1、三萜皂苷類成分的抗衰老作用與質(zhì)量分析研究,一三萜皂苷的研究概況,三萜皂甙是由六個異戊二烯以頭尾相接或尾尾相接而組成，一般由含30個碳原子。按其皂甙元，可將三萜皂甙分為五環(huán)三萜(pentacylic triterpennoids)和四環(huán)三萜(tetracylic triterpennoids)兩大類。 五環(huán)三萜皂甙數(shù)目較多，又可分為七種類型：齊墩果烷(oleanane)型、羽扇豆烷(ursane)型、木栓烷(lupane)型、異B-香樹脂醇(iso-B-amyrin)型、羊齒烷(fernane)和異羊齒烷(isofernane)型、何帕烷(hopane)和異何帕烷(isohopane)型。四環(huán)三

2、萜皂甙除含有C30外，也有C31或C32的衍生物，主要有四種類型：達瑪烷(dammarane)型、羊毛脂烷(lanostane)型、大戟烷(euphane)型、葫蘆烷(cucurbitane)型。,三萜皂甙在植物界有較廣泛的分布，據(jù)報道在104科1730種植物中，含有皂甙的植物就約有79 科860 種，其中含有三萜皂甙的植物就約有627 種。 三萜皂甙在雙子葉植物中分布較為普遍，較多種的科有五加科、傘形科、夾竹桃科、菊科、石斛科、葫蘆科、大戟科、豆科、桃金娘科、遠志科、毛莨科、薔嶶科、茜草科等；單子葉植物含三萜皂甙的植物較少見，僅見于禾本科的少數(shù)屬；裸子植物及低等植物中也較少含有這類皂甙；另外

3、在海洋生物如海參、海星、海盤車等中亦有存在。,許多常見中藥中含三萜皂甙，如人參、三七、甘草、西洋參、地榆、款冬花、酸棗仁、紫菀、桔梗、柴胡、遠志、黃芪、威靈仙、商陸、白頭翁等。 皂甙類成分具多種生理活性，如刺激黏膜，已往常用作祛痰藥，如桔梗、遠志、紫菀中的皂甙等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)三萜皂甙還具有促進核酸蛋白質(zhì)合成和膽固醇脂代謝、抗炎、抗菌、抑制腫瘤、抗?jié)?、興奮或抑制中樞神經(jīng)、抑制胃液分泌以及殺死精子、軟體動物等作用。,目前對天然藥物的抗衰老作用，多從其對免疫功能、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、物質(zhì)代謝、抗衰老自由基、延長細胞和動物的壽命、抗腫瘤、強壯、延長生長期等方面的作用來評價。 而不少皂甙具有上述作用，

4、特別是三萜皂甙的活性更顯著。如人參、西洋參、三七和絞股藍等是常見具抗衰老作用的天然藥物。它們均富含三萜類達瑪烷型皂甙。,達瑪烷型皂甙除了上述活性外，在血壓、血糖等項指標上，還具有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用。這一種特性對抗衰老藥物來說頗為有益的，它可使發(fā)病失去某種平衡的機體恢復新的動態(tài)平衡，所以這類成分的研究倍受關注。 另外報道在約6科28種植物含有達瑪烷型皂甙，從中尋找出有效的抗衰老藥物是完全可能的。,二三萜皂苷抗衰老作用,A. 人參皂苷 1. 有網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能激活效果；對特異性和非特異性免疫功能有刺激作用。 2. 可提高小鼠對常壓、低壓缺氧的耐力，并可延長常溫、高溫負荷下游泳時間。 3. 有中

5、樞興奮作用，能激發(fā)人學習和記憶能力，增減智力和操作能力。 4. 具有興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)功能的作用,5. 有性腺激素樣作用；有雄性激素樣作用，能使小鼠精囊腺增重。 6. 能促進DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，使白蛋白和丙種球蛋白的含量增加。 7. 對腎上腺素高血糖的抑制作用較強。并顯示對動物血糖水平有雙向調(diào)節(jié)作用。 8. 可明顯抑制中、老年大、小鼠的脂質(zhì)過氧化作用?？裳娱L細胞生長天數(shù)。,B. 三七皂苷,1. 可顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。 2. 對未成年小鼠體重增加有明顯促進作用；可增強小鼠耐高、低溫能力。 3. 能顯著降低老年大鼠腦組織脂褐質(zhì)及血清過氧化脂質(zhì)總含量。 4

