1、,第二章 心肌電生理學研究方法,Methodology of Myocardium Electrophysiological Research,電生理學技術的發(fā)展,1825年 電流計發(fā)明與應用,1922年 電子管放大器和陰極射線示波器問世,20世紀40年代 微電極技術產生 動作電位的鈉學說 20世紀50年代 電壓鉗技術產生,20世紀70年代 膜片鉗技術,謝靈頓 ( Sherrington) （1857-1952） 英國神經生物學家。 發(fā)現中樞神經反射活動規(guī)律,艾德里安 (Adrian ) （1889-1977） 英國生理學家。 闡明動作電位及其傳導規(guī)律,1932年獲諾貝爾獎,厄蘭格 (Erla

2、nger) （1874-1965） （美） 兩人合作發(fā)明了陰極示波器，并研究了神經纖維的功能,加塞 (Gasser ) （1888-1963） （美）,1944年獲諾貝爾獎,Bernstein膜學說 1902年，Bernstein提出生物電發(fā)生的膜學說： “神經或肌肉的細胞膜只對鉀離子有特殊的通透性，而對較大的陽離子和陰離子則均無通透性，因此由于細胞內外鉀離子分布不均勻，在膜兩側就形成一個電位差，此即靜息電位，神經沖動到來時，膜變?yōu)闊o選擇通透的膜，靜息電位消失，動作電位因而產生?！?離子學說（動作電位的鈉學說） 1940年前后，由于Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨軸突上發(fā)現動作電位大于靜

3、息電位的事實，Bernstein膜學說受到了有力的打擊。以后的研究證實， Bernstein膜學說對于離子通透性的假設是不正確的。其被后來的離子學說（鈉學說）所代替。,Eccles,1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和Sakmann首次 在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到乙酰膽堿（Acetylcholine, ACh）激活的單通道離子電流，從而產生了膜片鉗技術（patch clamp technique）； 1980年Sigworth等獲得10-100G的高阻封接（Gigaseal），1981年Hamill和Neher等對該技術進行了改進，引進了全細胞記錄技術，從而使該

4、技術更趨完善； 1983年10月，Single-Channel Recording一書的問世，奠定了膜片鉗技術的里程碑。,Neher Sakmann （1944-） （1942-） （德國細胞生理學家） （德國細胞生理學家） 合作發(fā)明了膜片鉗技術，并應用這一技術首次證實了細胞膜存在離子通道。這一成果對于研究細胞功能的調控至關重要，可揭示神經系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等多種疾病的發(fā)病機理，并提供治療的新途徑。 二人共獲1991年諾貝爾獎。,內爾在實驗室進行膜片箝研究工作,1983年10月第一版 Single-Channel Recording 封面,電生理獲醫(yī)學諾貝爾獎名單（截止到200

5、2年）,第一節(jié) 常規(guī)心肌電生理研究技術,在常規(guī)心肌電生理研究中，主要是采用玻璃微電極插入在體或離體心肌細胞內，記錄心肌細胞的跨膜電活動，并研究各種因素對其電活動的影響。,一、常用電生理儀器,刺激系統(tǒng)（刺激器等） 檢測系統(tǒng)（電極、換能器） 放大系統(tǒng)（前置、后置放大器） 記錄顯示系統(tǒng)(示波器、記錄儀、 計算機）,1.電子刺激器（Electronic stimulator）,電刺激不易損傷組織，又能定量而準確地重復使用。方波（矩形波，square wave）的幅度、波寬和頻率都可分別進行調節(jié)，所以矩形波電子刺激器可作為理想的刺激源。,SEN-7203,方波刺激脈沖的參數要求：,（1） 幅度（強度，a

6、mplitude）,矩形脈沖電壓的最大瞬時值,（2） 波寬（刺激持續(xù)時間 time）,（3）頻率（frequency）,一個脈沖循環(huán)所需的時間為周期，周期 的倒數（即1S內所含的周期數目）稱為頻率,（4）延遲（Delay）,從觸發(fā)脈沖到刺激方波的出現，這一段時間稱為延遲。,（5）刺激方式（Pattern of stimulation）,單刺激、連續(xù)刺激、雙脈沖刺激,（6）同步輸出（Synchronized output）,同步脈沖表示一次刺激的時間起點,（7）刺激隔離器（Isolator）,當對實驗動物同時進行刺激和記錄生物電時，刺激器輸出和放大器輸入具有公共接地線，使得一部分刺激電流流入放大

