1、實(shí)習(xí)一基因組數(shù)據(jù)注釋和功能分析,陳啟昀陳 辰 丁文超 張?jiān)雒?浙江加州國際納米技術(shù)研究院（ZCNI）,課程內(nèi)容,基因組學(xué),轉(zhuǎn)錄物組學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué),系統(tǒng)生物學(xué),通過序列比對(duì)工具BLAST學(xué)習(xí)，了解蛋白編碼基因的功能注釋原理 介紹多序列聯(lián)配工具ClustalX 分子進(jìn)化分析軟件MEGA4的基本知識(shí)，掌握系統(tǒng)發(fā)生樹繪制的基本方法,課程提綱,序列比對(duì)的進(jìn)化基礎(chǔ),什么是序列比對(duì)： 將兩個(gè)或多個(gè)序列按照最佳匹配方式排列在一起。 對(duì)應(yīng)的相同或相似的符號(hào)排列在同一列上。 錯(cuò)配與突變相應(yīng)，空位與插入或缺失對(duì)應(yīng)。 序列比對(duì)的目的： 從核酸以及氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，以推測他們的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化上

2、的聯(lián)系 通過判斷兩個(gè)序列之間的相似性來判定兩者是否具有同源性 相似性：可以被數(shù)量化，如：序列之間相似部分的百分比 同源性：質(zhì)的判斷，兩個(gè)基因在進(jìn)化上是否曾有共同祖先的推斷,BLAST,基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool) NCBI上BLAST服務(wù)的網(wǎng)址： /blast/ NCBI上BLAST程序的下載： /blast/executables/release/ NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫下載網(wǎng)址： ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.

3、gov/blast/db/,選擇物種,選擇blast程序,QuerySequence,AminoacidSequence,DNASequence,tBLASTx,BLASTx,BLASTn,tBLASTn,BLASTp,Nucleotide Database,Protein Database,Nucleotide Database,Nucleotide Database,Protein Database,Translated,Translated,Translated,以Blastx為例：,目標(biāo)序列為ATG AGT ACC GCT AAA TTA GTT AAA TCA AAA GCG ACC

4、 AAT CTG CTT TAT ACC CGC,6個(gè)讀碼框翻譯,5端到3端 第一位起始： ATG AGT ACC GCT AAA TTA GTT AAA TCA AAA GCG ACC AAT CTG CTT TAT ACC CGC 第二位起始： TGA GTA CCG CTA AAT TAG TTA AAT CAA AAG CGA CCA ATC TGC TTT ATA CCC GC 第三位起始： GAG TAC CGC TAA ATT AGT TAA ATC AAA AGC GAC CAA TCT GCT TTA TAC CCG C 3端到5端 第一位起始： GCG GGT ATA AA

5、G CAG ATT GGT CGC TTT TGA TTT AAC TAA TTT AGC GGT ACT CAT 第二位起始： CGG GTA TAA AGC AGA TTG GTC GCT TTT GAT TTA ACT AAT TTA GCG GTA CTC AT 第三位起始： GGG TAT AAA GCA GAT TGG TCG CTT TTG ATT TAA CTA ATT TAG CGG TAC TCA T,與核酸相關(guān)的數(shù)據(jù)庫,與蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫,選擇數(shù)據(jù)庫,序列或目標(biāo)序列的GI號(hào),以文件格式上傳,BlastN,配對(duì)與錯(cuò)配,空位罰分,BlastP,打分矩陣： PAM30 PAM

6、70 BLOSUM80 BLOSUM62 BLOSUM45,PAM模型可用于尋找蛋白質(zhì)的進(jìn)化起源，而BLOSUM模型則用于發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的保守域。,選擇打分矩陣（scoring matrix）,The PAM family Based on global alignments The PAM1 is the matrix calculated from comparisons of sequences with no more than 1% divergence. Other PAM matrices are extrapolated from PAM1.The BLOSUM family Ba

7、sed on local alignments. BLOSUM62 is a matrix calculated from comparison s of sequences with no less than 62% divergence. All BLOSUM matrices are based on observed alignments ;they are not extrapolated from comparisons of closely related proteins.,進(jìn)行比對(duì)的數(shù)據(jù)庫,圖形化結(jié)果,E值（E-value）表示僅僅因?yàn)殡S機(jī)性造成獲得這一 比對(duì)結(jié)果的可能性。這

8、一數(shù)值越接近零，發(fā)生這一事件的可能性越小。,上機(jī)實(shí)習(xí)1：網(wǎng)上運(yùn)行blastx和blastn,(NCBIblast網(wǎng)址：/BLAST/） lesson.seq.screen.Contig34 TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCCAGTTTTTTTTTTTATTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAGCGTGTGCCAATGGTCACCTGCCACACTCGCACCAGGTTGTCCGTGTAGCCAGCAAACAGAGTCTGGCCATCAGCAGACCAGGCCAGGGAGGTGCACTGGGGTGGTTCTGCCTTG

