1、1,鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室封青川,第十一章 表觀遺傳學(xué)epigenetics,2,表觀遺傳學(xué)：后基因組時(shí)代的領(lǐng)舞者 DNA雙螺旋的解碼者、諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Watson說： “你可以繼承DNA序列之外的一些東西。這正是現(xiàn)在遺傳 學(xué)中讓我們激動(dòng)的地方?！?3,3,4,4,4,發(fā) 展 歷 史,2000多年前，古希臘哲學(xué)家亞里士多德在On the Generation of Animals一書中首先提出后生理論（the theory of epigenesis），它相對于先成論，新器官的發(fā)育由未分化的團(tuán)塊逐漸形成的。,5,5,5,1939年，生物學(xué)家 Waddington CH

2、首先在現(xiàn)代遺傳學(xué)導(dǎo)論中提出了epihenetics這一術(shù)語,并于1942年定義表觀遺傳學(xué)為“生物學(xué)的分支，研究基因與決定表型的基因產(chǎn)物之間的因果關(guān)系”。,發(fā) 展 歷 史,6,6,6,1975年，Hollidy R 對表觀遺傳學(xué)進(jìn)行了較為準(zhǔn)確的描述。他認(rèn)為表觀遺傳學(xué)不僅在發(fā)育過程，而且應(yīng)在成體階段研究可遺傳的基因表達(dá)改變，這些信息能經(jīng)過有絲分裂和減數(shù)分裂在細(xì)胞和個(gè)體世代間傳遞，而不借助于DNA序列的改變，也就是說表觀遺傳是非DNA序列差異的核遺傳。,發(fā) 展 歷 史,7,7,概 述,表觀遺傳學(xué) 研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳變化的，或者說是研究從基因演繹為表型的過程和機(jī)制的一門新

3、興的遺傳學(xué)分支。 表觀遺傳 所謂表觀遺傳就是不基于DNA差異的核酸遺傳。即細(xì)胞分裂過程中，DNA 序列不變的前提下，全基因組的基因表達(dá)調(diào)控所決定的表型遺傳，涉及染色質(zhì)重編程、整體的基因表達(dá)調(diào)控（如隔離子，增強(qiáng)子，弱化子，DNA甲基化，組蛋白修飾等功能 ), 及基因型對表型的決定作用。,7,8,8,表觀遺傳學(xué)的特點(diǎn)： 可遺傳的，即這類改變通過有絲分裂或減數(shù)分裂，能在細(xì)胞或個(gè)體世代間遺傳； 可逆性的基因表達(dá)調(diào)節(jié)，也有較少的學(xué)者描述為基因活性或功能的改變； 沒有DNA序列的改變或不能用DNA序列變化來解釋。,8,9,9,概 述,9,10,10,概 述,10,遺傳與表觀遺傳,11,11,概 述,11,

4、12,12,概 述,12,DNA與染色質(zhì),13,13,概 述,相同的基因型,不同的表現(xiàn)型,基因表達(dá)模式,13,14,14,基因表達(dá)模式 決定細(xì)胞類型的不是基因本身，而是基因表達(dá)模式，通過細(xì)胞分裂來傳遞和穩(wěn)定地維持具有組織和細(xì)胞特異性的基因表達(dá)模式對于整個(gè)機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能協(xié)調(diào)是至關(guān)重要的。 基因表達(dá)模式在細(xì)胞世代之間的可遺傳性并不依賴細(xì)胞內(nèi)DNA的序列信息。 基因表達(dá)模式有表觀遺傳修飾決定。,概 述,15,15,表觀遺傳學(xué)的研究內(nèi)容：,基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控 基因組中非編碼RNA 微小RNA（miRNA） 反義RNA 內(nèi)含子、核糖開關(guān)等,基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控 DNA甲基化 基因印記 組蛋白共價(jià)修飾

5、 染色質(zhì)重塑,15,概 述,16,17,17,表觀遺傳學(xué)機(jī)制,DNA 甲基化,1,17,18,18,一、DNA甲基化,DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表觀遺傳修飾形式，主要是基因組 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基間的共價(jià)結(jié)合，胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。,胞嘧啶甲基化反應(yīng),18,S-腺苷甲硫氨酸,19,以基因型為a/a的母鼠及其孕育的基因型為AVY/a的仔鼠作實(shí)驗(yàn)對象。孕鼠分為兩組，試驗(yàn)組孕鼠除喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料外，從受孕前兩周起還增加富含甲基的葉酸、乙酰膽堿等補(bǔ)充飼料，而對照組孕鼠只喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料。,20