7、器的輸入端，使記錄器記錄到一個刺激電流產生的波形，即刺激偽跡。隔離器切斷了刺激電流從公共地線返回的可能，減小偽跡并與電位分開。同時，消除50周交流電感應造成的干擾。,2.微電極放大器（microelectrode amplifier）,組成：精密穩(wěn)壓電源、高輸入阻抗探頭、主放大器、電容補償電路、校正電路、低通濾波電路等,Axopatch 200B （AXON，USA）,要求：,（1）足夠高的放大能力 （2）頻率響應范圍大 0100Hz （3） 低噪聲 50uV （4） 高的辨差比（共模抑制比）1000:1 （5） 高輸入阻抗 1000M （6）低頻與高頻濾波 低頻濾波-用于變化速度快的生物電變

8、化 高頻濾波-用于減少噪聲，提高信噪比,3 示波器（oscillograph）,要求： 高靈敏度 掃描速度快 頻率高,類型：雙線示波器 多線示波器 長余輝慢掃描示波器 記憶示波器,VC-11,4 貯存和分析電生理實驗結果的儀器,（1） 示波照相機 （2） 磁帶記錄儀 （3） 電子計算機,A/D轉換- -把生物電（模擬 ）信號轉換成數字信號 D/A轉換- 把數字信號轉換成模擬信號,二 細胞外記錄（Extracellular recording）,細胞外記錄是把電極安放在心肌表面或附近引導心肌組織或細胞的電活動。,適應范圍： （1）長時間的實驗； （2）對清醒的、能自由活動的動物研究； （3）從不

9、同組織部位作同時的多導記錄； （4）研究非常小的細胞，數量多而難于 孤立起來，接觸和穿刺都易于損傷等； （5）研究器官的總的活動。,電極：,（1）玻璃微電極 （2）金屬電極 （3）離子選擇性電極 （4）單極電極 （5）多管電極,三 在體心臟電活動的細胞內記錄 （intracellular recording in situ）,實驗裝置 包括浮置式玻璃微電極、微電極推進器、微電極放大器、示波器、照相裝置、記錄儀、計算機等,推進器,微放器,示波器,監(jiān)聽器,照相機,記錄儀,計算機,打印機,微電極,心臟,動物手術 電極制作要求 插入 應用范圍 生理、藥理、心肌缺血等 優(yōu)點：在近于生理狀態(tài)下實驗，可觀察

10、整 體因素對心肌電活動的影響，可研究藥物及其代謝產物的作用過程，更有利于闡明各種調節(jié)因素、致病因素或藥物對心肌電生理特性的影響機制 缺點：記錄不持久，影響因素多,四 離體心肌電活動的細胞內記錄 （intracellular recording in vitro）,1 實驗裝置 2 微電極、標準微電極、微推進器 3 浴槽與灌流裝置 生理鹽溶液、混合氣體、攝氏3037度 4 刺激器 5 應用范圍 優(yōu)點 穩(wěn)定、長時間記錄，可任意改變溶液成分 7 觀察指標 RP , APA, APD10, APD50, APD90, Vmax,第二節(jié)：電壓鉗制技術 (Voltage clamp technique),

11、利用微電極技術，雖然記錄到細胞內的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機制，必需應用電壓鉗制技術。這一技術首先是由Cole及其同事設計，在經Hodgkin等人加以改進，用于神經電生理研究，弄清了神經纖維在興奮時離子流的情況。,一、細胞膜的生物物理特性 (Biophysical properties of cell membrane),細胞膜主要由脂質和蛋白質構成。以脂質雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質顆粒。細胞膜的電緊張及其擴布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細胞膜電纜性質(cable properties)的反映。(軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位