6、. 有雄性激素樣作用，能使小鼠精囊腺增重。 5. 有促進小鼠肝、腎DNA及血清蛋白質(zhì)合成的作用。 6. 可明顯抑制中、老年大、小鼠的脂質(zhì)過氧化作用。 7. 總皂苷抗血栓。,C. 西洋參皂苷,1. 能降低ACTH引起的小鼠胸腺及脾臟的萎縮。 2. 可增強機體對缺氧的耐受力，延長小鼠負重游泳時間。,D 絞股藍皂苷,1. 能明顯提高小鼠游泳的體力和耐力，并咳提高常壓缺氧的耐受力。 2. 能促進小鼠生長發(fā)育，增強小鼠耐高溫、抗疲勞的作用。 3. 能預防地塞米松引起的腎上腺皮質(zhì)激素、血漿皮質(zhì)醇減少。 4. 可預防地塞米松引起的胸腺萎縮。 5. 對喂高蔗糖、高脂的大鼠所致的高脂血癥有效。 6. 能增加自由

7、基損傷模型大鼠和老年大鼠紅細胞中SOD的活力。 7. 對肝、子宮、肺等癌細胞增生的抑制率為20%-80%；對S180有明顯的抑制作用。,E 黃芪皂苷,1. 黃芪甲苷有促進B細胞增生、分化和漿細胞抗體合成作用。 2. 黃芪甲苷、綿毛黃芪苷均可對抗CCl4所致的小鼠死亡；使小鼠紅細胞內(nèi)SOD活性升高。,F商陸皂苷,1. 商陸皂苷甲可顯著減少羊紅細胞致敏血清溶血素的含量。 2. 商陸總皂苷有對抗羥基脲所致小鼠體重下降、耐寒力低下的作用。,G酸棗仁皂苷,1. 酸棗仁總皂苷能顯著降低正常大鼠血清膽固醇和LDL-C，顯著升高HDL-C。 2. 可顯著降低高脂飼養(yǎng)大鼠的血清甘油三酯。 3. 酸棗仁皂苷B能增

8、強N神經(jīng)因子作用。,H. 龍牙楤木皂苷,1. 可使小鼠游泳時間顯著延長，增強小鼠耐缺氧、抗低溫作用。 2. 對KCN、NaNO2引起的中毒性缺氧小鼠有保護作用。,I大豆皂苷,1. 對鏈脲霉素所致糖尼尿病大鼠可降低血糖水平，提高SOD含量，降低脂質(zhì)過氧化物。 2. 對預防高脂肪食物造成的高脂血癥有作用。 3. 有降低抗腫瘤抗生素阿霉素所致心肌中過氧化脂質(zhì)的上升。,K獨一味皂苷,1. 能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)、E-花環(huán)形成率及酯酶染色陽性率。 2. 對Hepa、EC瘤株均有一定的抑制作用。,L土貝母皂苷,1. 能抑制人體早幼粒細胞白血病細胞（HL60）的生長。 2. 可使酵母多

9、糖微粒的吞噬功能明顯增加。,M柴胡皂苷,1. 柴胡總皂苷可促進大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮的分泌。 2. 柴胡皂苷d對小鼠艾氏腹水癌有抑制腫瘤生長作用，且能明顯延長動物的生存時間。,三. 三萜皂苷的主要含量分析方法,中藥及其制劑中三萜皂苷的含量分析可分為: 總皂苷測定 皂苷元測定 單體皂苷測定,總皂苷測定： 1. 提取：一般需要適當?shù)娜軇┨崛?。由于皂苷在極性溶劑中溶解度較大，提取溶劑可為各種濃度的甲醇、乙醇和異丙醇、丁醇、戊醇。 2. 精制：水飽和的正丁醇萃??；大孔樹脂處理后溶劑洗脫。 3. 測定：最常用的方法為比色法，也有用重量法的。,皂苷元測定： 提?。?先用上述方法得到總皂苷，再加酸（如

10、硫酸、鹽酸）加熱水解，得皂苷元。 2將樣品先行水解，再用有機溶劑從水解的混合液中提取皂苷元。 測定：主要有薄層色譜法、高效液相色譜法和比色法。 單體皂苷測定：主要為薄層色譜法和高效液相色譜法。,(一) 比色法,皂苷類成分多無色，且常無紫外吸收。 含量測定時常需顯色， 產(chǎn)生顏色-于可見光區(qū)比色測定 在紫外光區(qū)產(chǎn)生吸收-用紫外分光光度法測定。 皂苷類成分的顏色反應的專屬性雖較差，但反應比較靈敏，方法簡便，易行。,常用的顯色劑有： 濃硫酸 高氯酸 硫酸-醋酐、硫酸-醋酐-冰醋酸或硫酸-冰醋酸 芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸 其它試劑：對-二甲氨基苯甲醛，亞甲藍等,(二) 薄層色譜法,1. 薄層條件 (

