1、血紅蛋白電泳檢查（電泳法）1. 原理 血紅蛋白是由兩對多肽鏈組成的復(fù)雜分子。每一條鏈含有血紅素和絡(luò)合鐵原子的卜啉。所有血紅蛋白的血紅素部分都是相同的。所測定的血紅蛋白的蛋白部分稱之為珠蛋白。正常人血紅蛋白多肽鏈包括、和。血紅蛋白的結(jié)構(gòu)、分子特性取決于形成其肽鏈的氨基酸順序和性狀。氨基酸不同可形成不同的血紅蛋白，其表面電荷不同，在電場中的泳動率不同。本實驗在堿性（PH=8.60）條件下，以瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行，對紅細(xì)胞洗滌后造成溶血，電泳分離血紅蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液體洗去。待瓊脂糖凝膠板干燥后，肉眼可直接判別有無電泳條帶異常。運用光密度掃描儀檢測準(zhǔn)確定量分析電泳條帶異常情

2、況。血紅蛋白異常有二種類型：血紅蛋白性質(zhì)或結(jié)構(gòu)的異常稱之為血紅蛋白病。血紅蛋白中的一條鏈合成減少引起血紅蛋白性質(zhì)異常，稱之為地中海貧血。2. 標(biāo)本采集2.1 標(biāo)本采集前病人準(zhǔn)備：受檢者應(yīng)空腹。2.2 標(biāo)本種類：抗凝血2.3 標(biāo)本要求：抗凝劑選用EDTA，檸檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。常規(guī)靜脈采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸櫞酸鈉溶液0.2ml的干燥。清潔試管中，充分混勻。3. 標(biāo)本儲存：儲存于2-8冰箱中，5天。4. 標(biāo)本運輸：儲存于2-8狀態(tài)下的冰壺或泡沫箱密封運輸。5. 標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌污染、溶血或脂血標(biāo)本不能作測定。6. 試劑6.1 試劑名稱：血紅蛋白電泳檢查試劑6.2 試

3、劑生產(chǎn)廠家：法國Sebia公司6.3 包裝規(guī)格：150tests6.4 試劑盒組成瓊脂糖凝膠 10塊 溶血素 1瓶緩沖液條帶 10包2條 薄濾紙 110張氨基黑（濃縮液）1瓶100ml 點樣模具濾紙 10條1盒6.5 試劑儲存條件及有效期：貯存于室溫（1530）或冰箱（28），不能冷凍。有效期兩年。7. 儀器設(shè)備7.1 儀器名稱：SEBIA電泳儀7.2 儀器廠家：法國Sebia公司7.3 儀器型號：HYDRASYS8. 操作步驟8.1 血紅蛋白液制作：抗凝血離心，5000rpm，5分鐘，去掉血漿，用10倍體積的生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，若紅細(xì)胞體積小于10ul，需特別小心。取10ul紅細(xì)胞加入1

4、30ul溶血液造成溶血。震蕩混勻10秒鐘，室溫下培育5分鐘待測。8.2 啟動電泳儀8.3 將加樣器放在一平板上，有數(shù)字的一端向上。各加樣孔加入10ul溶血的樣品，2分鐘內(nèi)加樣完畢。將加樣器放入保濕盒內(nèi)，齒端向上（轉(zhuǎn)運時用塑料齒保護(hù)架）。等待5分鐘，使樣品擴(kuò)散至齒端。打開電泳儀蓋，抬起電極和加樣器支架。8.4 使用HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE時選擇儀器的“HBTOTAL”程序（位于鏈盤左側(cè)）。8.5 從包裝袋內(nèi)取出緩沖條，拿出末端的塑料片，將緩沖條兩端塑料片固定在電極支架背側(cè)的釘上，塑料片應(yīng)緊貼支架。8.6 取出凝膠板。將薄的濾紙輕輕吸去凝膠板表面的多余液體，然后立即丟棄濾紙

5、。在電泳儀溫度控制板表面的邊線內(nèi)加200ul蒸餾水或去離子水。凝膠面朝上，放置凝膠板，邊緣對齊邊線。略略將凝膠彎曲，然后放平，使水均勻分布在凝膠板下面而不含氣泡。8.7 降低支架，使緩沖條不接觸到凝膠板。8.8 從保溫盒里取出加樣器。取時拿保護(hù)框。折斷加樣器齒端保護(hù)框。將加樣器放在4號位置。8.9 關(guān)上電泳儀蓋子，按下鍵盤左側(cè)的綠色箭頭“START”鍵，電泳開始。8.10 凝膠染色掃描8.10.1 打開蓋子8.10.2 取出并丟棄加樣器8.10.3 升高兩個支架，握住塑料端取出并丟棄緩沖條。8.10.4 打開凝膠托架，平放，將干燥的凝膠片放入兩層間，然后關(guān)上托架。8.10.5 將凝膠支架放入染

