1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,1、重組質(zhì)粒的鑒定 當質(zhì)粒的重組或其他載體重組后，通常會發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗，包括質(zhì)粒的本身環(huán)化。因而要求進行篩選，把重組成功的質(zhì)粒找出來。 在目前常用的質(zhì)粒和其他載體中含有相應的抗生素抗性基因，若重組成功，或不含質(zhì)粒的自身環(huán)化，抗生素抗性基因表達，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抵抗相應抗生素的能力，可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長傳代。若重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。 2、為擴增質(zhì)粒和其他載體作準備 由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min，而且常用質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中增殖達到幾百個拷貝。因此，通過對轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短時間內(nèi)極大的擴增

2、目的質(zhì)粒。,一、實驗目的,二、實驗原理,通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細菌。這些細菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒，產(chǎn)生51062107個轉(zhuǎn)化的菌落。 當質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后，質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面，在42時，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質(zhì)?？赏ㄟ^大腸桿菌細胞膜上形成的空隙進入菌體內(nèi)。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37振動培養(yǎng)可使細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。,三、實驗流程：,滅活物/質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑菌,搖菌,菌液PCR,四、實驗方法-凍融法,連接產(chǎn)物滅活70，

3、10min,（冰上解凍）大腸桿菌感受態(tài)細胞50l、滅火物10l,混合物，冰上放置30min,42,90sec,冰上2min,加入1000ulLB液體（無抗）,37，振蕩1h,離心10000rpm,1min,RT,去上清800l,留下200l上清于1.5ul離心管中重懸,涂板,37恒溫箱，倒置培養(yǎng)12h(時間不得超過20h),1、無菌落，失敗，或培養(yǎng)條件不充分。 2、菌落布滿如苔樣，失敗，可能是抗生素濃度不夠或失效。 3、菌落布滿，抗生素濃度太高，失敗。 4、出現(xiàn)菌落，符合要求。,（1）,（2）,（3）,（4）,五、結(jié)果分析和失敗原因,（1）有菌落，說明轉(zhuǎn)化成功，但有兩種可能性：其一，質(zhì)粒自身環(huán)

4、化；其二，重組成功。 （2）無菌落，說明實驗沒成功。 （3）菌落布滿如苔樣，可能是抗生素濃度不夠或失效。 （4）出現(xiàn)大菌斑，大多數(shù)是霉菌污染所致。,1、結(jié)果分析,1、平板中的抗生素部分失效，長出的克隆是雜菌。 2、倒Ka平板時，培養(yǎng)基太燙，應冷卻到50以下加Ka抗生素。 2、涂板時來回用力過大，涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過熱，或不待冷卻就涂布。 3、感受態(tài)細胞長時間處在常溫狀態(tài)，會嚴重影響其轉(zhuǎn)化，操作時動作迅速。 4、操作時動作過于劇烈，減少對細胞的機械損傷。切記感受態(tài)細胞比較嬌嫩。 5、操作過程不規(guī)范，染菌。,2、轉(zhuǎn)化失敗的原因,六、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備,（1）從LB平板上挑取新活化的E.co

5、li TOP10單菌落于50ml LB培養(yǎng)基中，37振蕩過夜； （2）將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD6000.5左右； （3）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4下4100rpm離心10min。 （4）棄掉上清,加入30ml0.1mol/L預冷的CaCl2 溶液，重懸，冰上放置15-30min后，4下4100rpm離心10min； （5）棄掉上清，加入2ml預冷的0.1mol/L的CaCl，加入無菌甘油300l，重懸混勻,冰上放置幾分鐘； （6）分裝，每管100l，液氮冷凍后,保存于-70冰箱。,七、挑菌、搖菌

6、,（1）離心管標號 （2）每個管內(nèi)吸入650l LB+Ka 抗生素 （3）用牙簽挑取單個菌 （4）搖床上搖菌（時間大于8h）,準備：離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素,八、藍白斑篩選原理,藍白斑篩選-篩選重組子：根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補、抗生素基因等。 現(xiàn)在許多載體都含有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS）。 受體菌則含編碼-半乳糖苷酶C端aa的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有-半乳糖苷酶表達，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）培養(yǎng)基中形成藍色菌落。 而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。,藍白斑篩選： （1）未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長； （2）轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長成藍色菌落； （3）轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。,九、菌液PCR驗證,加樣： easy buffer: