1、微生物限度檢查方法(薄膜過濾法) 驗證方案微生物限度檢查方法(薄膜過濾法) 驗證方案 編碼：表 一、驗證方案的起草與批準(zhǔn)1.驗證方案起草 起草人： 起草時期： 年 月 日2.驗證小組成員： 3.驗證方案審核部門審核人日 期生產(chǎn)部生產(chǎn)車間QCQA4.驗證方案批準(zhǔn) 批準(zhǔn)人： 批準(zhǔn)日期：二、驗證方案1.驗證目的和原理1.1驗證目的為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進行，若因特殊原因確需要變更時，應(yīng)報驗證委員會批準(zhǔn)。1.2原理通過比較試驗4組中試驗菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評價整個檢驗方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。2.驗證方法步驟2.1

2、驗證前的準(zhǔn)備：進行微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗證前，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結(jié)果沒有影響。試驗菌應(yīng)包括G、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。2.2驗證試驗的操作計劃：用3個不同批號產(chǎn)品微生物限度檢測方法進行平行試驗，通過計算回收率來判斷限度檢查方法是否對產(chǎn)品有影響。2.3試驗結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)菌株評價方法“ ”的微生物限度檢查對檢品中微生物的抑制性，試驗結(jié)果應(yīng)顯示3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗組回收率也不低于70%。3.試驗實施3.1試驗前的準(zhǔn)備3.1.1主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、

3、生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺。3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級，局部潔凈度為100級（或放置同等級凈化工作臺）。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)該保持對環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。3.1.3試驗樣品： 批號： 批號： 批號： 3.1.4培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基批號配制日期有效期至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3.1.5稀釋液：PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以上經(jīng)115高壓蒸汽滅菌30min。3.1.6驗證用微生物名稱及其編號 實驗菌株的來源： 菌株名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌CMCC

4、(B) 44102Ec-金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501Bs-白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca-黑曲霉CMCC(F) 98003An-編號由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組成。3.1.7器具：無菌薄膜過濾器：（孔徑0.45um直徑50mm）、無菌移液管（5ml）4.驗證方法4.1菌液的制備將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在3035下培養(yǎng)1824小時，將白色念珠菌接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)2448小時。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)57天。將上述培養(yǎng)物用0.

5、9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50100cfu的菌懸液。4.2實驗方法供試液的制備：取樣品10g（ml）加入無菌PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使分散均勻，用勻漿儀混勻，置45水浴使膠囊殼溶化混勻，制成1：10均勻的供試液。A樣品試驗組取1:10供試液（相當(dāng)1g或1ml供試品）10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入50100cfu菌液，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細(xì)菌和樣品的面）貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于

6、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。B菌液組取上述制備菌液各1ml加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細(xì)菌和樣品的面）貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。C供試品對照組取上述1：10供試液10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將濾膜取出，接觸樣品的面向上貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培

7、養(yǎng)基平皿上。D稀釋劑對照組取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入50100cfu菌液，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。4.3培養(yǎng) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在3035下培養(yǎng)48小時，將白色念珠菌、黑曲霉在2328下培養(yǎng)72小時，點計菌落數(shù)。5.試驗結(jié)果5.1產(chǎn)品試驗組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱產(chǎn)品試驗組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉

8、5.2供試品對照組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱供試品對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉5.3稀釋劑對照組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱稀釋劑對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉5.4菌液組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱菌液組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉6.回收率計算6.1稀釋劑對照組菌回收率菌種名稱批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率稀釋劑對照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值

9、黑曲霉平均值表中：回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)100%。6.2試驗組菌回收率菌種名稱批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率試驗組供試品對照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)）菌液組的平均菌落數(shù)100%。7.結(jié)論：7.1經(jīng)過驗證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為 %、 %、 %、 %、 %。7.2稀釋劑回收率為 %、 %、 %、 %、 %。 以上驗證結(jié)果證明，本品 采用上述方法進行微生物限度檢查。檢驗人： 復(fù)核人：8.驗證結(jié)果

10、評價分析質(zhì)控部負(fù)責(zé)各項驗證、試驗結(jié)果記錄，驗證小組根據(jù)驗證、試驗結(jié)果進行評價，起草驗證報告，報驗證委員會。驗證委員會負(fù)責(zé)對驗證結(jié)果進行綜合評審，做出驗證結(jié)論，發(fā)放驗證證書。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括：（1） 驗證試驗是否有遺漏；（2） 驗證實施過程中對驗證方案有無修改，修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)；（3） 驗證記錄是否完整；（4） 驗證試驗結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，偏差及對偏差的說明是否合理，是否需進一步補充試驗。9.最終審批驗證報告由驗證組長審核后，報驗證總負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)，并簽發(fā)驗證證書。驗證報告 年 月 日至 年 月 日，驗證小組根據(jù)批準(zhǔn)的微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗證文件對微生物限度檢查法進行了相關(guān)的一系列驗證工作，達到了預(yù)期效果，滋將有關(guān)事項說明如下：1、 驗證方案在實施過程中未做修改。2、 驗證方案各項性能指標(biāo)在驗證中未作變動，誤差在允許范圍內(nèi)。3、 驗證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實。4、 驗證結(jié)果符合設(shè)計要求和GMP原則要求，可以投入使用。5、 組分或檢驗條件改變時須重新驗證。以上情況，請驗證委員會審批！驗證小組：年 月 日