1、第四章 抗體制藥專題,第一節(jié) 抗體結構與治療作用 抗體結構,抗原 一類能刺激人或動物產生抗體或致敏淋巴細胞，并能在體內和體外特異性反應的物質。 抗體 抗原刺激人體或動物體的B細胞，由B細胞轉化成漿細胞所產生的具有特異性的免疫球蛋白。 抗體功能區(qū)： VH+VL特異的抗原結合部位。 CL+CH1有L鏈與H鏈間S-S結合部位。 CH2補體結合位置 CH3固定組織細胞（單核、巨噬細胞等）,Fab木瓜蛋白酶水解IgG得到的兩個相同的片段，含有完整的輕鏈和重鏈的上端。與抗原結合，二價抗體 Fc木瓜蛋白酶水解IgG得到的重鏈下端。與補體結合,抗體的治療作用,1）抗腫瘤作用 2）抗感染作用 3）抗器官移植作用

2、 4）抗血栓形成 5）解毒 6）構建獨特型疫苗 7）免疫性疾病及其變態(tài)反應性疾病治療,分類,多克隆抗體 多種抗原決定族，多種抗體產生。 單克隆抗體 單一抗原決定族產生的均一性抗體 缺點：免疫原性，半衰期短，耙吸收差， 生產復雜，價格貴 基因工程抗體 抗體結構功能與基因重組技術結合,第二節(jié) 單克隆抗體,1975年，英國劍橋大學分子生物學研究室的Kohler和Milstein將小鼠骨髓瘤細胞與免疫小鼠脾細胞（B淋巴細胞）進行融合 后發(fā)現(xiàn)： 通過克隆化可使雜交細胞成為單純的細胞系，由此單克隆系就可以獲得結構與各種特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體（McAb）,簡單生產過程,單克隆抗體的不足,.鼠

3、源單抗能夠特異識別抗原,但是在人體中不能有效激活補體和Fc受體相關的效應系統(tǒng). .鼠源單抗用于人體時常被人免疫系統(tǒng)識別,產生人抗鼠抗體(HAMA). 外源抗體在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除.,第三節(jié) 人源化單克隆抗體,鼠單抗的人源化，是為了克服鼠源MAb的免疫原性而將其進行改造，使之和人體內的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導HAMA反應。,人源化單克隆抗體技術前景,目前進入臨床階段的人源化單克隆抗體藥物約有100個,估計占研制中的生物技術藥物的25%.美國FDA批準生產的單克隆抗體有13種. 1997年第一個用于治療淋巴瘤的人鼠嵌合型單抗Rituxan上市,該產品19

4、98-2000的銷售額分別是1.5億美元,2.6億美元,4.2億美元.增長很快.,抗體的人源化主要應考慮到兩個基本的原則：,一是應保持或提高抗體的親和力和特異性； 二是應降低或基本消除抗體的免疫原性,目前報道的人源化方法主要有:,嵌合 表面重塑(resurfacing) 重構(reshapping) 抗體功能片斷,嵌合抗體,第一代的抗體人源化是將鼠MAb的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體，由于這兩部分在空間結構上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應用時仍有較強的HAMA反應。,嵌合抗體的產品實例,1986年winter 領導的小組把嵌合體中小鼠的成分削減到5-1

5、0%.形成了人化的鼠類單克隆,接著溫特對技術加以改進,把嵌合體技術轉化為生物技術產業(yè). 1994年Eli Lilly 公司的產品Reporo是第一個獲準上市的嵌合抗體-可以通過攻擊血小板上的一種受體蛋白質靶,減少心血管病人形成血栓的危險.,嵌合抗體,從雜交瘤細胞中獲得抗體V區(qū)cDNA,克隆到重組了人抗體C區(qū)的載體中,轉化入動物細胞表達出人鼠嵌合抗體.改造后的抗體保留了原單抗特異結合的抗原V區(qū),去除了非人源序列(c區(qū)),表面重塑,通常認為,抗原上的抗原決定簇應具殘基的運動性和溶劑的可及性,多集中在抗原表面 該法的原則是僅替換與人抗體差別明顯的區(qū)域,在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎上選用與人抗體

6、表面殘基相似的氨基酸替換,重構抗體,重構抗體是由異源抗體中和抗原結合相關殘基與人抗體重新拼接構建的.通過置換三個發(fā)夾環(huán)的鼠抗體超變區(qū)(又稱互補決定區(qū),CDR),使構成抗原結合部位的輕重鏈各3個CDR區(qū)是鼠源的,其余均為人源的,抗體功能片段,Fab 片段抗體 由完整的輕鏈和重鏈（VH+CH1)組成 FV抗體 由VHVL 組成 單鏈抗體 VH Linker VL 單域抗體 VH 或VL 最小識別單位抗體 單個CDR,第三節(jié) 抗體庫與基因工程抗體技術,如何得到人抗體的目標基因？ 噬菌體抗體庫技術 (surface display phage antbody) 核糖體展示技術 轉基因/轉染色體動物技術

