1、優(yōu)質(zhì)果醋釀造技術(shù)及風(fēng)味改進,二、研究啟示,一、讀書體會,一、讀書體會 1、水果醋酸發(fā)酵產(chǎn)品研究、開發(fā)現(xiàn)狀,2、 醋酸發(fā)酵機理與酶化學(xué),3、醋酸菌的菌學(xué)研究與應(yīng)用,4、醋酸發(fā)酵技術(shù)研究,5、果醋風(fēng)味化學(xué),6、蘋果生產(chǎn)及加工現(xiàn)狀,7、 資料分析,8 、優(yōu)質(zhì)蘋果醋研究思路與內(nèi)容,一、讀書體會 1、水果醋酸發(fā)酵產(chǎn)品研究、開發(fā)現(xiàn)狀 醋酸發(fā)酵的主產(chǎn)品是醋酸、食醋及醋酸飲料。 醋酸發(fā)酵起源于食醋發(fā)酵。 醋是人類最早的釀造調(diào)味品。 世界食醋年產(chǎn)量25億升，其中我國是生產(chǎn)消費大國年產(chǎn)量4億升，歐美果醋生產(chǎn)消費高于亞洲，以蘋果醋、葡萄醋為主，美國年產(chǎn)蘋果醋0.93億升，占食醋總產(chǎn)量的16.6%，英國年產(chǎn)量0.1億

2、升，占食醋產(chǎn)量的10%。日本產(chǎn)量最大的是米醋，果實醋年產(chǎn)0.175億升，占食醋年產(chǎn)量3.9億升的5%，主要是蘋果醋、葡萄醋，其中蘋果醋占食醋總量的2.9 %。,我國果醋生產(chǎn)量很小，目前國內(nèi)研究并開發(fā)的果醋主要有葡萄醋、梨醋、柿子醋、山楂醋、蘋果醋； 果醋具有降血壓、軟化血管、幫助消化、降血糖、減肥、抑菌等功能，富含K、Zn、有機酸、多酚類功能因子，比糧食醋具有更好的保健性；同時含果香、果酸，比糧食醋有更好的風(fēng)味特點及適口性。 加強優(yōu)質(zhì)果醋產(chǎn)品的研究與開發(fā)，將促進果醋商品化生產(chǎn)與消費。,2、 醋酸發(fā)酵機理與酶化學(xué),醋酸菌是食醋釀造中醋酸發(fā)酵階段的主要菌，醋酸菌的發(fā)酵機理及酶學(xué)特性研究認為，它具有

3、氧化乙醇生成醋酸的能力。 乙醇向醋酸的轉(zhuǎn)化分兩步，中間產(chǎn)物是乙醛:,CH3CH2OH CH3CHO CH3COOH E1 E2 式中E1是乙醇脫氫酶，E2是醛脫氫酶,細胞色素氧化酶,CH3COOH,CH3CH2OH CH3CHO CH3COOH,E1 E12e E2,NADP,NADPH,E3,2e,醋酸生成的細胞代謝反應(yīng),日本學(xué)者中山竹義對醋酸發(fā)酵機理闡述：,乙醇先由 醇細胞色素553還原酶（E1）氧化成乙醛，電子轉(zhuǎn)移到E1的血紅蛋白鐵上，乙醛由不依賴于輔酶的醛脫氫酶（E2）或由依賴于NADP的醛脫氫酶（E3）進一步氧化，由E2氧化時，自由電子也轉(zhuǎn)移到E1的血紅蛋白鐵上，還原型的細胞色素55

4、3被存在于細胞中的細胞色素氧化酶氧化，由E3氧化乙醛釋放出的電子將NADP還原成NADPH。,O.Adachi，E.Shinagawa等（1978）從醋酸桿菌（Acetobacter aceti）細胞膜分離、純化出乙醇脫氫酶的結(jié)晶，并同時對酶的性質(zhì)進行了研究，乙醇的氧化是通過電子傳遞鏈進行的，其吸收光譜呈現(xiàn)典型的C型細胞色素吸收光譜，以還原態(tài)存在，在分光光度儀上有特征的吸收，這種乙醇脫氫酶的輔酶是PQQ（吡咯喹啉苯醌）。 M.Shimao,H.等（1984）證明，醋酸菌在醋酸發(fā)酵中，酶類均存在于醋酸菌的細胞膜中，與同膜中的磷脂相結(jié)合，通過乙醇氧化為乙醛的乙醇脫氫酶（ADH）和將乙醛再氧化成醋酸

5、的乙醛脫氫酶（ALDH）實現(xiàn)食醋釀造,醋酸菌的發(fā)酵能力雖與二者都有關(guān)，但乙醇脫氫酶（ADH）起更大的作用。 Takemura,H等（1993）克隆了巴氏醋酸桿菌A.Pasturianus的ADH的編碼基因和細胞色素C亞基，并確定其核苷酸順序是由26-35個AA組成的信號肽，在ADH基因上游(59bp，232bp)有兩個不同的啟動子，無乙醇時膜上ADH亞基減少可能是ADH活性降低的原因。,3、醋酸菌的菌學(xué)研究與應(yīng)用 醋酸菌屬于醋酸單孢菌屬，革蘭氏陽性，是嚴格好氧細菌，其細胞從橢圓到桿狀，單生、成對或成鏈狀排列，周生或極生鞭毛，氧化各種有機物生成有機酸。它種類多，分布廣，它不僅用于制醋，也用于生產(chǎn)

6、葡萄糖酸、山梨酸，對于研究乙醇、多元醇和糖類基質(zhì)氧化有重要作用。 1900年伯杰氏（Beijerinck）將醋桿菌（Acetobacter）作為醋酸菌的屬名，1935年朝井勇宣提議氧化葡萄糖生成葡萄糖酸能力強的歸屬葡萄糖桿菌屬，1950年Frateur 按氧化能力將醋桿菌屬分成4大類群：過氧化、氧化、中氧化和弱氧化。據(jù)朝井的不完全統(tǒng)計，醋桿菌屬（Acetobacter）有71個種，30個變種，醋單胞菌屬（Acetomonas）有5個種，4個變種，葡萄糖桿菌屬（Gluconobacter）有17個種，1個變種。因醋酸桿菌的變異性，醋酸菌分類實際意義不大。,醋酸菌廣泛存在于自然界中，容易被所利用。