6、,結(jié)果實(shí)驗(yàn)組孕鼠產(chǎn)下的仔鼠大多數(shù)在身體的不同部位出現(xiàn)了大小不等的棕色斑塊，甚至出現(xiàn)了以棕褐色為主要毛色的小鼠。而對照組孕鼠的仔鼠大多數(shù)為黃色。分析表明喂以富甲基飼料的孕鼠所產(chǎn)仔鼠的IAP所含CpG島的甲基化平均水平遠(yuǎn)高于對照組，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的高甲基化使原該呈異位表達(dá)的基因趨于沉默，毛色也趨于棕褐色。,21,21,哺乳動(dòng)物基因組中5mC占胞嘧啶總量的2%-7%，約70%的5mC存在于CpG二連核苷。 在結(jié)構(gòu)基因的5端調(diào)控區(qū)域, CpG二連核苷常常以成簇串聯(lián)形式排列，這種富含CpG二連核苷的區(qū)域稱為CpG島(CpG islands)，其大小為500-1000bp，約56%的編碼基因含該結(jié)構(gòu)。 基因調(diào)

7、控元件(如啟動(dòng)子)所含CpG島中的5mC會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與DNA的結(jié)合。 DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)； 非甲基化一般與基因的活化相關(guān)聯(lián)； 而去甲基化往往與一個(gè)沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián)。,21,22,22,22,5,3,CpG島主要處于基因5端調(diào)控區(qū)域。 啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島一般是非甲基化狀態(tài)的，其非甲基化狀態(tài)對相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄是必須的。 目前認(rèn)為基因調(diào)控元件（如啟動(dòng)子）的CpG島中發(fā)生5mC修飾會(huì)在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合。因而DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)。,Rb基因,CpG 頻率,23,23,一、DNA甲基化,23,24,24,24,DNA甲基化狀態(tài)的遺傳和保持：

8、DNA復(fù)制后，新合成鏈在DNMT1的作用下，以舊鏈為模板進(jìn)行甲基化。（缺乏嚴(yán)格的精確性，95%） 甲基化并非基因沉默的原因而是基因沉默的結(jié)果，其以某種機(jī)制識(shí)別沉默基因，后進(jìn)行甲基化。 DNA全新甲基化。引發(fā)因素可能包括： DNA本身的序列、成分和次級結(jié)構(gòu)。 RNA根據(jù)序列同源性可能靶定的區(qū)域。 特定染色質(zhì)蛋白、組蛋白修飾或相當(dāng)有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu),25,25,DNA去甲基化 主動(dòng)去甲基化 復(fù)制相關(guān)的去甲基化 在復(fù)制過程中維持甲基化酶活性被關(guān)閉或維持甲基化酶活性被抵制。,25,26,2020年10月4日,26,2020年10月4日,26,復(fù)制相關(guān)的DNA去甲基化,27,27,Manel Estell

9、er, nature, 2007,28,28,28,DNA甲基化狀態(tài)的保持,DNA主動(dòng)去甲基化,DNA全新甲基化,29,29,二、組蛋白修飾,29,30,30,組蛋白修飾是表觀遺傳研究的重要內(nèi)容。 組蛋白的 N端是不穩(wěn)定的、無一定組織的亞單位，其延伸至核小體以外，會(huì)受到不同的化學(xué)修飾，這種修飾往往與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。 被組蛋白覆蓋的基因如果要表達(dá)，首先要改變組蛋白的修飾狀態(tài)，使其與DNA的結(jié)合由緊變松，這樣靶基因才能與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用。因此，組蛋白是重要的染色體結(jié)構(gòu)維持單元和基因表達(dá)的負(fù)控制因子。,30,31,31,二、組蛋白修飾,31,32,32,組蛋白修飾種類 乙酰化- 一般與活化

10、的染色質(zhì)構(gòu)型相關(guān)聯(lián)，乙?；揎棿蠖喟l(fā)生在H3、H4的 Lys 殘基上。 甲基化- 發(fā)生在H3、H4的 Lys 和 Asp 殘基上，可以與基因抑制有關(guān)，也可以與基因的激活相關(guān)，這往往取決于被修飾的位置和程度。 磷酸化- 發(fā)生與 Ser 殘基，一般與基因活化相關(guān)。 泛素化- 一般是C端Lys修飾，啟動(dòng)基因表達(dá)。 SUMO（一種類泛素蛋白）化- 可穩(wěn)定異染色質(zhì)。 其他修飾,33,分子效應(yīng)： 中和賴氨酸上的正電荷，增加組蛋白與DNA的排斥力，使DNA結(jié)構(gòu)變得疏松，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄活化。,(1)組蛋白的乙?；?34,(2)組蛋白的甲基化,分子效應(yīng)： 增加賴氨酸上的疏水力,35,(3)組蛋白的磷酸化,功

