1、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建BIOX.CN 時(shí)間：2006-9-10來(lái)源：生命經(jīng)緯分為六個(gè)階段：階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈階段2：cDNA第二鏈的合成階段3：cDNA的甲基化階段4：接頭或銜接子的連接階段5：Sepharose CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNA階段6：cDNA與噬菌體臂的連接階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈1在置于冰上的無(wú)菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進(jìn)行cDNA第一鏈的合成：poly(A)+RNA (1g/l) 10l寡核苷酸引物(1g/l) 1l1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37) 2.5l1mol/L KCl 3.5l250 mmol/L MgCl2

2、 2ldNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10l0.1 mol/L DTT 2lRNase抑制劑（選用） 25單位加H2O至 48l2當(dāng)所有反應(yīng)組在0混合后，取出2.5l反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)0.5ml微量離心管內(nèi)。在這個(gè)小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1l -32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。3大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37溫育1h。4溫育接近結(jié)束時(shí)，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1l 0.25mol/L EDTA，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70溫育10 min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。5參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版附錄8所述方法，測(cè)定0.5l小規(guī)模反應(yīng)物

3、中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過(guò)堿性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。6按下述方法計(jì)算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）： 摻入的活度值(cpm)/總活度值66(g)=合成的cDNA第一鏈(g)7盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。階段2：cDNA第二鏈的合成1將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中：10 mmol/L MgCl2 70l2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5l10 mCi/ml-32P dCTP（400 Ci/mmol） 10l1 mol/L (NH4)2SO4 1.5lRNas

4、e H (1000單位/ml) 1l大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5l溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機(jī)稍離心，以除去所有氣泡。在16溫育24h。2溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：-NAD (50 mmol/L) 1l大腸桿菌DNA連接酶(10004000單位/ml) 1l室溫溫育15min。3溫育結(jié)束，加入1l含有4種dNTP的混合物和2l T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。4取出3l反應(yīng)物，按步驟7和8描述的方法測(cè)定第二鏈DNA的質(zhì)量。5將5l 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物

5、一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過(guò)乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90l TE(pH7.6)溶液中。6將下列試劑加到DNA溶液中：10T4多核苷酸激酶緩沖液 10lT4多核苷酸激酶（3000單位/ml） 1l室溫溫育15分鐘。7測(cè)定從上面步驟4取出的3l反應(yīng)物中放射性活度，并按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版附錄8所述方法測(cè)定1l第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。8用下面公式計(jì)算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)*(66g -xg)=cDNA第二鏈合成量/gx表示cD

6、NA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的7080%9用等量酚：氯仿對(duì)含有磷酸化cDNA（來(lái)自步驟6）的反應(yīng)物進(jìn)行抽提。10 Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進(jìn)行平衡，然后通過(guò)離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。11 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來(lái)的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機(jī)上以最大速度4離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監(jiān)測(cè)儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來(lái)。12 用70%乙醇洗滌沉淀物，重復(fù)離心。13 小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

7、14 如果需要用EcoR I甲基化酶對(duì)cDNA進(jìn)行甲基化，可將cDNA溶解于80l TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29l TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。階段3：cDNA的甲基化1在cDNA樣品中加入以下試劑：2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5l5 mol/L NaCl 2l0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2l20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1l加H2O至 96l2取出兩小份樣品（各2l）至0.5ml微量離心管中，分別編為

8、1號(hào)和2號(hào)，置于冰上。3在余下的反應(yīng)混合液中加入2l EcoR I 甲基化酶（80 000單位/ml），保存在0直至步驟4完成。4再?gòu)拇篌w積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2l）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號(hào)和4號(hào)。5在所有四小份樣品（來(lái)自步驟2和步驟4）加入100 ng質(zhì)粒DNA或500 ng的噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預(yù)實(shí)驗(yàn)中用作底物以測(cè)定甲基化效率。6所有四份小樣實(shí)驗(yàn)反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37溫育1h。7于68加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一次。8在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯

