抗體的染色結(jié)果沒有影響。SP 法雙重染色步驟16 步驟與 SABC 法相同，但無需使用生物素阻斷劑：7.切片加入 A 特異性抗體 (如兔抗 A 抗體 )，4=C 過夜孵育后， PBS 沖洗3 次，每次 5 分鐘8.滴加生物素化二抗 (如抗兔二抗 )，

7、室溫孵育切片10 分鐘，繼而PBS.沖洗 3 次，每次 5 分鐘 ;9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白堿性磷酸酶，室溫孵育10 分鐘， PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘10. 堿性磷酸酶顯色液 (BCIP/NBT) 顯色 (紫藍(lán)色 ).PBS 沖洗 3 次，每次 5分鐘 ;11.滴加 0.05% 鹽酸，室溫 10 分鐘 (可避免已顯色的抗原褪色);12. 滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37C 孵育 10 分鐘 ;13. 滴加 B 特異性抗體 (如小鼠抗 B 抗體 )， 4C 過夜孵育。 PBS 沖洗 3次，每次 5 分鐘 ;14. 滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10 分鐘。 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘：15. 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化物酶， 室溫孵育 10 分鐘，PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘16. 過氧化物酶顯色液 (AEC) 顯色 (鮮紅色 ).PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘17. 蘇木精復(fù)染細(xì)胞核 ;18. 水溶性封片劑封片。在使用 SP 法雙重染色之前需要對(duì)待測(cè)抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)設(shè)計(jì)。購買免疫組化雙染試劑盒時(shí);應(yīng)選擇與設(shè)計(jì)方案相同的配套試劑。在選擇一抗時(shí)應(yīng)避免定位在細(xì)胞的同一部位(如胞核、胞漿和胞膜)的兩種抗原，如果不可避免，最好選擇免疫熒光組織細(xì)胞化學(xué)雙重染色方法，因?yàn)閮煞N不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種