7、自古以來主要依靠空氣中的醋酸菌釀造食醋，或用發(fā)酵好的醋液或醋醅作醋母來引發(fā)醋酸發(fā)酵,目前的工業(yè)化生產(chǎn)也常留一部分發(fā)酵醪或醋醅作為下批醋酸發(fā)酵的菌種。 自然醋酸發(fā)酵是多菌種和菌株參與的過程，Caridi.A等(1997)從42種葡萄醋和23種家庭醋中分離出530株醋酸菌，其中91.7%為巴氏醋酸桿菌（A.Pastearanus）,5%為醋化醋酸桿菌（A.aceti），2.8%為漢遜理桿菌（A.hansenli）。Sacki.A等(1996)根據(jù)耐高溫醋酸菌的分類學(xué)和生理特征將其鑒定為4個種屬，耐溫在3840，培養(yǎng)分離出耐20%酸的深層發(fā)酵醋酸菌。,應(yīng)用于食醋釀造的優(yōu)良醋酸菌的應(yīng)具有以下特點：產(chǎn)酸

8、迅速，具有強氧化性能；無過氧化性；在殘留酒精至一定限度前，中途發(fā)酵不應(yīng)停止；生成的醋應(yīng)有一定芳香氣味。 目前國內(nèi)廠家常采用單一菌種生產(chǎn)液態(tài)糧食醋，常用AS1.41和滬釀1.01菌種，國外有些廠家用混合醋酸菌生產(chǎn)食醋，以提高發(fā)酵速度，增加產(chǎn)品香味和固形物。,4、醋酸發(fā)酵技術(shù)研究 發(fā)酵在生理學(xué)上是指微生物的無氧呼吸和有氧呼吸以外的一種生物氧化作用，在生物氧化過程中有機化合物本身既是電子（或氫）供體同時又是其受體，在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵是利用微生物獲得產(chǎn)品的泛稱，發(fā)酵工程是研究利用微生物的工業(yè)，即微生物參與的工藝過程，與其相關(guān)的技術(shù)即發(fā)酵技術(shù)。 19世紀(jì)末人們開始認識厭氧發(fā)酵，1826年Schiitzen

9、bach用速釀法從乙醇快速生產(chǎn)醋酸，使好氧技術(shù)得到發(fā)展，1933年 Kluyver等人發(fā)明搖床培養(yǎng)法，為深層培養(yǎng)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。發(fā)酵生產(chǎn)分固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方式，固體發(fā)酵勞動強度大、傳質(zhì)和傳熱困難、產(chǎn)率和收率低、培養(yǎng)過程檢測困難；液體發(fā)酵有表面發(fā)酵和深層發(fā)酵兩種方式，深層發(fā)酵包括分批發(fā)酵（間歇發(fā)酵）、連續(xù)發(fā)酵、補料分批發(fā)酵等方式，是生產(chǎn)上采用的最主要方式。,果實釀醋廣泛采用的發(fā)酵技術(shù)為分批發(fā)酵，方法有固態(tài)法、液態(tài)法及固液結(jié)合法，液態(tài)發(fā)酵法又分為靜置表面發(fā)酵、深層發(fā)酵、酶法液體回流及固定化連續(xù)分批發(fā)酵等。液態(tài)法發(fā)酵具有易操作管理、規(guī)模化標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，又有利于提高原料利用率、產(chǎn)酸速率和酒精轉(zhuǎn)酸率

10、，液體法生產(chǎn)是最有效和先進的工藝技術(shù)方法。 國外果醋生產(chǎn)多采用液體深層分批、連續(xù)發(fā)酵、循環(huán)液體發(fā)酵及菌體固定化發(fā)酵；英、美、加拿大、日本等蘋果醋生產(chǎn)以采用連續(xù)充氣深層發(fā)酵法為主，用Fring或塔式深層酸化器，利用添加營養(yǎng)促進劑提高產(chǎn)酸速率和酒精轉(zhuǎn)酸率。,Ory.I.de等(1998)采用逐步流加半連續(xù)發(fā)酵器研究葡萄醋的最佳工藝，發(fā)酵酒精轉(zhuǎn)酸率可達100%，125l的葡萄酒72h生產(chǎn)8125l的葡萄醋。 Jeeng-Hwa Hong等(1996)研究脫澀柿釀造醋的最佳溫度為35，添加4%的乙醇可提高酸度。 Higashide，T等(1994)利用改良的分批深層培養(yǎng)法研究生產(chǎn)高濃醋，發(fā)酵分兩個階段

11、，第一階段28-29發(fā)酵至酸度12%(w/v)，第二階段15發(fā)酵至20%(w/v)以上。Chukwu,U等(1996)應(yīng)用電滲(ED)濃縮技術(shù)研制高濃醋，醋酸含量可達30%-33%(w/v)。,固定化細胞發(fā)酵是20世紀(jì)70年代開始發(fā)展的微生物發(fā)酵新技術(shù)，固定化發(fā)酵技術(shù)是指使用固定化生長菌體進行的發(fā)酵，實質(zhì)上是菌體繁殖與產(chǎn)物生成分離的二步發(fā)酵技術(shù)；它又是利用充作酶源的菌體，人工實現(xiàn)生物體部分機能的固定化酶工程技術(shù)之一；其特點是重復(fù)利用微生物進行多級反應(yīng)，使用反應(yīng)柱或反應(yīng)床可實現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，避免反饋調(diào)節(jié)或產(chǎn)物消耗，提高發(fā)酵生產(chǎn)率，降低設(shè)備費用。 用于醋酸發(fā)酵的固定化細胞技術(shù)分為固定膜發(fā)酵和流動膜發(fā)酵