7、,噬菌體抗體庫技術:,用PCR擴增抗體全套V區(qū)基因,重組到噬菌體載體,并通過與單鏈噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白,使Fab或者ScFv表達在噬菌體表面,形成噬菌體抗體庫.采用親和層析將固相化抗原與抗體庫孵育,通過數(shù)次吸附-洗脫-擴增篩選出特異性噬菌體抗體,感染大腸桿菌后增殖,表達,活化,從而獲得大量特異性抗體.,構建方法:,提取B 淋巴細胞RNA,擴增V區(qū)基因,用兩種內切酶分別對純化的輕鏈PCR產物及表達載體進行雙酶切后分離純化,連接 電轉化感受態(tài)細菌并擴大培養(yǎng),提取質粒,即為輕鏈庫; 分別對經純化的重鏈PCR產物和輕鏈庫進行雙酶切,純化回收后連接,電擊轉化感受態(tài)細菌,加入輔助病毒進行培養(yǎng) 離心取

8、上清,加入PEG沉淀噬菌體顆粒,即為噬菌體抗體庫,抗體庫篩選,.將固相化抗原與抗體庫孵育,只有在其表面表達與抗原有高親和力抗體的噬菌體才能結合在抗原上 將這些噬菌體洗脫下來,轉化感受態(tài)大腸桿菌進行擴增. 將獲得的噬菌體顆粒在重復上述過程3-5次,從而使得噬菌體抗體的特異性加強,數(shù)量增加. 將最后一次富集后的噬菌體感染細菌鋪盤,挑去部分集落制備抗體,并用酶鏈免疫吸附分析鑒定,以篩選特異性噬菌體抗體.,.,Ribosome display technology,The Display CycleThe display process used by Discerna is remarkably r

9、obust and can be summarised in the following sequence of seven technically simple steps:1. Take genes encoding the protein.2. Amplify genes using standard methods.3. Produce proteins tagged with their encoding gene in vitro.4. Affinity purify proteins using an appropriate ligand or antigen.5. Amplif

10、y the genes encoding the purified proteins using standard methods.6. Clone genes and express in bacteria.7. Lyse bacteria and purify proteins for use.,DiscernArray DiscernArray technology is a combination of PCR and cell free synthesis which allows the high speed parallel synthesis of antobodies. Th

11、e final stages of the process can allow an array of antibodies to be produced. In principal the technology can be applied to any type of protein.,Features1. DiscernArray converts PCR DNA into an antobody array in 3 hours or less, with no cloning or additional protein purification. 2. DiscernArray re

12、place cloning, in vivo expression systems and purification procedures, avoiding inclusion bodies, aggregation or degradation associated with bacterial expression. 3. DiscernArray can be made in high throughput format by carrying out multiple transcription/translation reactions in parallel.,抗體庫技術,在一定

13、程度上較好的模擬了體內抗體生成的三個重要環(huán)節(jié) 1.多樣性的B 細胞群體 2,克隆選擇 3 親和力成熟,如何生產基因工程抗體？,基因工程抗體 特點：保留抗體的抗原結合能力、降低生產成本、易于大規(guī)模生產 基本原理：借助基因工程手段，將編碼Ab的基因重組到真核或原核表達載體上并進行表達。 基本的研究過程如下：,轉基因組鼠生產人類抗體？,第四節(jié) 抗體治療,抗體治療已經進入到收獲時期,全世界致力于人源化單克隆抗體開發(fā)的企業(yè)已有250家. 從目前已經上市的或者正處于臨床試驗階段的單抗臨床效果來看,許多治療用單抗是安全有效的.隨著生產單抗的新方法不斷出現(xiàn),單抗生產工藝的日趨成熟,治療用單抗的療效將大大提高,

14、毒性將越來越小,更容易被人們.許多業(yè)內人士認為將來會出現(xiàn)一個以抗體為基礎的治療新領域,抗體免疫偶聯(lián)物（Immunocojugates）,由單抗（monoclonal antibody)與彈頭藥物(warhead drug)組成 彈頭藥物: 植物毒素 微生物毒素 抗代謝類藥物 蒽環(huán)類藥物 烷基化類藥物 抗有絲分裂藥物 抗生素,直接偶聯(lián)法 （交聯(lián)劑） 間接偶聯(lián)法 （大分子載體） 毒素及大分子多肽類與單抗偶聯(lián) 保持藥物的生物活性 保持單抗對腫瘤細胞的特異性,重組免疫毒素,通過基于抗體的融合蛋白技術生產免疫毒素,抗體靶向的酶前藥治療,ADEPT: antibody directed enzyme pr

15、odrug therapy 兩步給藥系統(tǒng)： 1)應用腫瘤相關抗體與酶的偶聯(lián)物使酶在腫瘤部位聚集，并留出時間使其從血液和正常組織中清除； 2）給予前藥，使其發(fā)揮作用。,第五節(jié) 抗體酶,簡單介紹,問世：1986年，Lerner和Schultz分別在Science雜志上報道了獲得抗體酶的文章。 抗體酶 （abzyme），又稱催化抗體（catalytic enzyme），是指通過一系列化學與生物技術方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應的免疫學性質，還類似于酶，能催化某種活性的反應。 想法的由來：抗體vs酶 類似處：主要成分都是蛋白質， 酶與底物的結合 抗體與抗原的結合 本質區(qū)別： 酶與反應過