12、的影響起著依距離而衰減以及在時間上的延緩作用神經的“電纜”性質)。細胞膜的電纜特性從定的等效電路及其時間常數和空間常數及例證實。,(一) 細胞膜的等效電路,從電學特點上分析，細胞膜可等效地模擬為電阻電容器。它具備細胞漿電阻（縱向電阻，ri），膜電阻（橫向電阻，rm），膜電容（Cm）和膜電位（Em）四方面的電學特性，根據這四方面特性即可構成其等效電路（Equivalent Circuit）。,outside,inside,膜電位等效電路的簡化圖,Cm 膜電容 Rm 膜電阻 Em 離子平衡電位 Ro 細胞外液的縱向電阻（/cm） Ri 軸漿的縱向電阻（/cm）,Ro,Cm,Rm,Em,+,-,細胞

13、膜的等效電路是一個并聯的阻容路，膜活動時既有電壓的改變，同時又有電流的改變。電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流動。通過電容器的電流為Ic ，通過電阻的電流為Ir。,1 縱向電阻（Ro、Ri）,由胞漿的性質所決定，具有較高的電阻率，它與直徑是反比關系（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電的傳導主要沿細胞膜所包圍的容積導體進行。它是單位長度的電阻，單位是/cm ，細胞外間質的容積很大，其單位長度電阻（Ro）較Ri小。,2.橫向電阻（redial resistance）,即細胞膜本身具有的膜電阻。細胞膜由雙層鹼脂構成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。

14、膜電阻表示離子通過膜的有限能力。 膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（Rm）的大小反映了膜結構電學方面的差異。,3.膜電容（capacity）,表示膜的絕緣及儲存電荷的性質。任何一種裝置使兩個導體中間插入一個絕緣體并安排在一起，稱為電容器。細胞外液及細胞內液均為含電解質的溶液，可看作為兩個導體；細胞膜是含脂質的膜，可視作為絕緣體。細胞外液-細胞膜-細胞內液三者組成了電容。,4 膜電位 （membrane potential）,當膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流動時，就相當于在電容器上充電或放電而產生電位差，即跨膜電位。膜電位的高低決定于跨膜電化學梯度；膜電位的高低與膜兩側的電荷成

15、正比。,5 膜電流（membrane current）,任何電流都是電容電流（Ic）和電阻電流（Ii）兩種形式通過細胞膜，前者導致膜電荷的改變，后者實際上是由離子攜帶流經細胞膜的。 I m = Ic + Ii,(二) 細胞膜的時間常數（time constant）,時間常數是指膜電壓隨時間而改變的過程，用一常數表示之。它反映膜電位在細胞膜上隨時間而改變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜電容充電到63%或放電到37 %所需的時間。 = Rm Cm = 膜的時間常數 (ms）;Rm=膜電阻（k） Cm=膜電容（F）,(三) 細胞膜的空間常數（space constant）,所謂空間常數，是

16、度量電壓的空間衰減，即標志電壓依距離而衰減的程度的一個常數。,第二節(jié) 電壓鉗制技術,Voltage clamp technique,利用微電極技術，雖然記錄到細胞內的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機制，必須應用電壓鉗制技術。這一技術首先是由Cole及其同事設計，在經Hodgkin等人加以改進，用于神經電生理研究，弄清了神經纖維在興奮時離子流的情況。,一、細胞膜的生物物理特性 (Biophysical properties of cell membrane),細胞膜上以脂質雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質顆粒。細胞膜的電緊張及其擴布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等

17、都是細胞膜電纜性質(cable properties)的反映。(軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時間上的延緩作用神經的“電纜”性質)。細胞膜的電纜特性從定的等效電路及其時間常數和空間常數及例證實。,(一) 細胞膜的等效電路,從電學特點上分析，細胞膜可等效地模擬為電阻電容器。它具備細胞漿電阻（縱向電阻，ri），膜電阻（橫向電阻，rm），膜電容（Cm）和膜電位（Em）四方面的電學特性，根據這四方面特性即可構成其等效電路（Equivalent Circuit）。,outside,inside,膜電位等效電路的簡化圖,Cm 膜電容 Rm 膜電阻 Em 離子平衡