12、兩類，因其發(fā)酵反應(yīng)速度快，設(shè)備利用率高，便于機械化生產(chǎn)等優(yōu)點一直是釀醋技術(shù)研究的熱點。,國外研究的固定化載體有綿狀纖維、中空纖維、多孔陶瓷、棉布、卡拉膠、海藻酸鈣、水合氧化鈦、殼聚糖等。郭養(yǎng)浩等(1991)利用海藻酸鈉包埋AS.1.41的發(fā)酵特性研究認為，游離細胞、固定細胞對產(chǎn)酸都有貢獻，減少顆粒直徑可提高產(chǎn)酸速率。Panasyuk，A.L等(1990)將蘋果酒陳放后再應(yīng)用固定化技術(shù)來改善蘋果醋質(zhì)量。Neelima Garg等(1995)利用海藻酸鈣固定醋酸菌于刨花上半連續(xù)生產(chǎn)高質(zhì)量的芒果醋。Tamai.M等（1997）用空心纖維膜、固定全細胞連續(xù)生產(chǎn)食醋，酒精度維持在1%(v/v)，酸度維持

13、10%(w/v)，采用部分排放固定液、兩步反應(yīng)法可提高產(chǎn)酸率(0.95g醋酸/1.304g酒精)。 近年來國內(nèi)有關(guān)果醋研究以工藝技術(shù)方法為主，大多采用與傳統(tǒng)固態(tài)工藝結(jié)合的方法，液態(tài)法工業(yè)化生產(chǎn)的并不多見，深層液體發(fā)酵法僅占我國食醋產(chǎn)量的6%。,5、果醋風(fēng)味化學(xué) 5.1果醋酸味 酸味是酸性調(diào)味品最主要的質(zhì)量指標(biāo)，不同的有機酸有不同的酸味特征，對食醋的酸味有影響，乙酸具有刺激性，琥珀酸有鮮味、富馬酸、蘋果酸爽快但有澀味，葡萄糖酸爽快且柔和，現(xiàn)代食品分析技術(shù)充分研究及闡明了果汁、果酒、糧食醋中的酸味構(gòu)成。食醋總酸5%左右，一般揮發(fā)酸占90%，主要是乙酸；不揮發(fā)酸10%；不同果醋的有機酸組成差異較大，

14、果醋在味覺上與谷物醋的差別主要是有機酸的差異，有機酸的組成與原料、菌種、工藝及技術(shù)管理有關(guān)。,蘋果醋的主要有機酸有醋酸、琥珀酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、酮戊二酸，其中蘋果酸含量6.5-160mg/100ml，主要與原料組成有關(guān)。 蘋果果實中至少含有16種有機酸，主要有蘋果酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、蟻酸、檸檬酸、羥基乙酸，其中蘋果酸含量最大在0.38%-0.63%，不同品種酸組成和含酸量差別較大； 蘋果酸在酵母酒精發(fā)酵過程中變化很少，乳酸是酒精發(fā)酵的產(chǎn)物，在果酒釀造后蘋果酸乳酸發(fā)酵（MLF），使乳酸含量增加，而蘋果酸的含量降低，酵母酒精發(fā)酵同時生成醋酸，醋酸又被酵母利用，整個酒精發(fā)酵代謝醋酸增加量很

15、少 。,醋酸菌以乙醇為主要碳源，在氧化乙醇生成醋酸為主的同時，代謝生成20種以上有機酸，醋酸菌可利用醋酸生成蘋果酸、琥珀酸；同時蘋果酸、乳酸、琥珀酸又是醋酸菌的生長因子。不同的菌種有機酸的代謝不同，不同的發(fā)酵方法及工藝控制會影響醋酸的生成，也影響其他有機酸的生成。,5.2蘋果醋香氣成分 食醋的香氣有醇類、醛類、酯類、酸、內(nèi)酯、酚、酮類七大類，酯香是水果香氣成分之一，是果醋的特征香氣成分。酯香成分組成、含量與水果品種、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熟成期有關(guān)，伊藤（1975）等從蘋果醋中鑒定出30種酯香成分，其中乙酸乙酯的含量最高在65-1000 PPm； 蘋果果實的香氣化合物250種以上，其中醇類、醛類

16、、酯類是特征嗅感的主要成分，果實揮發(fā)酯含量高的有紅玉、初秋、富士，蘋果汁起決定作用的酯香物質(zhì)為2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸已酯(Flath 等1967)。,酯香的生成還與酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、成熟方法與時間有關(guān)；酵母細胞內(nèi)酯酶作用產(chǎn)生的酯主要是乙酸乙酯，還可形成部分脂肪酸酯，產(chǎn)酯酵母產(chǎn)生成以乙酸乙酯、丁酸乙酯為主的多種酯類。 液態(tài)糧食醋發(fā)酵總酯有下降趨勢，乙酸乙酯后期有所增加，伴隨乙酸的形成及熟成的開始，乙酸酯類構(gòu)成香氣的主要成分，乙酸乙酯的變化是酸化菌及酸化質(zhì)量的體現(xiàn)。液態(tài)發(fā)酵的封閉環(huán)境及純種發(fā)酵使醋中酯香種類、含量低于固態(tài)法，采用生香酵母和乳酸菌、醋酸菌的聯(lián)合及物理法催陳，可顯著改善及提

17、高液態(tài)糧食醋酯香和風(fēng)味。,6、蘋果生產(chǎn)及加工現(xiàn)狀 蘋果屬于薔薇科（Rosaceae）、蘋果屬(Malus Mill.)，是一種高產(chǎn)果樹，壽命長，有較好的栽培適應(yīng)性，是一種良好的經(jīng)濟樹種，我國種植面積和產(chǎn)量增長迅速，已成為某些農(nóng)業(yè)地區(qū)（山東、陜西）的支柱產(chǎn)業(yè)。自1994年以來我國蘋果產(chǎn)量一直居世界第一位,2000年蘋果產(chǎn)量2289萬噸，占世界蘋果產(chǎn)量的38.5%，蘋果栽培面積230萬公頃，占世界蘋果栽培面積的40.1%，2001年世界蘋果產(chǎn)量為6289.68萬噸，我國為2400.7萬噸，預(yù)計每年以200-300萬噸的速度增加。 蘋果的理化組成特性決定了蘋果的加工適應(yīng)性，世界平均蘋果加工量為蘋果產(chǎn)