9、CTGCTGGTACTGATAACTTCTTGCTTCAGTTCATCTACAATGATCTTTCCCTCTAAATCCCAGATCTTGATGCTGGGGCCTGTGGAGCACACAGCCAGTAGCGGTTAGGGCTGAAGCACAGGGCGTTGATGATGTCCCCACCATCTAGCGTGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGAGATCCCATAACATGGCCTGGCCATCCTTGCCTCCAGAAGCACAGAGGGATCCATCTGGAGAGACAGTCACCGTGTTCAGATAGCCTGTGTGGCCAATGTGGTTGGTCTTCAGCTTGCAGTTAGCCA

10、GGTTCCATACCTTGACCAGCTTGTCCCAGCCACAGGAGACGATGATAGGGTTGCTGCTGTTGGGCGAGAAGCGGACACAAGACACCCACTCTGAGTGGCTCTCATCCTGGACAGTGTATTTGCACACACCCAGGGTATTCCATAGCTTGATGGTTTTATCTCGAGATCCAGAGACAATCTGCCGGTTGTCAGAGGAGAAGGCCACACTCAGCACATCCTTGGTATGGCCCACAAATCGCCTCGTGGTGGTGCCCGTTGTGAGATCCCAGAAGGCGCAGGGTTCCATCCCAGGAGCCTGAG

11、AGGGCAAACTGGCCATCTGAGGAGATAACCACATCACTAACAAAGTGGGAGTGACCCCGCAGAGCACGCTGTGGAATTCCATAGTTGGTCTCATCCCTGGTCAGTTTCCACATGATGATGGTCTTATCTCGAGAGGCGGAGAGGATCATGTCCGGGAACTGCGGGGTAGTAGCGATCTGGGTTACCCAGCCGTTGTGGCCCTTGAGGGTGCCACGAAGGGTCATCTGCTCAGTCATGGCGGCGGCGAGAGCGTGTTCGCTGCAGCGACGAGGATGGCACTGGATGGCTTAGAGAAACTAG

12、CACCACAGTCGACC 對(duì)contig34進(jìn)行網(wǎng)上blastn（演示）， blastx（自行操作）比對(duì),本地運(yùn)行BLAST,下載NCBI上blast程序： /blast/executables/release/ 安裝（安裝到C:） 數(shù)據(jù)庫的格式化（formatdb） 程序運(yùn)行（blastall）,登陸NCBI的FTP下載blast程序,雙擊安裝到C盤 產(chǎn)生三個(gè)文件夾 bin data doc,將數(shù)據(jù)庫文件(db)及目標(biāo)序列文件(in)保存在Blast/bin文件夾下,bin含可執(zhí)行程序(將數(shù)據(jù)庫及需要比對(duì)操作的數(shù)據(jù)放入該文件)； data

13、文件夾含打分矩陣及演示例子的序列數(shù)據(jù)信息； doc文件夾含關(guān)于各子程序的說明文檔。,本地?cái)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建,查看db文件,由fasta格式的序列組成,數(shù)據(jù)庫的格式化,formatdb命令用于數(shù)據(jù)庫的格式化： formatdb option1 option2 option3 formatdb常用參數(shù) -i database_name 需要格式化的數(shù)據(jù)庫名稱 -p TF 待格式化數(shù)據(jù)庫的序列類型 （核苷酸選F；蛋白質(zhì)選T；默認(rèn)值為T) 例：formatdb -i db -p T,對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫“db”進(jìn)行格式化,程序運(yùn)行,blastall命令用于運(yùn)行五個(gè)blast子程序: blastall option

14、1 option2 option3 *可在dos下輸入blastall查看各個(gè)參數(shù)的意義及使用 blastall常用參數(shù) 四個(gè)必需參數(shù) -p program_name,程序名，根據(jù)數(shù)據(jù)庫及搜索文件序列性質(zhì)進(jìn)行選擇； -d database_name,數(shù)據(jù)庫名稱,比對(duì)完成格式化的數(shù)據(jù)庫； -i input_file,搜索文件名稱； -o output_file,BLAST結(jié)果文件名稱； 兩個(gè)常用參數(shù) -e expectation，期待值,默認(rèn)值為10.0，可采用科學(xué)計(jì)數(shù)法來表示，如2e-5； -m alignment view options:比對(duì)顯示選項(xiàng)，其具體的說明可以用以下的比對(duì)實(shí)例說明