9、存于-20直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。9按下述方法分析4個(gè)小樣對(duì)照反應(yīng)：a. 在每一對(duì)照反應(yīng)中分別加入：0.1 mol/L MgCl2 2l10EcoR I 緩沖液 2l加H2O至 20lb. 在2號(hào)和4號(hào)反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR I。c. 四個(gè)對(duì)照樣品于37溫育1h，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。10 微量離心機(jī)以最大速度離心15min(4)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200l 70%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。11 用手提式微型探測(cè)器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29l TE（pH8.0）。12 盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一階段。階

10、段4：接頭或銜接子的連接cDNA末端的削平1cDNA樣品于68加熱5 min。2將cDNA溶液冷卻至37并加入下列試劑：5T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液 10ldNTP溶液，每種5 mmol/L 5l加H2O至 50l3加入12單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml），37溫育15min。4加入1l 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以終止反應(yīng)。5用酚：氯仿抽提，再通過(guò)Sephadex G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。6在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L 乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4至少放置15 min。7在微量離心機(jī)上以最大速度離心15

11、min(4)，回收沉淀的cDNA。沉淀經(jīng)空氣干燥后溶于13l的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).接頭-銜接子與cDNA的連接8將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：10T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液 2l8001000 ng的磷酸化接頭或銜接子 2lT4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 1l10 mmol/L ATP 2l混勻后，在16溫育812h。9從反應(yīng)液中吸出0.5l貯存于4，其余反應(yīng)液于68加熱15min以滅活連接酶。階段5：Sepharose CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNASepharose CL-4B柱的制備1用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉

12、拭的一半推進(jìn)1ml滅菌吸管端部，用無(wú)菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過(guò)的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。2將一段無(wú)菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內(nèi)充滿緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。3在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，放開止血鉗，當(dāng)緩沖液從吸管滴落時(shí)，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基質(zhì)幾乎充滿吸管為止。4將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉

13、柱子底部的軟管。依據(jù)大小分離回收DNA5用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50l或更小），放開止血鉗，使cDNA進(jìn)入凝膠。用50l TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。6用手提式小型探測(cè)器監(jiān)測(cè)cDNA流經(jīng)柱子的進(jìn)程。放射性cDNA流到柱長(zhǎng)2/3時(shí)，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。7用切侖科夫計(jì)數(shù)器測(cè)量每管的放射性活性。8從每一管中取出一小份，以末端標(biāo)記的已知大?。?.2kb5kb）的DNA片斷作標(biāo)準(zhǔn)參照物，通過(guò)1%瓊脂凝

14、膠電泳進(jìn)行分析，將各管余下部分貯存于-20，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。9電泳后將凝膠移至一張Whatman 3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過(guò)程前20min至30min于50加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態(tài)繼續(xù)干燥12h.10 置-70加增感屏對(duì)干燥的凝膠繼續(xù)X射線曝光。11 在cDNA長(zhǎng)度500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機(jī)于4以12 000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。12 將DNA溶于總體積為20l的10 mmol/L Tris

15、-HCl(pH7.6)中。13 測(cè)定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計(jì)算可用于噬菌體臂相連接的DNA總量。選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)*2xg cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA階段6：cDNA與噬菌體臂的連接1按下述方法建立4組連接-包裝反應(yīng)：連接A(l)B(l)C(l)D(l)噬菌體DNA(0.5g/l)1.01.01.01.010T4DNA連接酶緩沖液1.01.01.01.0cDNA0 ng5 ng10 ng50 ngT4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml）0.110 mmol/L ATP1.01.01.01.0加H2O至10101010連接混合物于16培育416h。剩余的cDNA儲(chǔ)存于-20。2按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應(yīng)物中取5l包裝到噬菌體顆粒中。3包裝反應(yīng)完成后，在各反應(yīng)混合物中加入0.5ml