18、量的22%-24%，很多發(fā)達國家加工量超過產(chǎn)量的50%，加工量最多的是美國、德國、波蘭、日本等，國外主要的加工品為蘋果汁、蘋果酒、蘋果醋、蘋果干和脆片、蘋果醬等，我國蘋果大部分用于鮮食，加工量80萬噸左右，占蘋果產(chǎn)量的5%，目前國內(nèi)的主要加工品為蘋果汁（濃縮汁）、蘋果酒、蘋果脯、醬、脆片，蘋果加工品的研究與開發(fā)，已成為食品科技研究的一個重要領(lǐng)域，又是綜合利用蘋果資源提高蘋果產(chǎn)業(yè)效益的一條重要途徑。,7 資料分析,由以上資料可看出目前水果醋酸發(fā)酵領(lǐng)域研究中存在以下問題： （1）水果適宜于液態(tài)醋酸發(fā)酵，對醋酸菌種及水果品種適應(yīng)性沒有系統(tǒng)深入研究，缺乏醋酸菌種、水果品種、工藝技術(shù)方法對果汁醋酸發(fā)酵影

19、響的研究，不利于提高原料利用率和產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。 （2）缺乏不同酵母菌、醋酸菌有機酸及酯類代謝的研究，尤其是酸化菌及酸化過程對有機酸、酯類影響研究，不利于產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定與提高。 （3）酸味及酯香構(gòu)成是果醋風(fēng)味的主要特征，果醋果香、發(fā)酵香、熟成香組成及變化規(guī)律未闡明，尤其是酯香。缺乏蘋果品種對蘋果醋感官質(zhì)量影響的研究，不利于產(chǎn)品質(zhì)量提高和蘋果產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整與發(fā)展。 （4）缺乏提高果醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸能力及產(chǎn)品增香、護香技術(shù)措施研究，不利于產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定和水果資源利用。,8 優(yōu)質(zhì)蘋果醋研究思路與內(nèi)容 思路：,蘋果（產(chǎn)量的劇增） 鮮食 加工轉(zhuǎn)化（適于加工） 果汁 果酒 果醋（酸性保健調(diào)味品） 優(yōu)質(zhì)

20、醋 發(fā)酵技術(shù) 風(fēng)味特征,內(nèi)容與技術(shù)路線 ：,二、研究啟示, 優(yōu)質(zhì)醋酸菌選育,蘋果汁分批醋酸發(fā)酵規(guī)律, 蘋果汁固定化醋酸發(fā)酵, 蘋果醋風(fēng)味物質(zhì)鑒定分析與提高酯香的措施,蘋果汁醋酸發(fā)酵有機酸分析,不同品種蘋果釀醋適應(yīng)性, 結(jié)論, 展望, 優(yōu)質(zhì)醋酸菌選育,1 菌種、材料與方法 1.1 菌種 1.1.1酵母菌 葡萄酒酵母1450（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院保存） 1.1.2醋酸菌 AS.1.41（山東大學(xué)微生物系提供），滬釀1.01（山東大學(xué)微生物系提供）， 蘋果醋酸發(fā)酵母液（美國加州大學(xué)，U.S.Davise提供），醋醅（濟南洛口釀造廠提供）。 1.2培養(yǎng)基,1.3菌種分離篩選流程,樣品 高酸馴化 增殖培

21、養(yǎng)稀釋分離 純化 斜面保藏 產(chǎn)醋酸定性試驗 初篩 復(fù)篩,1.4 鑒定程序,單菌落 試管斜面 形態(tài)特征 培養(yǎng)特征 生理生化特征 鑒定菌株,鑒定后按Frateur法分類,2 結(jié)果與分析 2.1高酸馴化： 在三角瓶中加入產(chǎn)酸培養(yǎng)基，接入10%的樣品液，30搖床醋酸發(fā)酵，當(dāng)醋酸含量達5%左右時，流加酒精，使三角瓶內(nèi)的酒精量保持3%，繼續(xù)發(fā)酵，至產(chǎn)醋酸8%以上時停止發(fā)酵。,2.2分離純化 挑選透明圈大，細胞形態(tài)類同，且占生長優(yōu)勢的單菌落約200個，把這200個單菌落在平板上多次劃線分離，純化后分別進行搖瓶發(fā)酵。 2.3醋酸定性試驗 進行醋酸定性試驗，均形成紅褐色沉淀，說明分離到的菌為醋酸菌。,2.4初篩

22、 將以上的純化菌株經(jīng)碳酸鈣平板培養(yǎng)基初選，根據(jù)其HC值與對照菌株（AS1.41）相比，初選出15株優(yōu)勢醋酸菌。 2.5復(fù)篩（1）與復(fù)篩（2）： 將初篩菌株進行搖床產(chǎn)酸試驗，發(fā)酵條件為500ml，發(fā)酵液裝量130ml，溫度30，轉(zhuǎn)速90r/min，每個菌種作三個平行試驗,測定終發(fā)酵酸度、揮發(fā)酯，記錄并計算其平均值。結(jié)果如表所示。,表2-2 分離篩選菌株的產(chǎn)酸量與產(chǎn)酯量 Table 2-2 Acidity and volatile ester content in acidification of repeat selected strain,復(fù)篩產(chǎn)酸試驗結(jié)果方差分析認為，菌株間產(chǎn)酸存在顯著差異，

23、產(chǎn)酯存在差異。有三株菌株產(chǎn)酸量明顯高于其它菌株和對照菌株AS1.41。試驗分離獲得三株高產(chǎn)醋酸菌，其中兩株來自于蘋果醋發(fā)酵母液（AM2和AM4），一株從醋醅中分離得到(CP1),這三株菌的產(chǎn)酸量明顯高于其它菌株，并且這三株菌的揮發(fā)酯含量也較高，而且三株菌的產(chǎn)酸量與揮發(fā)酯含量都高于對照菌株AS1.41。由以上篩選也說明傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵中存在著多菌種，不屬純種發(fā)酵，多菌種發(fā)酵是固態(tài)醋良好質(zhì)量風(fēng)味基礎(chǔ)。,2.6菌種鑒定 2.6.1菌株的形態(tài)特征：從電鏡照片上可看出（見附圖2-1、2-2、2-3），AM2、AM4細胞橢圓，大小0.60.70.81.0m， CP1細胞為桿狀，大小0.50.60.91.1m

