1、蛋白質(zhì)工程的崛起,活動1：如果想讓某一個生物的性狀在另外一個生物的身上表達(dá)，常用的方法有哪些？,基因工程成果豐碩,植物方面 提高植物的抗蟲、抗病、抗逆性 改良植物的品質(zhì) 動物方面 提高動物生長速度 改善畜產(chǎn)品的品質(zhì) 用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體 研制藥物 基因治療,科學(xué)家面臨新的問題,在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。,干擾素是由效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，可阻斷細(xì)胞分裂間期，抑制DNA復(fù)制，從而可用于治療疾病。但干擾素在體外很難保存。,玉米中賴氨酸的含量比較低

2、,在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機(jī)溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。,干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生的干擾素的抗病毒活性為106 U/mg，只相當(dāng)于天然產(chǎn)品的十分之一

3、，雖然在大腸桿菌中合成的-干擾素量很多，但多數(shù)是以無活性的二聚體形式存在。為什么會這樣？如何改變這種狀況？研究發(fā)現(xiàn)，-干擾素蛋白質(zhì)中有3個半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測可能是有一個或幾個半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸，結(jié)果使大腸桿菌中生產(chǎn)的-干擾素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干擾素的貯存穩(wěn)定性高很多。,例如：,玉米中賴氨酸含量比較低,天冬氨酸激酶 （352位的蘇氨酸）,二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,天冬氨酸激酶（異亮氨酸）,二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）,玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍,蛋白

4、質(zhì)工程的概念,蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對生產(chǎn)和生活的需求。,前提：,了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,原理：,改造基因（基因修飾或基因合成）,目的：,定向改造或制造蛋白質(zhì),基因表達(dá)流程圖,蛋白質(zhì)工程流程圖,從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā) 設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 推測應(yīng)有的氨基酸序列 找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列,討論： 1、怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？ 請把相應(yīng)的堿基序列寫出來。,活動2 某多肽鏈的一段氨基酸序列是： -丙氨酸-色氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-,丙氨酸：GCU、GCC、

5、GCA、GCG 色氨酸：UGG 賴氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：UUU、UUC,每種氨基酸都有對應(yīng)的三聯(lián)密碼子,只要查一下遺傳密碼子表,就可以將上述氨基酸序列的編碼序列查出來。但是由于上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多個三聯(lián)密碼子編碼,因此其堿基排列組合起來就比較復(fù)雜,至少可以排列出16種。同學(xué)們可以根據(jù)學(xué)過的排列組合知識自己排列一下。首先應(yīng)該根據(jù)三聯(lián)密碼子推出mRNA序列為GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C），再根據(jù)堿基互補(bǔ)配對規(guī)律推出脫氧核苷酸序列：CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。,2、確定目的基因的堿基序列后，

6、怎樣才能合 成或改造目的基因（DNA）？,可以通過人工合成的方法獲取或基因的定點誘變技術(shù)來改變。,基因會發(fā)生突變，突變可以自發(fā)，也可以誘發(fā)，這是每個稍有生物學(xué)知識的人都知道的常識。但在加拿大生物化學(xué)家M史密斯（19322000）發(fā)明定點突變法之前，突變株的產(chǎn)生必須經(jīng)由自然界或用化學(xué)等方法誘使基因體突變。這類方法屬于隨機(jī)突變，突變株必須在生物性狀上有所改變，才能確定有突變發(fā)生，但除非用分子生物方法或遺傳方法找到此突變處，否則無法確定突變位置。也就是說，這種突變是盲目的。而史密斯發(fā)明的定點突變法卻是有目的的，該法可經(jīng)由設(shè)計好的寡核苷酸，在任何一個基因片段上進(jìn)行隨意或設(shè)計好的突變，也就是說，這種突變

7、是預(yù)先設(shè)定好的，所以也有人將該法稱為“反遺傳法”。 有意思的是這一給生命科學(xué)研究及應(yīng)用領(lǐng)域帶來革命性突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡時閑聊出來的?，F(xiàn)在，幾乎每個生物實驗室都會用定點突變法來研究基因或蛋白質(zhì)的功能。,蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括： （1）從生物體中分離純化目的蛋白； （2）測定其氨基酸序列； （3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);,（4）設(shè)計各種處理條件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響； （5）設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案，如定點突變； （6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。,（二）蛋白

8、質(zhì)改造工程舉例 1水蛭素改造 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑，它有多種變異體，由65或66個氨基酸殘基組成。水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病。為提高水蛭素活性，在綜合各變異體結(jié)構(gòu)特點的基礎(chǔ)上提出改造水蛭素主要變異體HV2的設(shè)計方案，將47位的Asn（天冬酰胺）變成Lys（賴氨酸），使其與分子內(nèi)第4或第5位Thr（蘇氨酸）間形成氫鍵來幫助水蛭素N端肽段的正確取向，從而提高凝血效率，試管試驗活性提高4倍，在動物模型上檢驗抗血栓形成的效果，提高20倍。,2生長激素改造 生長激素通過對它特異受體的作用促進(jìn)細(xì)胞和機(jī)體的生長發(fā)育，然而它不僅可以結(jié)合生長激素受體，還可以結(jié)合許多種不同類

9、型細(xì)胞的催乳激素受體，引發(fā)其他生理過程。在治療過程中為減少副作用，需使人的重組生長激素只與生長激素受體結(jié)合，盡可能減少與其他激素受體的結(jié)合。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者受體結(jié)合區(qū)有一部分重疊，但并不完全相同，有可能通過改造加以區(qū)別。由于人的生長激素和催乳激素受體結(jié)合需要鋅離子參與作用，而它與生長激素受體結(jié)合則無需鋅離子參與，于是考慮取代充當(dāng)鋅離子配基的氨基酸側(cè)鏈，如第18和第21位His（組氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。實驗結(jié)果與預(yù)先設(shè)想一致，但要開發(fā)作為臨床用藥還有大量的工作要做。,3胰島素改造 天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加

10、了抗原性，這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過臨床實驗。,4治癌酶的改造 癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細(xì)胞，特異性地抑制或殺死癌細(xì)胞；藥物保護(hù)正常細(xì)胞免受化學(xué)藥物的侵害，可以提高化學(xué)治療的劑量。皰疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它結(jié)構(gòu)類似物磷酸化而使這些堿基3-OH缺乏,從而阻斷DNA的合成，殺死癌細(xì)胞。HSVTK催化能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機(jī)突變中進(jìn)行篩選出一種酶,在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力20倍以上。 蛋白質(zhì)工程的發(fā)展很快，研究工作很多，以上僅介紹了幾個例子。蛋白質(zhì)工程除了用于改造天然蛋白質(zhì)或設(shè)計制造新的蛋白質(zhì)