11、1) 吸附劑：硅膠，氧化鋁 (2) 展開劑：皂苷；皂苷元 (3) 顯色劑：25%磷鉬酸乙醇溶液 硫酸：甲醇（1：1） 氯磺酸：醋酸（1：2） 碘蒸氣,2. 含量測定方法： (1) 薄層-比色法 人參皂苷元的薄層-比色法測定 標準曲線：對照品為人參皂苷元（人參二醇、人參三醇、齊墩果酸），加5%香草醛-冰醋酸、高氯酸；再加醋酸，在560nm測定，做三條標準曲線 樣品測定：硅膠G，條狀點樣；氯仿-甲醇-水(60:42:11 碘蒸氣顯色；刮取斑點范圍硅膠，顯色測定。測定三組皂苷的吸收度，分別于標準曲線中查得相應數(shù)值，乘以2.5、1.77與2.1倍，計算各組皂苷含量,(2) 薄層掃描法 A.人參單體皂苷

12、薄層掃描法測定 樣品制備：甲醇，冷浸-熱回流 對照：人參皂苷Ro、Rb1、Rb2、RC、Rd、Re、Rg1、Rg2 掃描條件：s=525nm，R=760nm；投射法線性 樣品測定：GF254板， 顯色劑為10%硫酸，115，10min 氯仿-甲醇-水（13:7:2）測定Ro、Rb1、Rg1、Rg2 正丁醇-醋酸乙酯-水（4:1:1）測定Rb2、RC、Rd、Re,B.三七中皂苷薄層掃描法測定 對照品：三七皂苷C1、D1、D2、E 掃描條件：s=525nm，R=700nm；反射法線性 樣品測定：硅膠G板，顯色劑為碳酸氫鈉-無水乙醇 展開劑為1，2-二氯乙烷-正丁醇-甲醇-水（30:40:15:25

13、，下層）,(三) 高效液相色譜法,關鍵問題是測定條件和流動相的選擇。 1. 測定條件選擇 多無共軛體系（少數(shù)除外），通常利用末端吸收作為測定波長。 也可用示差折光檢測器； 新近用蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative light scattering detector，ELSD）,蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）是一種通用型檢測器，流動相由熱氣流使之熱氣化噴霧，再進入加熱管，溶劑在此揮發(fā)。所得分析檢測的物質(zhì)顆粒通過一狹窄光束散射光，由光電倍增管收集。ELSD的響應取決于被分析物質(zhì)顆粒的數(shù)量和大小。由于ELSD僅對不揮發(fā)被分析物質(zhì)產(chǎn)生響應，即使是在梯度洗脫時也能提供平穩(wěn)的基線。 ELSD已成功用于

14、皂甙、生物堿、萜類內(nèi)酯、氨基酸和糖類等分析。是分析無紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具。,2. 流動相的選擇 皂苷類成分多用反相色譜柱。 常用流動相有乙腈、甲醇、純水等。 對溶劑要求較高，最好是色譜醇。,四. 三萜皂苷的質(zhì)量分析研究,(一) 三七中三萜皂苷的定量分析 三七為五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的干燥根。功能散瘀止血，消腫定痛。 現(xiàn)代藥理研究證明，三七中皂甙類成分為其活性成分。為了更好地對三七藥材進行質(zhì)量評價和制定更完善的控制指標，采用HPLC-ELSD對其主要皂甙人參皂甙Rg1、三七皂甙R1進行了含量測定，并用紫外分光光度法測定了

15、總皂甙的含量。,三七中皂甙類成分的含量測定可采用HPLC-UV及HPLC-RI法。前者用紫外檢測器=203nm檢測，因三七中皂甙類成分紫外吸收較差，受試劑影響很大，基線漂移大，使分析很難進行。后者用示差檢測器，則靈敏度低，穩(wěn)定性和選擇性均較差。本文用ELSD檢測器測定三七中主要皂甙人參皂甙Rg1的含量，因ELSD檢測器為質(zhì)量型檢測器，且不受外部環(huán)境的干擾，試劑在檢測器中全部蒸發(fā)，不干擾檢測，靈敏度及穩(wěn)定性均符合含量測定的要求。,A三七中總皂苷的含量測定,1供試品溶液的制備： 取本品粉末約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚80ml，置水浴上提取2h，棄去乙醚液，再加甲醇80ml提取4h，