18、電位 Ro 細胞外液的縱向電阻（/cm） Ri 軸漿的縱向電阻（/cm）,Ro,Cm,Rm,Em,+,-,離子通道等效于電導,細胞膜的等效電路是一個并聯的阻容路，膜活動時既有電壓的改變，同時又有電流的改變。電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流動。通過電容器的電流為Ic ，通過電阻的電流為Ir。,1 縱向電阻（Ro、Ri）,由胞漿的性質所決定，具有較高的電阻率，它與直徑是反比關系（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電的傳導主要沿細胞膜所包圍的容積導體進行。它是單位長度的電阻，單位是/cm ，細胞外間質的容積很大，其單位長度電阻（Ro）較Ri小。,2.橫向

19、電阻（redial resistance）,即細胞膜本身具有的膜電阻。細胞膜由雙層鹼脂構成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。膜電阻表示離子通過膜的有限能力。 膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（Rm）的大小反映了膜結構電學方面的差異。,3.膜電容（capacity）,表示膜的絕緣及儲存電荷的性質。任何一種裝置使兩個導體中間插入一個絕緣體并安排在一起，稱為電容器。細胞外液及細胞內液均為含電解質的溶液，可看作為兩個導體；細胞膜是含脂質的膜，可視作為絕緣體。細胞外液-細胞膜-細胞內液三者組成了電容。,4 膜電位 （membrane potential）,當膜上離子通道開放而引起帶電離

20、子跨膜流動時，就相當于在電容器上充電或放電而產生電位差，即跨膜電位。膜電位的高低決定于跨膜電化學梯度；膜電位的高低與膜兩側的電荷成正比。,5 膜電流（membrane current）,任何電流都是電容電流（Ic）和電阻電流（Ii）兩種形式通過細胞膜，前者導致膜電荷的改變，后者實際上是由離子攜帶流經細胞膜的。 I m = Ic + Ii,(二) 細胞膜的時間常數（time constant）,時間常數是指膜電壓隨時間而改變的過程，用一常數表示之。它反映膜電位在細胞膜上隨時間而改變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜電容充電到63%或放電到37 %所需的時間。 = Rm Cm = 膜的時間

21、常數 (ms）;Rm=膜電阻（k） Cm=膜電容（F）,(三) 細胞膜的空間常數（space constant）,所謂空間常數，是度量電壓的空間衰減，即標志電壓依距離而衰減的程度的一個常數。,(一)、定義 利用負反饋原理將膜電位在空間和時間上固定于某一恒定的測定值，以研究動作電位產生過程中的離子通透性與膜電位之間的依從關系的技術。,二、電壓鉗制技術的方法原理,電壓鉗制術是利用負反饋電路，在一定時間內將跨膜電位（Transmembrane Potential， Vm），保持在某個選定的電位水平，此電位稱為保持電位（Holding potential，Vh），或者使保持電位突然變到某個特定的幅值的

22、方波電位，稱為鉗制電位（Clamping potential）或指令電位（Command potential，Vc）。,(二)電壓鉗方法,電容器電流 Ic=d（CmV）/dt,電阻器上電流 IR,流過膜的電流總量 I,dv / dt = 0,所有的電流將都是流過膜電阻的，這種電流將能反映離子的流動。,電壓鉗技術的基本原理 電壓源（SG）使膜電位固定在特定的水平，并以放大器（AV）記錄，該放大器與一個反饋放大器（AFB）連接，這一反饋電流通過膜，正好抵消因加電壓而引起的離子電流，通過電流監(jiān)視器測量電流。,（三）電壓鉗技術的優(yōu)缺點：,很容易將膜電容電流與離子電流分開； 可將膜電流分成不同的成分一I

23、Na、IK、 Ica 等（在灌流液中加入或去除某種離子） 能精確反映由離子通道的開放和關閉，引起的膜電導的改變，能把離子通透性變化的時間關系加以描述。 能分析離子通透性變化與膜電位的關系，在研究電壓調節(jié)通道的行為方面有很大價值。,1 優(yōu)點,必須在細胞內插入兩個電極，對細胞損傷很大； 對體積小的細胞，實驗難以實現； 對形態(tài)復雜的細胞，很維保持細胞膜各處電位一致； 只研究一個細胞上眾多通道的綜合活動規(guī)律，無法反映單個通道活動的特點。,2 缺點 :,蛙坐骨神經元單個Ranvier結的電壓鉗記錄,（四）幾種電壓鉗方法 雙微電極法 單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap ）法 雙蔗糖間隙（Dou

