1、蛋白質(zhì)和氨基酸的測定,概述 凱氏定氮法 蛋白質(zhì)的快速測定法 氨基酸總量的測定 氨基酸的分離與測定,概述,（1）蛋白質(zhì)的生理功能及在食品中的作用 （2）食品中的蛋白質(zhì)含量 （3）蛋白質(zhì)系數(shù) （4）蛋白質(zhì)測定方法,概 述 （1）蛋白質(zhì)的生理功能及在食品中的作用 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。 人體的酸堿平衡、水平衡的維持； 遺傳信息的傳遞； 物質(zhì)的代謝及運轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。 人及動物只能從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì) 食品的重要營養(yǎng)指標(biāo)。,(2) 食品中的蛋白質(zhì)含量及測定意義,在各種不同的食品中

2、蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般說來動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉中為9.5%，兔肉為21%，雞肉為20%，牛乳為3.5%，黃魚為17.0%，帶魚為18.0%，大豆為40%，稻米為8.5%，面粉為9.9%，菠菜為2.4%，黃瓜為1.0%，桃為0.8%，柑橘為0.9%，蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右。 測定食品中蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義。,（3）蛋白質(zhì)的性質(zhì),蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，分子量很大，大部分高達(dá)數(shù)萬數(shù)百萬。 從組成上看：化學(xué)元

3、素C、H、O 、N（P、S、Cu、Fe）；它們由20種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來， 官能基團(tuán)：肽鍵、氨基酸殘基、酸堿基團(tuán)、芳香基團(tuán) 結(jié)論：含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。,不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，蛋白質(zhì)的量與氮含量的關(guān)系用蛋白質(zhì)系數(shù)表示： 蛋白質(zhì)系數(shù)每份氮素相當(dāng)于的蛋白質(zhì)的份數(shù)。一般蛋白質(zhì)含氮為16%，所以1份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)。此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，用F表示。不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，

4、牛乳及其制品為6.38。,（4）蛋白質(zhì)系數(shù),三鹿奶粉相關(guān)榮譽(yù),中國名牌產(chǎn)品，中國馳名商標(biāo)，國家免檢產(chǎn)品，綠色食品，中國食品工業(yè)百強(qiáng)，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化國家重點龍頭企業(yè)，中國最具價值的品牌，國家第一批衛(wèi)生安全食品 。,石家莊三鹿集團(tuán)股份有限公司2008年9月11日晚則發(fā)布產(chǎn)品召回聲明稱，經(jīng)公司自檢發(fā)現(xiàn)2008年8月6日前出廠的部分批次三鹿嬰幼兒奶粉受到三聚氰胺的污染，市場上大約有700噸。,三聚氰胺(melamine),是一種有機(jī)含氮雜環(huán)化合物，學(xué)名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，或稱為2,4,6-三氨基1,3,5-三嗪，簡稱三胺、蜜胺、氰尿酰胺，是一種重要的化工原料，主要用途是與醛縮合，生成三聚氰

5、胺-甲醛樹脂，生產(chǎn)塑料，這種塑料不易著火，耐水、耐熱、耐老化、耐電弧、耐化學(xué)腐蝕，有良好的絕緣性能和機(jī)械強(qiáng)度，是木材、涂料、造紙、紡織、皮革、電器等不可缺少的原料。它還可以用來做膠水和阻燃劑，部分亞洲國家，也被用來制造化肥。,三聚氰胺的最大的特點是含氮量很高（66），加之其生產(chǎn)工藝簡單、成本很低，給了摻假、造假者極大地利益驅(qū)動，有人估算在植物蛋白粉和飼料中使蛋白質(zhì)增加一個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白原料的1/5。所以“增加”產(chǎn)品的表觀蛋白質(zhì)含量是添加三聚氰胺的主要原因，三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)等也成了摻假、造假者心存僥幸的輔助原因。,化學(xué)性質(zhì),

