1、2.2 動物細胞工程,生產單克隆抗體等,動物細胞工程常用的技術,動物細胞培養(yǎng),動物細胞核移植,動物細胞融合,是其他動物細胞工程技術的基礎。,為什么要進行動物細胞培養(yǎng)?,一.動物細胞培養(yǎng),如何進行細胞培養(yǎng)?,2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術,從動物機體中取出相關組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。,(一)概念,1.進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？,P44旁欄,提示：用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。胰蛋白酶作用的適宜

2、環(huán)境pH為7.28.4。多數(shù)動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.27.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細胞培養(yǎng)時的消化。,胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎？為什么？,P44尋根問底,提示：胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。,(二) 動物細胞培養(yǎng)過程,胚胎或幼齡動物的組織器官,細胞懸液,10代細胞,50代細胞,剪碎,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,洗滌、稀釋、分離,原代培養(yǎng),用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2

3、.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,比老齡動物的組織細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越強，越容易培養(yǎng)。,動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體,動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,貼壁生長 接觸抑制,10代以內，保持正常二倍體核型,傳代培養(yǎng),原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細胞株和細胞系,隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖,多細胞動物和人體的細胞都生活在內環(huán)境中，根據你所學的內環(huán)境的知識，思考以下問題： 1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物質？ 2.體外培養(yǎng)的細胞需要什么樣的環(huán)境條件？,P46討 論,充足營養(yǎng)（糖

4、、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等合成成分及血清、血漿等天然成分。）,適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無菌無毒環(huán)境,(三) 動物細胞培養(yǎng)的條件P46,1、無菌、無毒環(huán)境（無菌處理和添加抗生素目的？更換培養(yǎng)液的好處？）,2、營養(yǎng)與體內相同。合成培養(yǎng)基：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。,3、溫度和PH，3637、7.27.4）,4、氣體環(huán)境95%空氣、5%CO2-維持培養(yǎng)液PH）,植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較,P47最上面 1、大規(guī)模的生產生物制品。 2、培養(yǎng)的動物細胞作為基因工程的受體細胞。 3、檢測判斷物質的毒性。 4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細

5、胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于 等，為 及其他疾病提供理論依據。,(四) 動物細胞培養(yǎng)技術的應用,篩選抗癌藥物,治療和預防癌癥,二.動物細胞核移植技術和克隆動物,將動物的一個細胞核，移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成為一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體（克隆動物）,分 類,細胞分化程度低，恢復全能性容易,細胞分化程度高，恢復全能性不容易,(一)、 動物細胞核移植概念：,(二)、體細胞核移植的過程：,請看教材P48圖2-21,思考： 1.核移植的受體細胞是什么？處在什么時期？用此細胞作為受體細胞有什么好處？ 2.通過什么手段激活受體細胞，構建重組胚胎？,

6、M中期卵母細胞,誘導方法：物理或化學方法激活受體細胞，完成 細胞分裂和發(fā)育進程。,卵母細胞體積大，便于操作；含有營養(yǎng)物質豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)；含有激活細胞核體現(xiàn)全能性的物質。,(二)、體細胞核移植的過程：,P49討論：,1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？,為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質全部 來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在 供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將 受體細胞的遺傳物質去掉或將其破壞(P49小資料）。,培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至1050代左 右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞 遺傳物質可能會發(fā)生突變，而10代

7、以內的細胞 一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細 胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基 礎，通常采用傳代10代以內的細胞。,2.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內的細胞，想一想，這是為什么？,3.你認為用上述體細胞核移植方法生產的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？,絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有 少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵 母細胞。,此外，即便動物的遺傳基礎完全相同，但動物的 一些行為、習性的形成與所處環(huán)境有很大關系， 核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境 不會完全相同，其形成的行為、習性也不可能和 核供體動物