16、渡態(tài)（激發(fā)態(tài)分子）選擇結合； 抗體與基態(tài)分子的抗原特異性結合。,高度專一性,3. 酶的種類與抗體的種類簡直不可同日而語。 至今為止發(fā)現(xiàn)的酶只有幾千種； 抗體的種類則可以是無窮的。 所以，如果能將酶的催化活性賦予抗體，這將大大擴大酶的王國，是n多無法進行的或是在溫和條件下無法進行的化學反應可行，這個又何樂而不為呢？,制備,誘導法（利用免疫系統(tǒng)誘導產生抗體） 抗原性物質選擇：反應過渡態(tài)極不穩(wěn)定，因此不可能用它對動物進行免疫誘導產生抗體。不過可以合成出能穩(wěn)定存在的分子，它在帶電性能、幾何形狀等方面和過渡態(tài)分子結構極其類似，這種分子稱為過渡態(tài)類似物（transition-state analog，TS

17、A）。 免疫誘導：利用TSA作為半抗原（Hapten）和載體蛋白結合后對動物進行免疫誘導。 細胞融合：單克隆技術 由于這樣誘導產生的抗體能和TSA特異性結合，那它就極有可能催化要經過該過渡態(tài)的化學反應，因而具有催化活性。 基因工程法 主要內容：對于已經產生的單抗，分析其aa序列或基因的堿基序列，對抗體結合部位的基因進行定位突變，換上有催化作用的aa。,2. 抗體基因的組合文庫：通過PCR技術建立的基因庫存儲在噬菌體里，通過細菌培養(yǎng)表達抗體的有效片斷，將它們用于催化反應比使用老鼠雜交瘤細胞要更快更方便。 拷貝法 第一步免疫： 已知的酶 抗該酶的抗體1 第二步免疫： 抗體1 抗抗體1的抗體2 由于

18、抗原和由其誘導產生的抗體具有互補性，經過兩次拷貝后，原來酶的活性部位的信息翻錄到抗體2上，使抗體2具有催化特性。 化學修飾法 通過化學反應，在抗體結合位置或是附近引入具有催化功能的基團或是輔助基團。,催化抗體的篩選,生物學篩選法 競爭性抑制篩選法 1）抑制劑：短的過渡態(tài)類似物（STA），它包括了TSA的所有結構 特征，最大限度地省略了與底物或是產物相同的結構特征。 2）如果：單抗與STA的結合活性單抗與Hapten結合活性 則： 單抗與過渡態(tài)的結合 單抗與底物或是產物的結合 3）結論：與過渡態(tài)的強結合性說明單抗可能具有催化活性 此法快速有效，可篩選出高催化活性的抗體酶。 催化酶聯(lián)免疫吸附篩選法

19、 此法將待催化的反應與ELISA結合起來，在酶標反應板上進行。,1）將反應的底物結合到酶標反應板上； 2）將待測培養(yǎng)液上清加入反應孔中進行反應； 3）反應后，洗去上清，加入抗反應產物的抗血清， 判斷：如果孔內顯色出現(xiàn)陽性反應，則存在催化抗體； 否則則不存在有催化活性的抗體酶。 催化ELISA簡單、易操作、準確率高，關鍵在于能否制備出抗反應產物的抗體,純化學篩選法 熒光標記篩選法 化學直接篩選法 純化學的篩選只能篩選出與Hapten高結合性的抗體酶，但是這種結合卻與抗體酶的高催化活性不存在直接的關系。,存在的問題,催化活性低:一般為普通酶的1/1000 原因： 1）不可能設計出與過渡態(tài)完全一樣的

20、分子； 2）底物結合與催化之間關系的脫離； 3）產生抗體的生物過程的功能缺陷。 抗體酶存在率低； 3. 制備過程費時費事且價格昂貴；,可能的應用,在不到20年的時間里，抗體酶的研究已經成為當今前沿多學科研究的交匯點，它開辟了催化劑研究的新領域，將在醫(yī)學、化學、免疫學和制藥學等學科種發(fā)揮重要的作用。 在艾滋病治療方面 Gp-41：gp-41是HIV-1病毒一個重要的衣殼蛋白，在HIV感染人體過程中起著非常重要的作用。其上有一段相對穩(wěn)定的肽鏈序列：RGPDRPEGIEEEEGGERDRD。 抗體酶輕鏈“切割”這段特異性的肽鏈 有文獻報道稱，能制備一種抗體酶的輕鏈（不必在重鏈的參與下）可獨自專一性地催化降解gp-41那段特異性穩(wěn)定的氨基酸序列。 3. 可同樣“切割”重組gp-41蛋白，但是卻對不含那段穩(wěn)定氨基酸序列的BSA和HAS不起作用。,在戒毒方面的應用 難題： 毒品一直困擾著人類，很多人在吸毒上癮或很難戒掉， 1）直接拮抗可卡因上癮的抗體至今還沒有找到； 2）即使存在有效的抗體，由于抗體和抗原形成的復合物 后無法再生，所以必須高劑量使用