24、ble Sucrose Gap）法,第三節(jié) 膜片鉗制技術,膜片鉗制技術（patch clamp technique)是對一塊單獨的細胞膜片（或整個細胞）的電位進行鉗制的一項電生理技術。 通過對膜電位的鉗制可以觀察通過離子通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電壓的恒定而測出這種電流。運用膜片鉗技術記到的最小電流可達到pA級(10-12 A)。,一 基本原理,膜片鉗的本質屬于電壓鉗范疇，其基本工作原理是：采用經典的負反饋放大技術作電壓固定，但改用細胞外微吸管作電極，將微電極管尖端與細胞膜表面接觸，經負壓抽吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值高達10-100千歐（即G=109）。只有在這種封接存在

25、時，通過膜電極引導記錄的電流才是通過該膜的離子通道電流。,膜片鉗技術原理示意圖 Rs是膜片阻抗相串聯的局部串聯電阻（輸入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常為15M，如果Rseal高達10G（1010）以上時，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可為在IV轉換器（點線）內的高阻抗負反饋電阻(Rf)的電壓降而被檢測出。,膜片鉗與電壓鉗的區(qū)別 膜電位鉗制的方法不同； 電位固定的細胞面積不同； 研究的離子通道數目不同；,(1) 測量部分： (2) 串聯電阻補償部分： (3) 電容補償部分： (4) 指令信號控制部分： (5) 電源部分：,膜片鉗放大器主要組成:,電極電流監(jiān)視器、

26、靈敏度開關、濾波器開關、方式選擇開關 。,用于校正全細胞記錄時，由于電極和細胞內之間的通路電阻所造成的膜電位誤差 。,用來補償電壓突然改變 時引起的電容電流 。,將一定的電壓加入到刺激信號中，形成一指令信號的保持電壓。進行電壓鉗制時，它決定膜電位值，作電流鉗制時，則決定電流值 。,提供放大器各部分的電源 。,拉并暴露于空氣中,四種經典記錄模式 (Cell-attached or On cell mode),細胞貼附式膜片（cell-attached patch）,優(yōu)點：不破壞細胞的完整性，不需要胞內灌流，不影響細胞質且調制系統(tǒng)完整。可研究通過細胞對單通道的調制，也可在正常離子環(huán)境中研究遞質和電

27、壓激活的單通道活動。,缺點： 不能改變細胞內成分，也不能精確測定膜電位。同時由于許多細胞膜上存在有牽張激活的離子通道，細胞膜與電極間輕微的張力變化往往會增加記錄的背景噪聲。,由于細胞牢固貼附于微管電極的尖端而得名。它可用于記錄各種細胞的單通道電流，而且是在細胞完整無損的狀態(tài)下研究通道的活動。,貼附式記錄（ Cell-attached recording）,內面向外式膜片 (inside-out patch),細胞貼附式膜片形后，提起電極時，與電極尖端相接的細胞膜被撕脫下來開成小泡，將電極尖端在空氣中暴露幾秒鐘后小泡很快破裂，形成胞漿側向外的內面向外式膜片。,特點：較易改變細胞內的離子或物質濃度

28、，也能把酶等直接加入膜的內側面，適宜研究胞內物質對通道活動的影響。但實驗中改變膜外側物質困難，且需侵入低鈣液中，以免小泡形成。,應用：可研究胞內信使物質cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等對受體型通道的調節(jié)，以及胞內激素對通道的調節(jié)。這種方式可使通道與細胞的調節(jié)機制脫耦聯，使第二信使直接作用于膜內，引起通道開閉。,內面向外記錄（Inside-out recording）,外面向外式膜片(outside out patch),細胞貼附式膜片形成后，向微管電極內給予較強的負壓將膜片吸破，再將電極從細胞膜上拔起，但不暴露于空氣中，被撕脫下來的膜便形成外面向外式膜片。,優(yōu)點： 缺點：