6、三聚氰胺呈弱堿性（pKa=8），可與多種酸反應(yīng)生成三聚氰胺鹽。遇強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水溶液水解，胺基逐步被羥基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，進(jìn)一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。,毒性：,以前三聚氰胺被認(rèn)為毒性輕微，大鼠口服的半數(shù)致死量大于3克/公斤體重。據(jù)1945年的一個實驗報道：將大劑量的三聚氰胺飼喂給大鼠、兔和狗后沒有觀察到明顯的中毒現(xiàn)象。動物長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。,2007年中國徐州一家出口美國貓狗食物的企業(yè)在寵物食品中添加三聚氰胺來冒充蛋白質(zhì)導(dǎo)致中美關(guān)系軒然大波 。 寵物食品污染事件的初步調(diào)查結(jié)果認(rèn)為：摻雜了6.6%三聚氰胺的

7、小麥蛋白粉是寵物食品導(dǎo)致中毒的原因，為上述毒性輕微的結(jié)論畫上了問號。 導(dǎo)致美國大量寵物死亡，被FDA徹底封殺。（FDA，美國食品藥品管理局）。,三聚氰胺的分子式是C3H6N6，即氮含量為2/3，按GB/T 5009.5-2003，食品中蛋白質(zhì)的測定（凱氏定氮法），乳制品的蛋白氮換算系數(shù)為6.38，即1的蛋白氮含量，折算蛋白質(zhì)含量為6.38，這樣加入3三聚氰胺就蛋白含量“達(dá)標(biāo)”了。,（5）蛋白質(zhì)主要測定方法有： 雙縮脲法 染料結(jié)合法 酚試劑法 紫外分光光度法 水楊酸比色法 折光法 旋光法 近紅外光譜法 目前蛋白質(zhì)測定最常用的方法是凱氏定氮法,凱氏定氮法 是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白

8、質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量 此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量：由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物,凱氏定氮法是測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個經(jīng)典分析方法，至今仍 被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。 凱氏定氮法：常量法、微量法及改良凱氏定氮法,凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫

9、酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。 包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟。, 樣品消化： 2 NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4(NH4)2 SO4+6CO2+ 12SO2 + 16H2O 濃硫酸的作用： 脫水作用使有機(jī)物脫水并碳化為C、H、N 氧化作用將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。,加入硫酸鉀的作用是：提高溶液沸點而加快有機(jī)物的分解（3380C 4000C） K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO

10、4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。,加入硫酸銅的作用 催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。 消化完全指示：藍(lán)綠色；, 蒸餾 在消化完全的樣品溶液中加入濃氫

11、氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣 (NH4)2 SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 蒸餾時堿性反應(yīng)完全指示：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀 吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示劑，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8 X 10-10），與氨形成強(qiáng)堿弱酸鹽，酒紅色藍(lán)綠色 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O, 滴定 待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定, 藍(lán)綠色灰紅色 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 討論： 1、實驗中用到哪些試劑？作用是什么？,適用范圍：此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定 儀器、試劑: 500mL凱

12、氏燒瓶、凱氏定氮裝置 消化用： 濃硫酸 硫酸鉀 硫酸銅 蒸餾用： 40%氫氧化鈉溶液 吸收用： 4%硼酸 滴定用： HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑,微量凱氏定氮法操作步驟 樣品消化 蒸餾 吸收 滴定 樣品消化 :準(zhǔn)確稱取一定量的樣品至干燥潔凈的500mL凱氏燒瓶中，加入硫酸銅0.5g（1g）、硫酸鉀10g（3g)和濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒輕輕搖勻，以45斜支于石棉網(wǎng)上用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠(yuǎn)處)，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后加大火力(或?qū)糠旁陔姞t上)，保持瓶內(nèi)液體微沸至液體變藍(lán)綠色透明后繼續(xù)加熱微沸30min關(guān)閉電爐，取下燒

13、瓶、冷卻轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水定容。,注意問題： 加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸； 消化開始時不要用強(qiáng)火，要控制好熱源，并注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進(jìn)其消化完全； 樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化過程中產(chǎn)生大量泡沫； 消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。,思考： 1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？ 2、如何判斷消化的終點？, 蒸餾與吸收： 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性

