人纖溶酶原kringle區(qū)缺失突變體的畢赤酵母表達(dá)、產(chǎn)物純化及鑒定作者：陳武，莫煒，張艷玲，宋鋼，宋后燕【摘要】 目的 研究人纖溶酶原 kringle 區(qū)缺失突變體(PLGK)的畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)、產(chǎn)物純化及理化性質(zhì)鑒定。方法 采用7.5 L發(fā)酵罐對工程菌 PLGK/GS115 進(jìn)行高密度培養(yǎng)、甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，培液經(jīng)離心、超濾、離子交換層析、凝膠濾過、透析后冷凍干燥。等電聚焦電泳、HPLC、質(zhì)譜分別檢測 PLGK 等電點(diǎn)、純度和分子量;纖維蛋白平板、肽底物S2403 分別測定PLGK 激活后的纖維蛋白和酰胺水解活性。 結(jié)果 7.5 L高密度發(fā)酵可獲得約為400 mg/L培液的表達(dá)量，經(jīng)三步純化后制備的PLGK純度大于96%。理化分析顯示PLGK的等電點(diǎn)為7.57.8，分子量：27. 787 kD，比活性：23.6 U/mg。 結(jié)論 初步建立了PLGK的酵母高密度發(fā)酵及純化工藝，所制備半成品活性與血漿提取的PLG相近，具備放大生產(chǎn)和應(yīng)用的潛力。 【關(guān)鍵詞】 畢赤酵母 kringle 區(qū) 纖溶酶原 缺失突變體 純化Abstract:Objective To investigate the expression,purification and characters of the kringle domain deletion mutant of human plasminogen(PLGK)in Pichia pastoris.Methods Fermentation at high density (A600>200) in a 7.5 L fermenter was carried out and PLGK was purified from the culture broth in a three stepprocess: ultrafiltration,gel filtration,ion exchange chromatography,and was lyophilized after dialysis. The IFE,HPLC and LCMS were used to detect its isoelectric point (IP),purity,and molecular weight (MW). The fibrinolytic activity and amidolytic activity were measured with fibrin plate and chromogenic peptide substrate S2403 respectively.Results Fermentation in 7.5 L scale yielded an expression level of approximately 400 mg PLGK per liter fermentation broth. Through three steps of purification,the PLGK had a purity of over 96%. The exact MW of PLGK was 27.787 kD examined by LCMS and its IP was 7.5-7.8.Conclusion A pilot expression and purification technology of PLGK in Pichia pastoris cultured at high density has been set up. The activities of intermediate production are comparable to that of plasminogen extracted from human plasma,indicating a good perspective in scale up and application.Key words:deletion mutant; kringle domain; Pichia pastoris; plasminogen; purification 人纖溶酶原(plasminogen,PLG)是人體纖溶系統(tǒng)的主要成分，在體內(nèi)經(jīng)纖溶酶原激活劑(plasminogen activator,PA)激活后，轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶 (plasmin,PLM)，不僅發(fā)揮溶栓作用，還參與體內(nèi)一系列與蛋白水解有關(guān)的生理病理過程，如炎癥、組織修復(fù)、排卵、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。長期以來，纖溶酶被認(rèn)為是一種具有潛力的直接溶栓藥物，但由于分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、富含糖鏈且易自身降解，采用大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)效率較低1,2，因此對PLG進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造是近年來研究的熱點(diǎn)。本室宋鋼等采用畢赤酵母表達(dá)了一種纖溶酶原kringle 區(qū)缺失突變體(PLGK)，經(jīng)激活后，具有較好的纖溶活性3。