24、，成對或成鏈存在。菌落圓形，隆起，表面光滑。半固體洋菜穿刺培養(yǎng)，三株菌均有云霧狀擴散，鞭毛染色后電鏡觀察，AM2、AM4為極生鞭毛，CP1為周生鞭毛。 2.6.2培養(yǎng)特征：在葡萄糖、酵母膏、乙醇斜面上生長旺盛；在高糖培養(yǎng)基上產(chǎn)酸；在蘋果酒中生長，并使酒渾濁；HonyerFrateur培養(yǎng)基中不生長。 2.6.3生理生化試驗 將三個菌株進行其過氧化氫酶生成試驗、以銨鹽為唯一碳源的生長試驗、分解乙酸鹽的能力試驗、產(chǎn)葡萄糖酸試驗、酮基化合物的生成試驗，檢測結(jié)果如表2-3：,表2-3 醋酸菌生理生化的鑒定結(jié)果,Table 2-3 Result of determinative Acetobacter,

25、由表2-3，根據(jù)Frateur的醋桿菌的分類系統(tǒng)，菌種鑒定為：CP1為氧化菌中的惡臭醋桿菌；AM2、AM4為中氧化菌中的中氧化醋桿菌。,3 結(jié)論與討論 3.1從醋醅中分離得到CP1優(yōu)質(zhì)菌株，蘋果醋母液中分離得到AM2和AM4兩株優(yōu)質(zhì)菌株。菌種鑒定結(jié)果為：CP1為氧化菌中的惡臭醋桿菌，周生鞭毛；AM2,AM4為中氧化菌中的中氧化醋桿菌，極生鞭毛。這三株菌株產(chǎn)酸速度快，產(chǎn)酸量高，產(chǎn)酯量高，發(fā)酵風(fēng)味理想。 3.2現(xiàn)在自然發(fā)酵醋醅和生產(chǎn)用的醋酸菌大多屬醋酸桿菌屬，分離到的菌株經(jīng)鑒定也屬于此屬，而不是葡萄糖桿菌屬。醋醅中菌種構(gòu)成繁雜，不同發(fā)酵時期菌種構(gòu)成也不相同，其作用及對風(fēng)味影響還有待進一步研究。,圖

26、2-1 醋酸菌AM2的細胞形態(tài) Fig 2-1 Cell morphology of AM2,圖2-2 醋酸菌AM4的細胞形態(tài) Fig 2-2 Cell morphology of AM4,圖2-3 醋酸菌CP1的細胞形態(tài) Fig 2-3 Cell morphology of CP1,蘋果汁分批醋酸發(fā)酵規(guī)律,1 材料與方法 1.1 試驗材料 1.1.1材料：濃縮蘋果汁。 1.1.2菌種：酵母菌1450 醋酸菌AS1.41、AM2、滬釀1.01、AM4、CP1 1.2 儀器：THZ-C恒溫振蕩器 1.3方法 乙醇脫氫酶活性的測定(Willis AWood，1982),酶活力單位定義：每分鐘催化氧

27、化1mol乙醇為一個酶活力單位，4.0吸光度等于氧化1mol的乙醇。 酒精轉(zhuǎn)酸率計算,1.4工藝要點 （1）濃縮蘋果汁的稀釋：將濃縮蘋果汁加水稀釋至12Bx，巴氏殺菌，冷卻待用。 （2）酵母菌培養(yǎng)：12Bx麥芽汁200ml，接入斜面菌種，2830搖床培養(yǎng)24h。 （3）醋酸菌培養(yǎng)：將液體葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基置于250ml三角瓶中，高壓殺菌20min。冷卻后每瓶加入3.5ml無水乙醇，接入斜面培養(yǎng)菌種，30搖床培養(yǎng)，每12h用氫氧化鈉滴定，當(dāng)酸度升至1.82.0%時接種。 （4）酒精發(fā)酵：將殺菌后的蘋果汁接入5%活化好的酵母菌培養(yǎng)液，室溫下發(fā)酵45天，至殘?zhí)墙抵?.4%以下終止發(fā)酵，巴氏殺菌，過濾

28、后測酒精度、還原糖及酸度。 （5）醋酸發(fā)酵：將酒精發(fā)酵后的試液定量置于250ml或500ml殺菌的三角瓶中，棉塞封口，接醋酸菌培養(yǎng)液入搖床發(fā)酵，每12h測一次酸度，至酸度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束。巴氏殺菌，過濾后測酸度、酒精度、還原糖。,1.5搖床條件試驗設(shè)計 試驗確定以發(fā)酵液溫度（27、30、33），搖床轉(zhuǎn)速（90r/min、120r/min、150r/min）及三角瓶相對裝量（1/2、1/3、1/4）三因子三水平設(shè)計正交試驗（表3-1），采用L（34）表下觀分析9個實驗的結(jié)果，每個實驗設(shè)兩個重復(fù)計算平均值。,表3-1 搖床試驗因素水平表 Tabie3-1 Factors and levels

29、of design for ferment condition,2.1接種量的選擇 分別將120ml酒精度5.50ml/100ml的蘋果酒液裝入500三角瓶中，按5%、10%、15%接種AS1.41活化液，30、轉(zhuǎn)速120r/min下?lián)u床發(fā)酵，每12h測定一次總酸，每組試驗作兩個平行試驗，記錄并計算酸度變化平均值、產(chǎn)酸速度和酒精轉(zhuǎn)速率，結(jié)果可以看出隨接種量的增加產(chǎn)酸速度有增加的趨勢，5%接種量產(chǎn)酸速度偏低，說明接種量小會明顯影響發(fā)酵周期，雖不同接種量酒精轉(zhuǎn)酸率差別不大，15%接種量在發(fā)酵后期酸度變化明顯，不易于發(fā)酵控制，10%的接種量比較適宜，72小時發(fā)酵完成。,2 結(jié)果與分析,2.2不同酒精