11、能： A.轉(zhuǎn)錄調(diào)控：H3K10被Rsk-2磷酸化 B.異染色質(zhì)的形成： H4S1的磷酸化 C.DNA repair ： H2AX磷酸化,36,36,36,Bryan M. Turner, nature cell biology, 2007,組蛋白中被修飾氨基酸的種類、位置和修飾類型被稱為組蛋白密碼（histone code），遺傳密碼的表觀遺傳學(xué)延伸，決定了基因表達(dá)調(diào)控的狀態(tài)，并且可遺傳。,37,通常組蛋白在轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域乙?；?，處于轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，而低乙?；慕M蛋白位于非轉(zhuǎn)錄活性的常染色質(zhì)區(qū)域或異染色質(zhì)區(qū)域。 組蛋白甲基化影響染色質(zhì)的活性狀態(tài)。組蛋白H3亞基N端9位賴氨酸（H3-K9）的甲基化標(biāo)

12、志著非活性DNA序列，但組蛋白H3亞基的4位賴氨酸（H3-K4）的甲基化則表明其具有轉(zhuǎn)錄活性。H3-K9廣泛的分布于異染色質(zhì)區(qū)域，如中心粒、端粒區(qū)域、非活性X染色體以及沉默基因的啟動(dòng)子區(qū)域，而H3-K4主要存在于活性基因的啟動(dòng)子區(qū)域。,38,38,三、染色質(zhì)重塑,染色質(zhì)重塑（chromatin remodeling）是一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。 染色質(zhì)重塑是由染色質(zhì)重塑復(fù)合物介導(dǎo)的一系列以染色質(zhì)上核小體變化為基本特征的生物學(xué)過程。 組蛋白尾巴的化學(xué)修飾（乙?；⒓谆傲姿峄龋┛梢愿淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而影響鄰近基因的活性。,39,39,核小體,40,40,核小體定位是核小體在DNA上特異性定位

13、的現(xiàn)象。 核小體核心DNA并不是隨機(jī)的，其具備一定的定向特性。 核小體定位機(jī)制： 內(nèi)在定位機(jī)制：每個(gè)核小體被定位于特定的DNA片斷。 外在定位機(jī)制：內(nèi)在定位結(jié)束后，核小體以確定的長度特性重復(fù)出現(xiàn)。 核小體定位的意義： 核小體定位是DNA正確包裝的條件。 核小體定位影響染色質(zhì)功能。,41,41,重塑因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)機(jī)制的假設(shè)有兩種: 機(jī)制1：一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子獨(dú)立地與核小體DNA 結(jié)合(DNA可以是核小體或核小體之間的), 然后, 這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子再結(jié)合一個(gè)重塑因子, 導(dǎo)致附近核小體結(jié)構(gòu)發(fā)生穩(wěn)定性的變化, 又導(dǎo)致其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合, 這是一個(gè)串聯(lián)反應(yīng)的過程; （重建） 機(jī)制2：由重塑因子首先獨(dú)立地與核小體

14、結(jié)合, 不改變其結(jié)構(gòu), 但使其松動(dòng)并發(fā)生滑動(dòng), 這將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合, 從而使新形成的無核小體的區(qū)域穩(wěn)定。 （滑動(dòng)）,42,42,染色質(zhì)修飾與重塑（共價(jià)修飾型與ATP依賴型）,43,2020年10月4日,43,ATP依賴的染色質(zhì)重構(gòu)機(jī)制,44,44,邊界子( boundary elements)：相鄰基因間的物理隔離元件。也可稱為隔離子( insulator elements)。 邊界子和隔離子的隔離功能 ： 封阻末梢增強(qiáng)子對啟動(dòng)子的作用。 防止染色質(zhì)位置效應(yīng)（CPE）。 由邊界子所確定的染色質(zhì)片斷是基因組調(diào)節(jié)的基本單位，其構(gòu)成染色質(zhì)的功能與或區(qū)室，這即是染色質(zhì)區(qū)室化。,45,45,四、RN