16、甲醇提取液蒸干，殘渣加水15ml使溶解，水溶液置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取5次，每次15ml，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定溶至50ml，作為供試品溶液。對照品溶液為人參皂甙Rg1（5mg/100ml）。,2紫外吸收光譜： 儀器為島津UV-2501pc紫外分光光度計；供試品紫外吸收曲線及最大吸收波長268nm與人參皂甙Rg1標準品完全一致,3標準曲線制備： 分別精密吸取對照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml置10ml量瓶中，置水浴中揮盡溶劑，取出，加濃硫酸0.6ml，搖勻，置80水浴中加熱1h，取出，置冰浴中加95%乙醇至刻度，搖勻，在268nm波長處測定吸收度。

17、 以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。經(jīng)回歸統(tǒng)計，得標準曲線方程：A=39.6856C+0.0148，r=0.9996。 濃度在5.04-25.20g/ml范圍內(nèi)，與吸收度呈線性關系。,4方法學考察： 回收率試驗回收率為101.15%，RSD=1.44%；穩(wěn)定性試驗RSD為1.35%，總皂甙在3h內(nèi)穩(wěn)定；精密度試驗RSD為1.23%；重現(xiàn)性試驗RSD為2.56%。,表1 三七中總皂甙的含量測定 序號 產(chǎn)地 總皂甙（%） RSD（%） 1 云南文山（40頭） 7.25 1.57 2 云南文山（90頭） 6.81 3.02 3 云南文山（270頭） 6.70 2.70 4 廣西靖西（40

18、頭） 6.44 2.02 5 廣西靖西（60頭） 5.58 1.81 6 西安（60頭） 9.08 1.34 7 杭州（80頭） 7.80 2.56,BHPLC-ELSD測定三七中三七皂甙R1、人參皂甙Rg1的含量,1色譜條件： 日本島津LC-10A；法國SEDEX55型蒸發(fā)激光散射檢測器（ELSD）；杭州英譜HS色譜數(shù)據(jù)工作站。色譜柱日本島津Shim-packCLC-ODS柱（6.0mm150mm）；流動相乙腈-水（30：70）；柱溫45；流速0.5ml/min；ELSD 檢測器漂移管溫度90；載氣壓力0.20mPa。在此條件下，樣品中三七皂甙R1、人參皂甙Rg1與其他相關峰均能達到基線分離

19、。 2樣品制備： 同紫外分光光度法項下。,3標準曲線制備： 分別精密吸取對照品溶液（三七皂甙R1、人參皂甙Rg1的1mg/ml 甲醇）1，2，3，4，5，6l，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積的自然對數(shù)為縱坐標，以濃度的自然對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線， 三七皂甙R1回歸方程為Y=10.677+1.584X，r=0.9998； 人參皂甙Rg1回歸方程為Y=11.322+1.503X，r=0.9996。,4方法學考察： 三七皂甙R1回收率試驗回收率為101.57%，RSD=1.98%；精密度試驗RSD為1.72%；重現(xiàn)性試驗RSD為2.01%。 人參皂甙Rg1回收率試驗回收率為100.50%，R

20、SD=1.82%；精密度試驗RSD為1.26%；重現(xiàn)性試驗RSD為2.78%。,表2 樣品中三七皂甙R1、人參皂甙Rg1含量 序號 產(chǎn)地 三七皂甙R1 RSD 人參皂甙Rg1 RSD （%） （%） （%） （%） 1 云南文山（40頭） 0.99 1.78 3.04 1.66 2 云南文山（90頭） 1.00 2.53 2.79 2.60 3 云南文山（270頭） 0.80 0.96 2.93 2.21 4 廣西靖西（40頭） 1.11 1.71 2.47 1.91 5 廣西靖西（60頭） 0.96 0.53 2.14 2.08 6 西安（60頭） 1.11 2.31 3.94 1.89 7

21、 杭州（80頭） 0.70 2.76 2.34 2.28,(二) 高效液相色譜蒸發(fā)激光散射檢測器分析西洋參中的人參皂甙,西洋參為五加科植物西洋參（Panax quinquefolium L.）的干燥根。功能補肺陰、清火、養(yǎng)胃生津。 西洋參含多種人參皂甙類成分。HPLC-UV法，用紫外檢測器=203nm檢測，因西洋參中皂甙類成分紫外吸收較差，受試劑影響較大，基線漂移大，使分析很難進行。為了更好地對西洋參藥材進行質(zhì)量評價和制定更完善的控制指標，采用HPLC-ELSD法測定西洋參中主要活性成分人參皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2和Rb1的含量。,1儀器與試藥： 日本島津LC-10A高效液相色譜儀；法國