30、度對發(fā)酵的影響 分別調(diào)整蘋果酒液酒精度為4.5% 、5.5%、6.5%、7.5%，以AS1.41為試驗菌株，在250ml三角瓶分別裝入80ml酒液，接種量10%，在30，120r/min的條件下?lián)u床發(fā)酵，每組作兩個平行，每12h測一次酸度并計算記錄平均值和產(chǎn)酸速度、酒精轉(zhuǎn)酸率，結(jié)果如圖3-1所示： 菌株在24h酸量變化不大，增長緩慢，與初始高酒精對菌的抑制作用有關(guān)；不同酒精度發(fā)酵周期不同，酒精度越低發(fā)酵周期越短，這于產(chǎn)酸高峰期有關(guān)，酒精度為4.5%產(chǎn)酸高峰在24至72小時內(nèi)，酒精度5.5%、6.5%、7.5%的產(chǎn)酸高峰在48至84小時內(nèi)，此時發(fā)酵液酒精度在2.5%-1%范圍內(nèi)，以后醋酸發(fā)酵趨于

31、平緩，這與發(fā)酵后期的高酸度對醋酸菌抑制有關(guān)，隨酒精降低酸度升高醋酸發(fā)酵強度減弱，因而分批醋酸發(fā)酵存在產(chǎn)酸高峰的最適酒精含量范圍,圖3-1 不同酒精含量醋酸發(fā)酵的產(chǎn)酸曲線,2.3 不同因素條件試驗醋酸發(fā)酵酸度變化及直觀分析 將酒精度5.50%的酒樣，按相應(yīng)因素水平條件（表3-1），接種10%活化后的醋酸菌AS.1.41于500ml三角瓶中，四層紗布封口進行搖床發(fā)酵，每12h測定一次總酸，每組試驗作兩個平行試驗，記錄并計算酸度變化平均值，結(jié)果表明，影響產(chǎn)酸速度的主要因素是三角瓶相對裝量,其次是溫度，最后是轉(zhuǎn)速，最佳因素水平組合為相對裝量1/4，溫度30，轉(zhuǎn)速90r/min，說明相對裝量對發(fā)酵液溶氧

32、效果影響最大。影響酒精轉(zhuǎn)酸率的最主要因素是溫度，其次是試驗瓶的相對裝量，最后是轉(zhuǎn)速，最佳因素水平組合為27，相對裝量1/4（125ml）、轉(zhuǎn)速120r/min，說明溫度是影響酒精揮發(fā)的主要因素之一。,2.4不同菌種醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸及ADH酶活規(guī)律 將5株醋酸菌株AM2、AM4、CP1、AS1.41和滬釀101同時進行搖床發(fā)酵，蘋果酒液酒精度5.50%（ml/100ml），發(fā)酵條件為250ml三角瓶裝液量75ml，溫度30，轉(zhuǎn)速120r/min，每個菌種作兩個平行，每12hr測一次總酸和酶活，至酸度上升緩慢終止發(fā)酵，測定總糖、酒精度、揮發(fā)酸、揮發(fā)酯，計算不同菌株的產(chǎn)酸速率與酒精轉(zhuǎn)酸率。結(jié)果由5個菌種

33、的產(chǎn)酸變化曲線看出，在12h內(nèi)酸度變化較平緩，此時期內(nèi)菌量低，同時存在底物抑制效應(yīng)，12h 后變化幅度逐漸增加，產(chǎn)酸高峰在24小時至72小時內(nèi)，不同的菌株酸度變化程度有所不同，但呈相同的變化規(guī)律。由5個菌種的ADH酶活變化曲線看出，在12h酶活變化較平緩，此時期內(nèi)菌量低，同時存在底物抑制效應(yīng)，酶活有在12小時至60小時增加而后逐漸降低的規(guī)律。,圖3-2 AM2的產(chǎn)酸曲線,圖3-7 AM2的ADH酶活變化曲線,酶活的增加在產(chǎn)酸濃度（酸度）增加之前，由相關(guān)系數(shù)可看出，酶活與產(chǎn)酸濃度的線性相關(guān)性較強，在60h之前，酶活與產(chǎn)酸濃度有極強的正相關(guān)，而在60h后，二者呈較強的負相關(guān)。AM2的產(chǎn)酸速率與酒精

34、轉(zhuǎn)酸率明顯高于其它菌種，而其余4個菌株則差別不大。,2.5靜置分批發(fā)酵 將1.5升酒精度為5.54（g/100ml）濃縮汁酒化液放置于直徑為16厘米容量為3升的玻璃瓶中，接種10%的在蘋果酒液活化后的AS1.41醋酸菌液，25-30下靜置發(fā)酵，定時測定、記錄酸度和揮發(fā)酯，繪制其變化曲線。,圖3-12靜置醋酸發(fā)酵酸度的變化曲線,圖3-13 靜置發(fā)酵揮發(fā)酯的變化曲線,表明靜置分批醋酸發(fā)酵周期較長，在16-17天左右，產(chǎn)酸速度低，產(chǎn)酸高峰期在4-14天；酒精轉(zhuǎn)酸率73.5%，與搖床通氣發(fā)酵無差別，說明靜置表面發(fā)酵雖發(fā)酵周期較長而酒精揮發(fā)損失較少。另外，靜置發(fā)酵產(chǎn)品的揮發(fā)酯含量較高，由圖3-13可看出

35、發(fā)酵周期內(nèi)揮發(fā)酯含量呈先增加后降低的趨勢，在4-12天為揮發(fā)酯迅速增加時期，說明醋酸菌具有較強的產(chǎn)酯能力，隨菌量的增加揮發(fā)酯含量增加明顯，隨菌的代謝下降，產(chǎn)酯下降，而揮發(fā)量增加，使揮發(fā)酯的含量下降。,3結(jié)論 3.1蘋果汁分批醋酸發(fā)酵的適宜接種量為10%，適宜酒精度為5.5%，隨酒精度增加發(fā)酵周期延長，酒精轉(zhuǎn)酸率降低。影響蘋果汁搖床醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸速度的主要因素是試驗瓶中發(fā)酵液的相對裝量，最適條件為相對裝量1/4、溫度30、轉(zhuǎn)速為90r/min;影響酒精轉(zhuǎn)酸率的因素是溫度，最適條件為27、相對裝量1/4、轉(zhuǎn)速120r/min。 3.2將5個醋酸菌株AM2、AM4、CP1、滬釀1.01、AS1.41在