15、A調(diào)控,1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。 1998，RNAi概念的首次提出。 1999，RNAi作用機(jī)制模型的提出。在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。 2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。RNAi 技術(shù)被Science評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。 至今，蓬勃發(fā)展，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。,45,46,46,RNA干擾（RNAi）作用是生物體內(nèi)的一種通過雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘導(dǎo)特異性序列基因沉默的過程。 由于RNAi發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，所以又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gen

16、e silencing, PTGS ）。 RNA干擾是一種重要而普遍表觀遺傳的現(xiàn)象。,46,47,47,siRNA siRNA結(jié)構(gòu)：21-23nt的雙鏈結(jié)構(gòu)，序列與靶mRNA有同源性，雙鏈兩端各有2個(gè)突出非配對的3堿基。 siRNA功能：是RNAi 作用的重要組分，是RNAi發(fā)生的中介分子。內(nèi)源性siRNA是細(xì)胞能夠抵御轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因和病毒的侵略。,47,48,48,48,siRNA介導(dǎo)的RNAi,Dicer酶 是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈

17、RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3端都有2個(gè)堿基突出。,49,49,siRNAi 的特點(diǎn)： 高效性和濃度依賴性 特異性 位置效應(yīng) 時(shí)間效應(yīng) 細(xì)胞間RNAi的可傳播性 多基因參與及ATP依賴性,49,50,50,miRNA 結(jié)構(gòu)：21-25nt長的單鏈小分子RNA ，5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3端為羥基，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。 特點(diǎn)：具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性 。 功能：,50,51,51,51,52,53,54,54,五、其他表觀遺傳機(jī)制,除DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、和RNA調(diào)控以外，還有遺傳印記、X染色體失活、轉(zhuǎn)

18、座、負(fù)突變等。 遺傳印跡、X染色體失活的本質(zhì)仍為DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑。,55,55,遺 傳 印 記,55,概念： 或稱親本印記（parent imprinting） 是指基因組在傳遞遺傳信息的過程中，通過基因組的化學(xué)修飾（DNA的甲基化；組蛋白的甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化等）而使基因或DNA片段被標(biāo)識(shí)的過程。 特點(diǎn)： 基因組印記依靠單親傳遞某種性狀的遺傳信息，被印跡的基因會(huì)隨著其來自父源或母源而表現(xiàn)不同，即源自雙親的兩個(gè)等位基因中一個(gè)不表達(dá)或表達(dá)很弱。 不遵循孟德爾定律，是一種典型的非孟德爾遺傳，正反交結(jié)果不同。,56,56,56,正交,反交,正常小鼠,矮小型小鼠,矮小型小

19、鼠,矮小型小鼠,正常小鼠,正常小鼠,57,57,57,由正反交實(shí)驗(yàn)可以看出： 印跡基因的正反交結(jié)果不一致、不符合孟德爾定律。 小鼠 Igf-2 基因總是母本來源的等位基因被印跡，父本來源的等位基因表達(dá)，因此是母本印跡。 基因印跡使基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致被印跡的基因的生物功能的喪失。,58,58,58,基因印記過程 印記的去除 印記的去除過程是發(fā)生在原始生殖細(xì)胞的早期階段。 印跡的形成 印跡形成于成熟配子，并持續(xù)到出生后。 印記的維持 基因組印記的機(jī)制 配子在形成過程中，DNA產(chǎn)生的甲基化、核組蛋白產(chǎn)生的乙酰化、磷酸化和泛素化等修飾，使基因的表達(dá)模式發(fā)生了改變。,59,遺傳印記的特點(diǎn),遺傳印記

20、遍布基因組 印記基因的內(nèi)含子小，雄性印記基因重組率高于雌性印記基因 印記基因表達(dá)具有組織特異性 印記基因在世代傳遞中可以逆轉(zhuǎn),60,1. 通常成簇出現(xiàn) 2. 一個(gè)簇中一般有311個(gè)印記基因 絕大多數(shù)多時(shí)編碼可表達(dá)蛋白質(zhì)的基因 至少有一個(gè)起拮抗作用的ncRNA基因，具有雙親特異性的表達(dá)模式 3. 在染色體上的分布較為分散,印記基因的特點(diǎn),61,表達(dá)模式: 母系 父系 雙等位 未知,PWS/AS SNURF-SNRPN UBE3A-UBE3A-AS,62,4. 每一個(gè)印記基因簇由一個(gè)印記控制元件 (imprint control element, ICE) 所調(diào)控，也稱為印記控制區(qū)域 (impri