6、色池8.10.6 取出凝膠支架，打開蓋子，取出干燥的凝膠片。8.10.7 在光密度儀的570nm處或以黃色濾光片掃描測定。使用HYDRYS，DVSE或PREFERENCE光密度儀時，使A2片段的標(biāo)記置于掃描板5mm的標(biāo)志處。9. 結(jié)果判斷與參考范圍 掃描得到的只是每種血紅蛋白條帶的相對濃度值。取出膠片后，首先清潔膠片的背面。判斷溶血液的濃度是否合適，主要看基質(zhì)帶的濃度，如基質(zhì)帶濃度過淡，說明溶血液的濃度太淡。正常時A2濃度大約為基質(zhì)帶濃度的1-2倍。半歲-成人:HbA94.5,HbF2.0,HbA23.51個月：HbA 12-40,HbF 60-93,HbA2 0.1-1.06個月：HbA 8

7、6-98,HbF 0.84-10.7,HbA2 0.87-2.9臍帶血：HbA 4-40,HbF 30-96,HbA21.010. 質(zhì)量控制 建議測定每一批樣本時都附有一控制品或含有血紅蛋白A,F,C和S的血樣本。11. 臨床意義11.1 檢測-地中海貧血11.1.1 輕型：HbA2輕度升高，大多在4-811.1.2 中間型：HbA1A2缺如，HbF可達(dá)1011.1.3 重型：HbF：30-90，HbA多低于40或甚至011.2 檢測-地中海貧血11.2.1 標(biāo)準(zhǔn)型-地中海貧血：新生兒期HbBarts可達(dá)5-15，幾個月后消失。經(jīng)煌焦油藍(lán)溫育后，少數(shù)紅細(xì)胞內(nèi)有H包涵體。血紅蛋白電泳無異常發(fā)現(xiàn)。

8、11.2.2 血紅蛋白H?。篐bH在PH8.6或8.8電泳時，向陽極方向移動，泳速快于HbA;在PH6.5電泳時，仍向陽極方向移動。11.2.3 血紅蛋白Bart胎兒水腫綜合癥：Hb Barts占80-100，可有少量HbH。HbA、A2及F均缺如。11.3 檢測血紅蛋白?。阂鹋R床注意的異常血紅蛋白有四種：S，C，E和D。11.3.1 血紅蛋白S：在堿性緩沖條件下血紅蛋白S的條帶位于A和A2片段之間11.3.2 血紅蛋白C：在堿性緩沖條件下血紅蛋白C，E和A2的條帶重疊在一起。若這一片段15，應(yīng)懷疑有血紅蛋白C或E的異常。11.3.3 血紅蛋白E：與血紅蛋白C不同的是，E在酸性凝膠電泳中不與

9、A2分離。11.3.4 血紅蛋白D：在堿性緩沖條件下，血紅蛋白D和S的條帶重疊在一起，但D在酸性凝膠電泳中不與A2分離。12. 操作性能：靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便，重復(fù)性好。13. 注意事項：13.1 試劑貯存于室溫（1530）或冰箱（28）內(nèi)，不能冷凍。13.2 不要應(yīng)用溶血標(biāo)本13.3 若檢測到異常血紅蛋白，而又與常見的異常血紅蛋白S,C,D或E不同，可使用其他方法（如球蛋白鏈電泳）檢測，或求助于有關(guān)專門實驗室。13.4 HbF小于全部血紅蛋白的2-3時，掃描檢測HbF（或其它一些較少見的血紅蛋白）只是半定量的，結(jié)果不十分準(zhǔn)確。13.5 對于中度或重度貧血的病例，點樣量應(yīng)增大為15ul或20ul，其結(jié)果不受影響。13.6 電泳過程中不能打開蓋子。在染色脫色以及干燥過程中，儀器的一些程序處于鎖定狀態(tài)。13.7 最后染色后立即掃描測定。若欲保存，可用一保護(hù)物覆蓋后置于干燥、暗處，避免受熱，可保存約3個月。臨床意義 (1)Hb