15、例：blastall -p blastx -d db -i in -o out -e 2e-5 -m 9 (表格顯示比對(duì)結(jié)果),采用blastx程序，將in中的序列到數(shù)據(jù)庫bd中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果以表格形式輸入到out文件,上機(jī)實(shí)習(xí)2:本地運(yùn)行blastx,進(jìn)入DOS命令行提示符狀態(tài)（“運(yùn)行”cmd） 進(jìn)入C盤“cd” 進(jìn)入包含序列數(shù)據(jù)的bin目錄下“cd blastbin” 察看目錄下內(nèi)容“dir” 格式化數(shù)據(jù)庫db“formatdb -i db -p T” 運(yùn)行blastx “blastall -p blastx -i in -d db -o out -e 2e-5 -m 9 ” 察看結(jié)果“m

16、ore out ”或在 windows下雙擊打開,輸入,數(shù)據(jù)庫類型：F/T,Blast程序 序列輸入 數(shù)據(jù)庫 結(jié)果輸出,輸入“cd”-回車 回到安裝目錄C盤,輸入“cd blastbin”-回車 到達(dá)blast程序下bin文件夾,輸入“dir”-回車 察看bin文件夾下內(nèi)容,bin文件夾下包含以.exe為后綴的程序文件以及這次實(shí)習(xí)需要用到的數(shù)據(jù)可文件“bd”和目標(biāo)序列文件“in”,輸入“more db”-回車察看db文件內(nèi)容,空格鍵翻頁 輸入“q”跳出,輸入“formatdb -i db -p T”-回車 對(duì)db數(shù)據(jù)庫進(jìn)行格式化,輸入“dir”-回車 察看bin文件夾下內(nèi)容,格式化以后產(chǎn)生的文

17、件,輸入“blastall -p blastx -i in -d db -o out -e 2e-5 -m 9” -回車 運(yùn)行blastx程序,產(chǎn)生的結(jié)果文件“out”,用”more out” 察看結(jié)果文件,不使用-m參數(shù)時(shí) 比對(duì)結(jié)果顯示序列兩兩比對(duì),用”more out” 察看結(jié)果文件,多序列比對(duì)的目的,從物種的一些分子特性出發(fā)，從而了解物種之間的生物系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系。 通過序列同源性的比較進(jìn)而了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。,多序列比對(duì)的應(yīng)用： 系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogenetic analysis) 結(jié)構(gòu)預(yù)測(structure prediction) 序列基序鑒定(seque

18、nce motif identification) 功能預(yù)測(function prediction) ClustalW/ClustalX：一種全局的多序列比對(duì)程序，可以用來繪制親緣樹，分析進(jìn)化關(guān)系。 MEGA4,ClustalW/X的運(yùn)行,本地運(yùn)行 命令行操作的Clustal W（linux & windows) 窗口化操作的ClustalX（windows） 下載頁面：ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/software/ 歐洲生物學(xué)中心（EBI）還提供了Clustal W的網(wǎng)上運(yùn)行服務(wù)（http:/www.ebi.ac.uk/clustalw),目標(biāo)序列,各種參數(shù)設(shè)定,下載Cl

19、ustalX,Jalview,結(jié)果下載,點(diǎn)擊Start Jalview打開java程序窗口,上機(jī)實(shí)習(xí)3：本地運(yùn)行ClustalX,17-RNASE1.fasta 多序列比對(duì) （Multiple Alignment）,在 C:zcni實(shí)習(xí)1Clustalx2 文件夾下，找到clustalx.exe 雙擊打開,ClustalX窗口,點(diǎn)擊File下拉菜單中 Load sequences選項(xiàng)， 打開序列文件17-RNASE1.fasta.txt,打開后的界面,點(diǎn)擊進(jìn)行多序列比對(duì),可在Alignment下拉菜單中的Alignment Parameters中設(shè)定各個(gè)參數(shù),點(diǎn)擊Alignment下拉菜單中的

20、Do Complete Alignment進(jìn)行比對(duì),比對(duì)結(jié)果 “*”、“:”、“.” 和空格依次代表改位點(diǎn)的序列一致性由高到低,MEGA4,一個(gè)關(guān)于序列分析及比較 統(tǒng)計(jì)的工具包 包含距離建樹,MP等建樹法 自動(dòng)或手動(dòng)進(jìn)行序列比對(duì)； 推斷進(jìn)化樹； 估算分子進(jìn)化率，進(jìn)行進(jìn)化假設(shè)測驗(yàn)； 聯(lián)機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索； ,MEGA4可以識(shí)別fasta格式文件 將 17-RNASE1.fasta.txt 重命名為 17-RNASE1.fasta,選擇打開方式為MEGA4，打開17-RNASE1.fasta，自動(dòng)跳出序列窗口 用ClustalW做多序列聯(lián)配,ClustalW參數(shù)設(shè)置,以.meg格式保存結(jié)果,回到MEGA主窗口 激活所保存的文件（.meg）,編輯標(biāo)注 保守區(qū)域標(biāo)注 不匹配的區(qū)域,回到MEGA4主窗口構(gòu)建進(jìn)化樹,已被激活的文件,選擇