8、完全相同，從這一角度看，克隆動物 不會是核供體動物100%的復制。,(三)、體細胞核移植技術的應用前景：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進程,2、保護瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領域生產醫(yī)用蛋白質及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和 衰老過程；追蹤研 究疾病的發(fā)展過程 和治療疾病,閱讀課本P50頁,(四)、體細胞核移植技術存在的問題：,思考與探究,1.幼齡與老齡動物的組織細胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？,提示：細胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關系，細胞的增殖能力與供體的年齡有關，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反

9、。所以，一般來說幼年動物的組織細胞比老年動物的組織細胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細胞的分化程度越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。,思考與探究,2.動物細胞培養(yǎng)要經過脫分化的過程嗎？為什么？,動物細胞培養(yǎng)不需經過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。,3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭 名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產奶量為 30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產奶量最高新紀錄。目 前世界各國高產奶牛

10、場奶牛，年平均產奶量一般 為十幾噸，而我國奶牛產奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利用體細胞核移植技術克隆高產奶牛盧辛達嗎？請說明理由。,可以。盧辛達的產奶量很高，有高產奶的遺傳基礎，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產的遺傳基礎，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內推廣，克隆牛再與高產的公牛自然繁殖，可得到很多高產的后代，從而加快奶牛改良進程。,該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質衰退。,（2）如果將克隆高產奶牛盧辛達的任務交給你，你將如何對它進行克??？,從盧辛達耳朵（也可用

11、別的組織、器官，耳朵在活體上容易取）上剪取一小塊組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學物質激活注入了體細胞核的卵母細胞，使其完成細胞分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經同期發(fā)情處理的受體母牛體內。,4.體細胞核移植技術在研究和應用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。,研究方面：克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術效率低，克隆動物畸形率高、死亡

12、率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。 應用上：生產克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應用還有一定距離。,知識拓展,1.動物細胞培養(yǎng)技術是如何發(fā)展起來的？,1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經組織存活數(shù)周，并觀察到神經細胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動物組織體外培養(yǎng)的基礎。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴大了組織生存空間。 1951年， 厄爾 （Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomer

13、at）設計了灌流小室，使細胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技術進一步提高了細胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對組織培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動作用。此后單層培養(yǎng)成為組織培養(yǎng)普遍應用的技術。20世紀60年代后，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術開始起步，并逐步發(fā)展。20世紀80年代后，隨著基因工程和其他細胞工程技術的發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術已成為轉基因技術、生物制藥及其他許多技術的基礎，在現(xiàn)代生物技術中發(fā)揮著重要的作用。,知識拓展,2.為什么

14、動物細胞要分散成單個細胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質？,細胞原代培養(yǎng)時可以分散成單個細胞培養(yǎng)，也可以用細胞群（團）、組織塊培養(yǎng)，經傳代培養(yǎng)后，最終都為細胞培養(yǎng)。 分散成單個細胞、細胞群（團）后容易培養(yǎng)，細胞所需的營養(yǎng)容易供應，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時，內部細胞的營養(yǎng)供應和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細胞在體外長時間的生存和生長就較困難。同時，分散成單個細胞培養(yǎng)，可使得在細胞水平操作的其他技術得以實現(xiàn)。 用酶消化的是細胞間基質，細胞間基質主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，從而使細胞相互分離。,知識拓展,3.體細胞核移植技術為什么要選擇M期的卵母細胞做受體細胞？,細胞核移植技術中能用作受體細胞的通常有M期卵母細胞和受精卵（合子）。早期核移植技術中常用受精卵，后來基本上用M期卵母細胞取代了受精卵，主要因為兩者的細胞質環(huán)境不同。有人認為重組需要的因子存在于M期卵母細胞的胞質中，而在原核形成時這些因子已被降解或用光，因此，原核擴張后受精卵去核可引起胞質中重組因子缺乏。成熟促進因子（MPF）是卵母細胞細胞質中重要的胞質影響因子，MPF的活性在卵母細胞減數(shù)分裂的MI期和M期達到最高，受精