29、應用：,可以任意改變胞外物質的濃度，有利于研究遞質對膜離子通道外側面的作用。,實驗中難以改變胞內成分，電極管必須充以低鈣溶液以防小泡形成。,可研究腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶C等活性變化，以及細胞膜上信使物質二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等對受體型的離子通道研究。,外面向外記錄（Outside-out recording）,全細胞記錄構型 (whole cell recording) 記錄的電流屬于宏觀電（macroscopical current），是整個細胞離子通道活動形成的總和電流。若采用膜片鉗放大器內的電流鉗模式，還可以記錄細胞的靜息電位和動作電位。 特點： 電極管內與細胞之間彌散交

30、換與平衡快，因而容易控制細胞內液的成分；記錄的是許多通道的綜合電流，需改變內部介質以分離電流；適合于對小細胞的電壓鉗位，對直徑大于30m的細胞很難實現鉗制；該方法使電生理研究的重點從無脊椎動物大細胞中解脫出來，而向人類和哺乳類細胞發(fā)展。,全細胞記錄（Whole-cell recording）,膜片鉗制技術記錄方式,穿孔膜片記錄技術 （perforated patch recording technique）,Hom和Marty于1988年首次建立了一種對傳統(tǒng)全細胞記錄法改進的方法，該方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），兩性霉素B（Amphotericin B）等具有在生物膜上形

31、成通透性孔道的特性，將這類抗生素充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使電極液與細胞內液在電學上相通，因而稱作穿孔膜片記錄技術。,穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式 （Perforated patch and perforated vesicle mode）,制霉菌素 形成的孔道,電極,受體,離子通道,提起電極,胞漿,穿孔囊泡 (外面向外式),穿孔膜片 (緩慢全細胞式),技術的優(yōu)缺點,優(yōu)點：與全細胞記錄相比，該技術相比有如下優(yōu)點, 由抗生素形成的孔道對于等于或大于葡萄糖的分子均不能通過。因此，在全細胞記錄時可避免對胞內重要物質的滲析影響，通道電流衰減現象顯著減慢，那些對細胞內通訊及通道調控具有重要作用的

32、第二信使物質仍可正常運行。, 因抗生素形成的孔道對多價離子不通透，故胞內的這些離子的濃度就不受電極液的影響。因此可在全細胞電流記錄的同時用Ca2+染料測定胞內游離的Ca2+水平, 對細胞的損傷作用明顯小于微電極細胞內記 錄及膜片鉗全細胞記錄，記錄時間可持續(xù)3小時。 高阻封接不易被破壞，而全細胞記錄的負壓脈動式抽吸和電壓脈沖易致高阻封接破壞。 電極串聯電阻較低，膜電容更易補償。,缺點：, 無法使電極液中的大分子與胞內物質交換。因此研究大分子物質對胞內機制的作用就不能進行。 由于電極液與胞內液之間存在Donnan平衡，因此電極液內必須有與細胞內相同濃度的不通透陰離子和Cl-，否則將導致Cl-流出或

33、流入細胞，使陰離子和水重新平衡，最終導致細胞體液變化。 穿孔所需時間較全細胞法長。,濃度鉗（concentration clamp）,用改變灌流液的方法來改變細胞內液或外液中某種化學成分和濃度。人工地控制膜內或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變某種化學物質的濃度，這種技術就是濃度鉗，也稱為化學鉗（chemical clamip）,或稱濃度跳變(concentration jump)。,人工脂膜的膜電流記錄,把構成細胞膜的脂質分子散布于水表面時，很容易形成親水端向下脂質單分子層，將單分子層背靠背地折疊起來，就形成類似細胞膜結構的人工脂質雙層。純的脂質雙層幾乎是絕緣的，但是將含有通道蛋白的脂質小

34、泡融入人工脂膜或將水溶性通道蛋白直接插入人工脂質雙層，便可利用膜片鉗技術記錄到單通道電流。,三 膜片鉗記錄的基本步驟,（一）、液體配制 主要根據研究通道的不同，所用細胞的不同，配制相應的液體，基本原則是保持2個平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。,（二）、標本制備 膜片鉗實驗一般是在單個細胞上進行。實驗用單細胞主要來自培養(yǎng)細胞或急性酶分離的細胞，也可來自腦片細胞中的原位細胞。常用的酶是膠原酶和蛋白酶，單獨或聯合使用，有些組織還要加用其它酶，如彈性纖維酶等。,豚鼠心室肌細胞急性酶分離方法 腸系膜動脈平滑肌細胞分離,（三）、微管電極的制備,一般采用常規(guī)二步法