14、，加入數(shù)粒玻璃珠。 在接受瓶中加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。 準(zhǔn)確吸取消化液10mL于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水進(jìn)行蒸餾。 指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10 min，將冷凝管尖端提離液面繼續(xù)蒸1min,蒸餾、吸收注意問題： （1）整套裝置不能漏氣，要注意各蒸汽控制夾子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。 （2）在蒸汽發(fā)生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。 （3）加堿量要足，應(yīng)使消化液呈深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。 （4）冷凝管下端先插入

15、硼酸吸收液液面以下才能蒸餾；吸收液溫度不應(yīng)超過40，若超過時可置于冷水浴中使用；蒸餾完畢后，應(yīng)先將,冷凝管下端提離液面，再蒸1分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。 （5）在每次測定前及兩次測定之間，均要洗滌反應(yīng)管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸餾水，其余同測定時的做法，在蒸汽發(fā)生器中水劇烈沸騰后，立即移開電爐，水即從吸收瓶中倒吸入反應(yīng)管，再倒吸入汽水分離管或蒸汽發(fā)生器中，打開夾子，即可放出廢水。 （6）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。, 滴定 將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.01mol/L鹽酸

16、標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。,(4) 結(jié)果計算 式中 W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L； V1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； V2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； m樣品質(zhì)量，g； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F蛋白質(zhì)系數(shù)。,思考： 1、為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入硫酸和指示劑甲基橙？ 2、為什么在每次測定前及兩次測定之間，均要洗滌反應(yīng)管？如何洗滌？,常量法 消化：同“微量法” 蒸餾與吸收： 與微量法的不同？,滴定：用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mol/L，其余同“微量法”。 3.計算：與微量法的不同？ 4.注意：同“微量法

17、”,分光光度法測定蛋白質(zhì)含量 原理：試樣與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。在pH=4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，銨與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的化合物。在波長400nm處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。 氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0g/L）：精密稱取經(jīng)105干燥的硫酸銨0.4720g，用水溶解并定容至100mL ,臨用時用水稀釋至0.1g/L,雙縮脲法： 雙縮脲的性質(zhì)：當(dāng)脲被小心地加熱至 150160時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成雙縮脲，其與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng) 測定原理：蛋白

18、質(zhì)分子中肽鍵（CONH）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，最大吸收波長為560nm。 特點：簡單快速，靈敏度低，常用于生物化學(xué)領(lǐng)域。,染料結(jié)合法： 原理：在特定的條件下，蛋白質(zhì)可與某些染料定量的反應(yīng)生成沉淀，用分光光度計測定沉淀反應(yīng)完全后剩余的染料量可計算出反應(yīng)消耗的染料量，進(jìn)而求得樣品中蛋白質(zhì)的含量。 適用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力飲料等食品。,水楊酸比色法 原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化而轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度條件下可與水楊酸和次氯酸鈉作用生成蘭色化合物，在660nm處比色測定，求出樣

19、品的含氮量，進(jìn)而計算出蛋白質(zhì)的含量。,氨基酸的測定,雙指示劑甲醛滴定法 電位滴定法 茚三酮顯色法 氨基酸的分離及測定,蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種，它們對人體有著極其重要的生理功能，常會因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。,氨基酸的含量一直是某些發(fā)酵產(chǎn)品如調(diào)味品的質(zhì)量指標(biāo)，也是目前許多保健食品的質(zhì)量指標(biāo)之一，其中的含氮量可直接測定，不同于蛋白質(zhì)的氮，故稱為氨基酸態(tài)氮。氨基酸態(tài)氮反映的是樣品中游離氨基酸的總量。,氨基酸態(tài)氮的測定,雙指示劑甲醛滴定法,電位滴定法,雙指示劑甲醛滴定法 原

20、理 氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，用間接的方法測定氨基酸的總量。,方法特點及應(yīng)用 此法簡單易行、快速方便。脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高；酪氨酸含有羥基，滴定時會消耗堿液使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果高。 特別適合淺色樣品的測定,試劑 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液 0.1%中性紅50%乙醇溶液 0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)

21、溶液,操作方法 預(yù)處理：移取含氨基酸約2030mg的樣品溶液2份 中和游離酸（用中性紅作指示劑，先測定其它游離酸的含量）：其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)?琥珀 色為終點，記錄V1 滴定氨態(tài)氮（用百里酚酞作指示劑測定氨基酸和游離酸的總含量）： 另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點，記錄V2,式中 c 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L; V1用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL; V2用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL; m測定