21、nt control region, ICR) 或者印記中心 (imprinting centre, IC) 5. 絕大多數(shù)都有CpG islands，能夠發(fā)生DNA甲基化，在CpG islands內(nèi)或附近通常有成簇的、有向的重復(fù)片段,印記基因的特點(diǎn),63,64,6. 具有等位基因不同的甲基化區(qū)域 (differentially methylated regions, DMRs) 有些是在所有細(xì)胞里，有些具有組織特異性 有些甲基化的DMR存在于激活的等位基因中，有些則存在于失活的等位基因中 7. 通常具有不同的組蛋白修飾，染色體結(jié)構(gòu)等 8. DNA復(fù)制不同步 父系的拷貝較早發(fā)生復(fù)制,65,1.

22、 通過CpG島或者啟動(dòng)子的差異甲基化來實(shí)現(xiàn),Methyl-C binding proteins (MBPs) Dnmt1 (maintenance DMT) HDACs 關(guān)閉染色體構(gòu)像，形成異染色質(zhì),印記的判讀機(jī)制,66,抑制子與未被甲基化的沉默元件結(jié)合，沉默基因的表達(dá)。而當(dāng)沉默單元甲基化后，抑制子不再結(jié)合,2. 差異性的將沉默因子結(jié)合到順式沉默元件上,印記的判讀機(jī)制,67,例如 CCCTC-binding factor (CTCF) 能夠與未甲基化的等位基因結(jié)合，從而阻斷上游啟動(dòng)子與下游增強(qiáng)子之間的聯(lián)系，從而使得上游基因的轉(zhuǎn)錄被抑制,3. 差異性的甲基化邊界元件/絕緣子,印記的判讀機(jī)制,68

23、,在母源染色體上，DMRl是非甲基化的，它允許鋅指蛋白CTCF與它相結(jié)合，從而隔斷了IGF2和位于H19下游的增強(qiáng)子，所以該增強(qiáng)子只活化H19的轉(zhuǎn)錄。在父源染色體上，DMRl是甲基化的，它不僅使H19基因沉默，CTCF也因此不能與之結(jié)合，結(jié)果是父源IGF2基因在增強(qiáng)子作用下活化表達(dá)。在這個(gè)印記調(diào)控區(qū)，相對增強(qiáng)子作用而言，DMRl起了一個(gè)染色質(zhì)屏障作用，被稱為隔離子（insulator）,69,4. 反義轉(zhuǎn)錄本與CpG島或啟動(dòng)子的甲基化聯(lián)合作用機(jī)制,反義轉(zhuǎn)錄本一般父系表達(dá) (母系中印記沉默) 起源于正義基因內(nèi)的內(nèi)含子序列，啟動(dòng)子可能與正義的基因重疊 調(diào)控正義基因的表達(dá): (1) promoter

24、 exclusion; (2) 改變DNA甲基化或染色質(zhì)結(jié)構(gòu); (3) RNAi機(jī)制；(4) 沉默不重疊的基因等,印記的判讀機(jī)制,70,70,X染色體失活,1961年M.F.Lyon就提出了關(guān)于雌性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的兩條X染色體中會(huì)有一條發(fā)生隨機(jī)失活的假說，并認(rèn)為這是一種基因劑量補(bǔ)償?shù)臋C(jī)制。以后的研究表明在給定的體細(xì)胞有絲分裂譜系中，有一條X染色體是完全失活并呈異染色質(zhì)狀態(tài)，而在另一個(gè)細(xì)胞譜系中同一條X染色體又可以是活化的且呈常染色質(zhì)狀態(tài)。,71,1996年G.D.Penny等發(fā)現(xiàn)X染色體的Xq13.3區(qū)段有一個(gè)X失活中心( X-inaction center，Xic)，X-失活從Xic區(qū)段開始啟動(dòng)，然后擴(kuò)展到整條染色體。,72,受精卵的發(fā)育過程中，Xp在所有早期胚胎細(xì)胞中失活，之后在內(nèi)細(xì)胞群中選擇性的恢復(fù)活性，最后父本、母本X染色體隨機(jī)失活。,73,1.X染色體失活（起始階段）,兩條染色體都表達(dá)不穩(wěn)定的Xist RNA,74,2.X染色體失活（進(jìn)展階段）,其中一