36、相同條件下進行搖床醋酸發(fā)酵試驗，發(fā)酵周期在96小時，產(chǎn)酸高峰期在24小時至72小時，產(chǎn)酸速率在0.370.46g/Lh，酒精轉(zhuǎn)酸率在64%74%。AM2的產(chǎn)酒精轉(zhuǎn)酸率及產(chǎn)酸速度高于其它菌種。靜置醋酸發(fā)酵周期為17天，發(fā)酵周期內(nèi)揮發(fā)酯含量呈先增加后降低的規(guī)律。,3.3在蘋果汁分批搖床醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌乙醇脫氫酶酶活性在60小時內(nèi)呈增加的趨勢，酶活性在60小時達最高，然后酶活開始下降，酶活與產(chǎn)酸濃度有線性相關(guān)性，在60h之前，酶活與產(chǎn)酸濃度有極強的正相關(guān)，而在60h后，有較強的負相關(guān)；底物（酒精度）、產(chǎn)物（乙酸）及溶氧效果對醋酸菌乙醇脫氫酶酶活性有抑制效應(yīng)，進而影響分批醋酸發(fā)酵的結(jié)果。, 蘋果

37、汁固定化醋酸發(fā)酵,1 材料與方法 1.1菌種與培養(yǎng)基： 1.2材料與儀器 1.2.1原料：蘋果濃縮汁 1.2.2固定化載體：褐藻酸鈉（氯化鈣），玉米棒。 1.2.3儀器：DHL-A電腦恒流泵（上海滬西分析儀器廠），直徑2cm、高40cm玻璃反應(yīng)柱。 1.3方法 1.3.1醋酸菌活細胞的制備與固定 細胞制備：將醋酸菌試管菌種接種于三角瓶活化培養(yǎng)基，30搖床培養(yǎng)48h左右至酸度1.8-2.0%，5000rpm 離心濃縮20分鐘。, 固定： a包埋法：把濃縮菌液與4%海藻酸鈉溶液以14比例混合均勻，用9號注射器將混合液滴入3%CaCl2溶液中，低溫固化2h后用無菌水洗滌，即得直徑為3mm左右的凝膠顆

38、粒。 b吸附法：將濃縮菌液以11與直徑4mm左右的碎玉米棒混合均勻，低溫吸附4h。 活化:將固定化細胞于活化培養(yǎng)液中，30搖床活化48小時。,3 結(jié)論 3.1蘋果汁固定化醋酸發(fā)酵比分批發(fā)酵周期短，適合于流動膜固定化發(fā)酵。流動膜固定化搖床發(fā)酵的產(chǎn)酸速度、酒精轉(zhuǎn)酸率高于固定膜醋酸發(fā)酵和分批發(fā)酵。 3.2在固定化搖床發(fā)酵中，發(fā)酵溫度、發(fā)酵液酒精含量、搖床轉(zhuǎn)速、固定化菌的相對裝量影響醋酸菌的增殖和發(fā)酵結(jié)果；蘋果汁適宜的固定化搖床發(fā)酵條件為：酒精度4.5%，溫度30，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，固定化菌與發(fā)酵液體積比1:2，產(chǎn)酸速度0.8g/L.h，酒精轉(zhuǎn)酸率75%，發(fā)酵周期42小時。采用連續(xù)分割流加50%體

39、積的發(fā)酵液可實現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵時間24小時可維持產(chǎn)酸速度0.72g/L.h，酒精轉(zhuǎn)酸率74%。,3.3蘋果汁采用固定膜醋酸發(fā)酵，發(fā)酵可在60小時內(nèi)完成，但發(fā)酵效率明顯低于流動膜發(fā)酵，影響產(chǎn)酸速度、酒精轉(zhuǎn)酸率、酸度等發(fā)酵結(jié)果的主要因素是通氣狀況和發(fā)酵液流動的均勻程度。采用吸附法固定膜，由醋醅中分離得到的菌種CP1比AS1.41有更好的適應(yīng)性。,4 關(guān)于固定化技術(shù)條件的討論 固定化醋酸菌發(fā)酵的實質(zhì)是醋酸菌不斷產(chǎn)生，發(fā)酵產(chǎn)物不斷分離，菌體的增殖受固定方法和發(fā)酵液、發(fā)酵條件相關(guān)；實現(xiàn)良好的醋酸發(fā)酵效率要保持菌體的穩(wěn)定增長，同時又有保持良好的發(fā)酵條件，包括發(fā)酵液的酒精度、溫度、通氧和溶氧效果，由搖床流動

40、膜發(fā)酵試驗可以看出酒精度、轉(zhuǎn)速、固定化菌體的相對裝量影響發(fā)酵結(jié)果，其中轉(zhuǎn)速、菌體裝量都與溶氧有關(guān)，理論上吸附膜菌體的增殖應(yīng)好于固體膜，由固定膜發(fā)酵可看出發(fā)酵液的循環(huán)速度影響發(fā)酵結(jié)果，說明通氧和溶氧狀況條件控制是提高醋酸發(fā)酵效率的主要途徑，本試驗反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，空氣分布方式、停留時間、溶氧效率、菌體對溶氧的利用率和循環(huán)過程中酒精損失是影響試驗結(jié)果的主要因素，尤其是影響酒精轉(zhuǎn)酸率的提高。影響固定化發(fā)酵效率的因素較復(fù)雜，包括固定化方法、載體、反應(yīng)器結(jié)構(gòu)形式等，主要因素是氧的傳遞效率問題，進一步研究不同固定化載體、方法對醋酸發(fā)酵中菌體增殖和酶活影響規(guī)律是設(shè)計和改進反應(yīng)器的基礎(chǔ)，同時有利于促進固定化發(fā)酵