22、用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol,結(jié)果計算,說明及注意事項,1、此法適用于測定食品中游離的氨基酸 2、固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱取后用水萃 取， 50水浴中萃取0.5h即可。液體樣品可直接進(jìn)行測定。 3、若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進(jìn)行測定。 4、與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和-COOH 時的pH為8.59.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。,電位滴定法 原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計插入反應(yīng)體系中，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，

23、依據(jù)酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點。 儀器： 酸度計、磁力攪拌器、堿式滴定管25mL 刻度吸管：10mL,試劑： 酚酞乙醇指示液：1% 甲醛：36%-38% 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.05mol/L（標(biāo)定）,試驗步驟 吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL于燒杯中，加60mL水，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2（記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V，可計算總酸含量）。, 加入10mL甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗0.05m

24、ol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V1。 同時取80mL水，先用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，做試劑空白試驗，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V2 。,第一次滴定是除去其它游離酸，所消耗的NaOH溶液體積不用于計算氨基酸態(tài)氮，但可計算總酸含量）。 第二次滴定才是測定氨基酸，用消耗的NaOH溶液體積進(jìn)行計算。 在測定過程中加入中性甲醛的作用是什么？,式中 W-氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，%; c-氫氧化鈉濃度，mol/L； V1-加入甲醛后耗NaOH的量，mL； V2-空白試驗加甲醛后耗

25、NaOH量，mL； 0.014-氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mol； m-樣品量，g,說明 本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定 對于混濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定。 結(jié)果要求精密度10% ，即在重復(fù)條件下兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10%。,平行實驗與結(jié)果處理 平行實驗是指在相同條件下同時做兩份測定. 精密度是指同一樣品的各測定值的符合程度。 如果兩份之間相對誤差不超過允許范圍,說明該樣品的測定在精密度方面是可靠的;如果相對誤差超過允許范圍,則應(yīng)重做。在食品檢驗中,如果相對誤差沒有特殊規(guī)定,相對誤差的允許范圍一般20%,其計算方法如下: 相對誤差(%)= 式中:A、B為

26、兩次平行測定的結(jié)果。,茚三酮顯色法 原理：水合茚三酮與氨基酸反應(yīng)，水合茚三酮被還原成還原型水合茚三酮，氨基酸被氧化脫羧，產(chǎn)生醛、二氧化碳和氨。氨與水合茚三酮、還原型水合茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物(除脯氨酸外均有此反應(yīng))，該化合物的顏色深淺與氨基酸的含量成正比。 在570nm處測吸光度，用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品溶液需澄清，通常采用活性炭脫色處理。,氨基酸的分離及測定 通常采用： 氨基酸自動分析儀 氣相色譜法 液相色譜法,氨基酸自動分析儀分析,食物蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。一份水解液可

27、同時測定天冬，蘇，絲，谷，脯，甘，丙，纈，蛋，異亮，亮，酪，苯丙，組，賴和精氨酸等16種氨基酸，其最低檢出限為10pmol。,操作步驟,樣品處理：樣品采集后用勻漿機(jī)打成勻漿（或者將樣品盡量粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存，分析用時將其解凍后使用。 稱樣：準(zhǔn)確稱取一定量樣品，精確到0.0001g。均勻性好的樣品如奶粉等，使樣品蛋白質(zhì)含量在1020mg范圍內(nèi)；均勻性差的樣品如鮮肉等，為減少誤差可適當(dāng)增大稱樣量，測定前再稀釋。將稱好的樣品放于水解管中。,水解：在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸1015mL（視樣品蛋白質(zhì)含量而定），含水量高的樣品（如牛奶）可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚34 滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍35min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0psi），然后充入高純氮氣；再抽真空充氮氣，重復(fù)三次后，在充氮氣狀態(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在1101的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶內(nèi)，用去離子水定容。吸取濾液1mL于5mL容量瓶內(nèi)，用真空干燥器在4050干燥，殘留物用 12mL水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次，最后蒸干，用1mL pH2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。,測定：準(zhǔn)確吸取0.