1、植物總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測,制作人：劉紅梅,植物基因組 DNA的提取 瓊脂糖凝膠電泳檢測,脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制備核酸時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋白釋放出來。 植物總DNA包括細胞核DNA和細胞核外DNA,前者存在于細胞核內(nèi)，后者存在于細胞質(zhì)中有半自主性復制活性的細胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。,背景知識,核酸的存在形式,DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物， RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶

2、于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。 在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。,核酸的理化性質(zhì),細胞破碎 抽提去蛋白質(zhì) 沉淀核酸,基本過程,機械方法： 超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學試劑法：用SDS處理細胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。,細胞破碎,SDS法 SDS是有效的陰離子去垢劑, 細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間 常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, SDS能夠破壞這種價鍵。 CTAB法 CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細胞中的DNA-蛋白質(zhì)復合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。,DNA提取,蛋白質(zhì) 常用苯酚：氯仿：異戊醇

3、（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。 RNA 常選用RNase消化 ，或是用LiCl來消除大分子的RNA。 酚類物質(zhì) 提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。 多糖 提取液中加1PVP。,DNA純化（去雜質(zhì)）,實驗材料 新鮮蔬菜葉片(去葉脈) 試劑 2CTAB抽提液 TE 緩沖液(pH=8.0) 氯仿：異戊醇(24:1),材料與試劑,離心機 水浴鍋 研缽 微量移液器,儀器用具,移液器量程的選擇,1取 2g 清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加 1/3 藥匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。 2將 1mL 研磨液轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，置于65水浴中保溫 20m

4、in，其間顛倒混勻23次。破碎細胞 3. 12000r/min 離心 5min，取上清液700L轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心 5min。抽提去蛋白 4將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加 600L異丙醇。顛倒混勻，可見 DNA 絮狀沉淀。沉淀核酸 512000r/min，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。 將沉淀回溶于20L TE 緩沖液待測。,操作步驟,1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與 CTAB 抽提液充分混勻； 2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（25），

5、盡可能選取幼嫩的材料； 3）收集 CTAB 與核酸形成的復合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難； 4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。,注意事項,DNA分子在高于等電點的PH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定電場強度下，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。,電泳原理,瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。 濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。,儀器和試劑,儀器 電泳儀 電泳槽 灌膠模具等,Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）,常用電泳緩沖

6、液,電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。 作用： 增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。 形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。 使樣品呈色，使加樣操作更方便。,上樣緩沖液,溴化乙錠（EB） 是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。 瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng。,核酸染色劑,注意事項： EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。,DNA分子量標準,不同種類DNA Marker,1.凝膠制備 制備0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入 20mL 0.5TBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60 時，加入 EB 至終濃度 0.5g/mL。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。 2.加樣 取10l DNA樣液與 2l 上樣 buffeer 混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。 3.電泳 接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負，電壓為15V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）,待溴酚蘭移動到一定位置，停止電泳。 4.觀察拍照,四、操作步驟,紫外儀上