1、實驗五 大蒜細(xì)胞SOD的提取和活力測定一、實驗原理超氧化物歧化酶（SOD）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子（O2-）進行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過組織或細(xì)胞破碎后，可用pH7.8磷酸緩沖液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。SOD酶活性測定原理：核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子O2.，當(dāng)加入氮藍四唑（NBT）后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成一種藍色物質(zhì)，在560nm波長下有最大吸收。當(dāng)加入SOD時，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進行

2、，使藍色二甲月替 生成速度減慢。通過在反應(yīng)液中加入不同量的SOD酶液，光照一定時間后測定560nm波長下各液光密度值。二、材料和試劑1提取試劑：（1）. 新鮮蒜瓣（2）. 0.05mol/L/0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）（3）. 氯仿-乙醇混合液：氯仿:無水乙醇=3:5（4）. 丙酮：用前需預(yù)冷至4-102測活試劑：（1）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液準(zhǔn)確稱取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小燒杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的

3、磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。4冰箱中保存可用12d。（2）7.5 104 mol/L NBT溶液準(zhǔn)確稱取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。4冰箱中保存可用23d。（3）含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L核黃素溶液A液：準(zhǔn)確稱取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。B液：準(zhǔn)確稱取核黃素（MW=376.36）0.0753g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。C液：合并A液和B液，移

4、入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，此溶液為含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黃素溶液。4冰箱中保存可用810d。該溶液應(yīng)避光保存，即用黑紙將裝有該液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。當(dāng)測定SOD酶活時，將C液稀釋100倍，即為含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L 核黃素溶液。三、實驗步驟1、組織細(xì)胞破碎：稱取10g大蒜蒜瓣，置于研缽中研磨。2、SOD的提取：破碎后的組織中加入4倍體積（40ml）的0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8），繼續(xù)研磨15min，使SOD充分溶解到緩沖液中，取一半體積于800010000rpm下離心10min，另一半55-60

5、熱處理15 min后離心，取上清液，分別記錄體積并留樣1.5ml。3、除雜蛋白：上清液加入0.25體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min，5000rpm離心15min，得到的上清液為粗酶液。4、SOD的沉淀分離：粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，800010000rpm離心10min，得SOD沉淀。將SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）中（溶解時，住ml加入），未經(jīng)加熱變性的樣品于55-60熱處理15 min，得到SOD酶液。5、SOD活力測定每個處理取5個洗凈干燥好的微燒杯/玻璃試管編號，按表1加入各試劑及酶液，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3mL。其中4，5號中磷酸鈉緩沖液量

6、和酶液量可根據(jù)試驗材料中酶液濃度及酶活力進行調(diào)整（4號為Pi粗提酶，5號為丙酮沉淀）。各試劑全部加入后，充分混勻，取1號微燒杯置于暗處，作為空白對照，比色時調(diào)零用。其余4個微燒杯均放在溫度為25，光強為4 500Lux的光照箱內(nèi)（安裝有3根20W的日光燈管）照光15min，然后立即遮光終止反應(yīng)。在560nm波長下以1號杯液調(diào)零，測定各杯液光密度并記錄結(jié)果。以2、3號杯液光密度的平均值作為抑制NBT光還原率100，對照測出其他酶液的光密度值。表1 反應(yīng)系統(tǒng)中各試劑及酶液的加入量（mL） 試 劑杯 號磷酸鈉緩沖液蛋氨酸（Met）NBT溶液酶 液核黃素10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.34（粗提酶）0.21.50.30.70.350.21.50.30.70.3結(jié)果計算1560nm波長下各杯液的光密度（表2）表2 測定數(shù)據(jù)列表杯 號123452、3號平均值酶液量（mL）0000.70.7光密度（OD560nm）02.SOD酶活力按下式計算：SOD的活性單位以抑制NBT光還原的50%為一個活力單位，按下式計算SOD活性：A(D1D2) V D1 B W 50式中各因子代表內(nèi)容如下：A：為酶活力（酶活力單位：U/g）；V：為酶提取液總體積（mL）