41、技術(shù)的應(yīng)用和我國傳統(tǒng)固態(tài)食醋生產(chǎn)工藝的改進。, 蘋果醋風(fēng)味物質(zhì)鑒定分析與提高酯香的措施,1 材料與方法 1.1 儀器與試劑 1.1儀器：GC-17A氣相色譜儀。GC-MS QP-5000型（日本島津公司產(chǎn)）；NIST95質(zhì)譜數(shù)數(shù)據(jù)庫。 1.2 實驗條件 1.2.1 GC條件：色譜柱：25m0.32mm0.25um，F(xiàn)FAP彈性石英毛細管柱（SGE公司產(chǎn)）；FID檢測器；分流進樣，進樣比為28；He為載氣；汽化室溫度230，檢測器溫度230，進樣量為2ul。 1.2.2 MS（質(zhì)譜）條件：掃描方式，EI源，能量70ev；質(zhì)量范圍：29.0-350.0；掃描速度：1000/s；掃描間隔：0.5s；

42、閾值：1000,2 結(jié)果與分析,圖5-1蘋果醋中風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜圖譜,2.1 醋樣、酒樣的色譜-質(zhì)譜聯(lián)合鑒定結(jié)果,鑒定蘋果醋樣、蘋果酒樣、液態(tài)法糧食醋樣中的風(fēng)味物質(zhì)，從蘋果醋中出50種物質(zhì)，糧食醋中67種，蘋果酒中46種。醋樣中含量在0.1 mg/L以上可計算的風(fēng)味物質(zhì)有27種，包括7種酯類、8種酸類、8種醇類、3種酮類，蘋果醋風(fēng)味物質(zhì)與糧食醋有質(zhì)的差別，主要差別體現(xiàn)在其庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸、3-甲基丁酸、2，3-丁二醇（左旋）、2，3-丁二醇（內(nèi)消旋）明顯低于糧食醋，而甘油明顯高于糧食醋；5個蘋果醋樣品中總體上酯香含量各有特點，國光、濃縮汁樣品中乙酸乙酯含量較低，陸奧醋樣中各

43、種酯香含量較高且均衡。,2.2發(fā)酵過程主要酯香成分變化與提高酯香含量的效果分析 采用上述GC分析條件分別分析濃縮汁和陸奧酒樣、醋樣中的6種主要酯香成分乙酸甲酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁內(nèi)酯 ； 按同樣條件分析常溫儲存1年、熱處理和加酯化酶熱處理10天、輻照處理10天、菌種混合發(fā)酵、產(chǎn)香酵母發(fā)酵2天的蘋果醋樣和山西香醋中的6種主要酯香成分。,3 結(jié)論 3.1蘋果醋中含50種以上的風(fēng)味物質(zhì)，其中可計算的風(fēng)味物質(zhì)有27種，包括7種酯類、8種酸類、8種醇類、3種酮類；陸奧蘋果醋中風(fēng)味物質(zhì)種類、數(shù)量高于其它蘋果品種，且酯香成分含量均衡；靜置法分批發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)種類、數(shù)量高于搖床法和固定法

44、；醋酸菌種對風(fēng)味物質(zhì)種類、數(shù)量影響不大。 3.2蘋果醋中的主要酯香成分有乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，與糧食醋的主要酯香差別在乳酸乙酯的含量；發(fā)酵結(jié)束的新蘋果醋中乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯分別達到20mg/L、70mg/L、15mg/L、700 mg/L以上。,3.3酯化酶、產(chǎn)香酵母、菌種混合發(fā)酵、輻照、熱處理措施都可不同程度增加酯類含量，利用產(chǎn)酯酵母AS1300效果最明顯；輻照可增加乙酸乙酯，熱處理同時加酯化酶可明顯增加乙酸乙酯；菌種混合發(fā)酵可增加乙酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，141與101混合增加乙酸乙酯明顯，141與AM2混合可增加己酸乙酯。 4 討論 香氣成分本身

45、為不穩(wěn)定的微量物質(zhì)，除受本身特性影響外，蘋果醋香氣成分種類和含量受蘋果品種、酒精發(fā)酵與醋酸發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝、殺菌措施、陳釀時間等多種因素的影響。由試驗結(jié)果可以看出不同蘋果品種決定蘋果醋的酯香特征，陸奧蘋果醋具有富含乙酸乙酯的酯香典型性；,醋酸菌具有一定的產(chǎn)香能力，但醋酸發(fā)酵氧化、散失造成香氣物質(zhì)含量下降，使利用醋酸菌增香受到局限；酯化反應(yīng)為緩慢的可逆化學(xué)反應(yīng)，且受溫度、酸度、醇含量影響，陳釀時間越長，反應(yīng)越徹底，即使加溫加酶陳放短時間內(nèi)對提高酯香效果受到一定限制，而且對蘋果醋的色澤有影響；因此采取品種、菌種、酶處理等綜合增香措施聯(lián)合提高香氣是今后研究和應(yīng)用的方向，另外不同發(fā)酵工藝技術(shù)會造成不

46、同程度的香氣散失，加強保香技術(shù)措施研究與應(yīng)用是提高香氣風(fēng)味質(zhì)量的重要途徑。,蘋果汁醋酸發(fā)酵有機酸分析,1 材料與方法 1.1儀器 高效液相色譜儀（Waters）；包括510型泵，U6K進樣器，M-490型UV檢測器（MicrobondapaKC18柱，25cm4.6mmID，10m），檢測波長200nm,TGL臺式離心機，N-2000雙通道色譜工作站。 1.4測定方法 壓力：90kg/cm2,進樣：10l,流速：0.55ml/min，柱溫：室溫， 待數(shù)據(jù)處理積分參數(shù)最佳化后，輸入平均校正曲線和分析程序參數(shù)，連續(xù)進標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品，每3個樣品校正一次，分析樣品時輸入樣品重量和計算系數(shù)。樣品超濾后稀釋4倍進樣。,2 結(jié)果與分析 按上述方法、條件測定18個樣品的7種有機酸，各醋樣和酒樣E1的色譜圖，各樣品的有機酸含量。,圖6-1 101樣品的HPLC有機酸分析圖譜,1草酸 2 酒石酸 3蘋果酸 4 乳酸 5乙酸 6檸檬酸 7琥珀酸,3 結(jié)論與討論 3.1原汁蘋果發(fā)酵醋中的有機酸除主要含醋酸外，還含有蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、草酸和微量的乳酸，其中