35、完成，電極尖端直徑在12m之間，拋光與涂布液體硅酮樹酯后，充灌電極液。,1、微管電極拉制 2、電極熱拋光 3、緣樹脂涂抹 4、電極液充灌,（四）、高阻抗封接形成,1在恒溫條件下，將細胞貼壁良好的載玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以盡量減少電極進入浴液的深度，從而減少浮游電容； 2倒置相差顯微鏡下選擇立體感強、活性好的細胞進行實驗； 3使用新拉制的微管電極，用細塑料管以反充灌方式灌電極液入電極尖端，若含有氣泡，可手持微電極使其尖端朝下，用手指敲彈幾下管壁即可排除，然后再將微電極安裝在探頭上。,4 當微管電極在微推進器幫助下進入浴液時，用注射器向電極施加一正壓（12cmH2O），以防液氣表面

36、顆粒堵塞微管電極尖端；調節(jié)放大器上pipette offset旋鈕，將電極電壓補償到零。同時由膜片鉗放大器向微管電極發(fā)放電壓為5mV、波寬40ms的方波脈沖信號，用于觀察封接過程；,5微推進器將微管電極送入到即將接觸細胞時，撤去正壓，并繼續(xù)向選定的細胞表面推進，當電極尖端輕觸到細胞表面時其應答電流變小，這時只要給微管電極尖端管腔內施加一負壓（1020cm H2O），若在計算機屏幕上看到應變電流突然下降至零，電流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細胞形成近似電絕緣，其阻抗約10100G，說明高阻抗封接（giga seal）形成，這時的膜片為細胞貼附式膜片。在此基礎上，根據不同的實驗要求，再制成不

37、同類型的膜片構型。,保證高阻封接要點： 電極電阻適當； 電極尖端清潔； 負壓抽吸系統(tǒng)密閉； 電極與細胞相貼適度； 細胞膜清潔，活性好。,膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖,（五）、數據采集與分析,實驗中通道電流信號經膜片鉗放大器放大后再經12位A/D、D/A轉換器輸入計算機用于電流信號采集，系統(tǒng)連接如下圖所示：,分析的內容有：,1、宏觀電流的分析,宏觀電流（macroscopical current）是指膜上許多通道同時開放形成的離子電流，是由許多單通道電流總和形成的。應用電壓鉗技術在單細胞或多細胞標本上記錄的電流和膜片鉗全細胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。,（1）、通道的藥理學特性,通道的藥理學特性是通道分

38、類的重要依據，許多通道具有特異性阻滯劑和激動劑（或開放劑）。 TTX鈉通道特異性阻滯劑， TEA鉀通道特異性阻滯劑， CromakailmATP敏感鉀通道特異性開放劑 利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確認通道的種類。,（2）、通道的門控特性,通道的門控性主要是指電壓門控通道的激活與失活對電壓和時間的依賴性。典型的電壓門控通道的活動包括激活過程和失活過程。,鈉通道門控的H-H模型,（3）、通道的電流電壓關系,利用通道的電流電壓關系（current-voltage relationship, 簡稱I-V曲線）可分析通道的整流特性和離子選擇性。,、通道整流特性的分析 通道I-V關系曲線與橫坐標的

39、交點是該通道電流的反轉電位Vrev或稱零電流電位。通道的整流特性則是指通道電流對膜電位的依賴性，通?？捎肐-V關系予以判斷。,通道的電流電壓關系曲線,整流（Rectification） 電流和電壓的關系不滿足歐姆定律的直線關系。原因是離子通道的開放導致膜電阻發(fā)生了變化。,離子通道不開放時 膜的被動反應,離子通道開放時 膜的主動反應,外向整流 隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向Y軸（電流軸）靠近。如IK電流。 內向整流 隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向X軸（電壓軸）靠近。如煙堿電流。,IK電流的外向整流,煙堿電流的內向整流,去極化方向,去極化方向,、通道離子選擇性的分析 如果通道的離子選擇性很高，只能或主要