22、SEDEX55型蒸發(fā)激光散射檢測器（ELSD）；杭州英譜HS色譜數(shù)據(jù)工作站。人參皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2和Rb1對照品（中國藥品生物制品檢定所）。乙腈為色譜純；異丙醇為分析純。,2. 色譜條件: 色譜柱為德國默克LichrosorbNH2(250mm 4mm id.10m)；梯度洗脫進行分離，流動相（A）乙腈-水-異丙醇（80：20：15），（B）水按下列次序：0-20min，0%B；20-30min，線性梯度0%B至10%B；30-45min10%B。柱溫25；流速1.0ml/min；ELSD檢測器漂移管溫度95；載氣壓力為0.20mPa。在此條件下，樣品中人參皂甙Rg1、Re、Rd、

23、Rb2和Rb1與其他相關峰均能達到基線分離。,3供試品溶液制備： 取樣品粉末0.5g，精密稱定，加乙醚50ml，置水浴上加熱回流2h，濾過，棄去濾液，殘渣加甲醇50ml，置水浴上加熱2h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25ml使溶解，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取5次，每次15ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗3次，每次15ml，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。,4. 標準曲線制備： 分別精密吸取對照品溶液(人參皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2、Rb1 1mg/ml甲醇的混合溶液。1，2，3，4，5，6l，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積

24、的自然對數(shù)為縱坐標，以濃度的自然對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果見表3。,Table3 Regression equations and correlation coefficients for ginsenosides Compound Regression Correlation No. equation coefficient Rg1 Y=12.892+1.667X 0.9999 Re Y=13.039+1.162X 0.9995 Rd Y=12.519+1.165X 0.9995 Rb2 Y=12.352+1.291X 0.9999 Rb1 Y=13.391+1.286X 0.9998

25、,Table4. Contents of ginsenosides in the Radix of Panax quingquefolium Locality content(%)(n=3) Rg1 Re Rd Rb2 Rb1 Wisconsin,USA(1) 0.163 1.006 0.257 0.091 1.247 Wisconsin,USA(2) 0.140 1.111 0.239 0.084 1.385 Wisconsin,USA(3) 0.084 0.931 0.197 0.360 1.291 Wisconsin,USA(4) 0.105 1.601 0.441 0.222 4.04

26、2 Hebei Pingquan 0.456 1.625 0.697 0.161 1.722 Hebei Zanhuang 0.658 0.115 0.701 0.132 1.761 Beijing Huairou 0.126 1.128 0.412 0.185 3.420 Jilin Fusong 0.160 0.415 0.105 0.075 0.966 Liaoniang 0.411 1.651 0.482 0.125 1.704,(三) HPLC-ELSD法測定黃芪及其制劑中黃芪皂苷的含量,黃芪為我國常用中藥之一，我國藥典中收載的含黃芪的中成藥有20種。目前關于黃芪皂苷的含量測定多采用

27、比色法、薄層掃描法、HPLC-UV法、HPLC-示差折光檢測器法，但由于黃芪皂苷的多樣性，且僅在200nm左右有微弱吸收，因而干擾大，靈敏度低。ELSD為通用型質(zhì)量檢測器，對無紫外吸收的皂苷類化合物靈敏度高，結(jié)果可靠，可作為藥材及其制劑品質(zhì)評價的依據(jù)。黃芪甲苷常作為指標性成分用于黃芪的質(zhì)量監(jiān)控，在預處理過程中通常以氨試液洗滌，所得結(jié)果遠大于未用氨試液處理者，但其余皂苷不易檢測，本文在不以氨試液處理的前提下，對其中黃芪皂苷（即黃芪甲苷）、的含量進行了測定。,1儀器與試藥： Shimadzu LC-6A高效液相色譜儀；法國SEDEX55型蒸發(fā)光散射檢測器；HS色譜數(shù)據(jù)工作站VER3.51(杭州英譜

28、科技開發(fā)有限公司)；黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所）；黃芪皂苷、對照品由江蘇藥物所曹正中研究員惠贈；黃芪飲片購自南京藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)地山西；黃芪注射液（成都地奧九泓制藥廠，批號0002038）；黃芪樣品由本校植物資源與環(huán)境教研室與標本館提供。,2色譜柱條件： shim-pack ODS柱(150mm6mm）；流動相：乙腈:水（36:64）；流速：0.8ml/min；柱壓：50kg/m2；進樣量：10l；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為90，氮氣流速1.5bar。,3樣品溶液的制備： 黃芪藥材粉碎為粗粉，精密稱取約2g，以甲醇80ml索氏提取完全，減壓回收至干，殘渣以約10ml水溶解，置分液漏斗中，以水飽和的正丁醇萃取4次，每次20