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，深入研究了高密度發(fā)酵和純化工藝，使其更適合大規(guī)模制備，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為纖溶酶的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1 實(shí)驗(yàn)材料畢赤酵母表達(dá)菌PLGK/GS115由實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建;纖溶酶、纖溶酶原、三肽化合物S2403 (L焦谷氨酰L苯丙氨酰L賴氨酸對硝基苯胺)購自Sigma公司;YNB、酵母提取物購自Difco公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純;Sephacryl S100 HR、Superdex 75、 SPSepharose FF(美國Amersham Pharmacia公司);3 kD、50 kD超濾膜(Millipore Pellicon);Proflux M12超濾儀(Millipore);BIOFLO 3000型7.5 L發(fā)酵罐及C25kC型溫控?fù)u床(美國NBS公司)。2 方 法2.1 PLGK表達(dá)菌7.5 L罐批發(fā)酵采用NBS 7.5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，發(fā)酵條件控制：溫度29.5 (PID模式)，pH5.1 (PID模式)，溶氧(35.05.0)% (Agit模式)，攪拌300700 r/min (D.O.模式)。甘油補(bǔ)加：初始速率為0.6 mLL-1h-1，2 h內(nèi)逐漸升高至9 mLL-1h-1，此后維持此速率，待A600達(dá)到150左右，停止補(bǔ)加甘油。甲醇誘導(dǎo)：初始速率為1 mLL-1h-1，8 h內(nèi)逐漸升高至12 mLL-1h-1，以后維持此速度，并根據(jù)溶氧值和pH值的變化，調(diào)整補(bǔ)加甲醇的速率，直至誘導(dǎo)20 h。2.2 PLGK的分離純化發(fā)酵液以8 000 r/min,4 離心 30 min，上清用截留分子量50 kD超濾膜除去殘留菌體及沉淀，再以截留分子量3 kD超濾膜濃縮至原體積的1/10。將濃縮液進(jìn)行Sephacryl 100凝膠過濾層析 (層析柱100 cm7.5 cm)，用0.025 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)洗脫，按吸收峰收集各組分，檢測活性、SDSPAGE分析，合并活性組分再進(jìn)行SPSepharose FF層析 ( 層析柱20 cm5 cm)。先將SPSepharose FF層析柱用A液 (pH 6.0,0.025 mol/L枸酸緩沖液 ) 平衡，將上述凝膠過濾后合并液1 L上樣，先以A液洗脫，至第一峰止，再以A液與B液(pH 6.0,0.025 mol/L枸櫞酸緩沖液+1 mol/L NaCl)進(jìn)行線形梯度洗脫，按吸收峰收集各組分，檢測活性、SDSPAGE分析，合并活性組分、透析除鹽、加賦形劑甘露醇(終濃度3%)，以0.22 m的膜濾過除菌，分裝、凍干，4 冰箱保存。以上分離純化過程采用Amersham Pharmacia 層析系統(tǒng)在4 冷房中進(jìn)行。2.3 PLGK的鑒定2.3.1 PLGK的純度鑒定 凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1 mg/mL，色譜柱為C18300A(2.1 cm 10 cm，3.5 m )。色譜分離條件：流動相A(95% 水，5% 乙腈，0.05% TFA)，流動相B(5% 水，95% 乙腈，0.05% TFA)，30 min內(nèi)A相由100%降到0%，B相由0%升高到100%，流速0.2 mL/min，樣品室溫度10 ，柱溫20 。2.3.2 PLGK分子量的測定 采用LCMS測定PLGK分子量。LC方法同上，質(zhì)譜檢測條件：質(zhì)譜源電壓3.5 kV，毛細(xì)管電壓28 V，質(zhì)譜質(zhì)量數(shù)范圍8002000。2.3.3 PLGK的等電點(diǎn)的測定 采用固相pH梯度預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠(T=5%，C=3%，pH 310，110 mm 110 mm 1 mm)，水平電泳的等電聚焦方法測定樣品的等電點(diǎn)。電泳條件：100 V，15 min; 200 V， 15 min; 400 V， 60 min。至電流讀數(shù)為0 mA。凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1.0 mg/mL，每孔上樣 5 L，考馬斯亮藍(lán)R250染色。2.4 PLGK的酶學(xué)性質(zhì)2.4.1 纖維蛋白板法測定PLGK比活性 1% 瓊脂糖凝膠板中含有0.05 mol/L pH 7.4 PBS、1.5% 纖維蛋白、800 U/mL尿激酶、0.02% NaN3。凝膠打孔后，各孔中加等體積的樣品液或PLG標(biāo)準(zhǔn)品，37 濕盒保溫過夜。游標(biāo)卡尺測定各孔溶圈直徑，以溶圈直徑的對數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品活性作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的比活性。2.4.2 tPA激活PLGK和PLG 分析 分別將PLGK和PLG干粉以適量0.02 mol/L pH 7.4 PBS溶解，并分別以2001摩爾比與組織型纖溶酶原激活劑 (tPA) 進(jìn)行混合，37 水浴激活，每10分鐘間隔取樣50 L，還原性 SDSPAGE分析。同時通過底物 S2403進(jìn)行活性測定4，并以等摩爾濃度纖溶酶 (Sigma,Missouri,USA) 為標(biāo)準(zhǔn)，每個樣本重復(fù)測定5次。3 結(jié) 果3.1 發(fā)酵過程菌密度及比活性測定由圖1可見，甲醇誘導(dǎo)后，酵母生長速率明顯減緩。至發(fā)酵結(jié)束時，A600約為280左右。SDSPAGE顯示誘導(dǎo)后4 h，32 kD處出現(xiàn)清晰條帶，并隨誘導(dǎo)時間逐漸加深，其培液可在纖維蛋白板上形成明顯溶圈。至20 h時PLGK表達(dá)進(jìn)入平臺期，通過光密度掃描分析顯示PLGK表達(dá)量約占培液蛋白總量的32%，纖維蛋白板測定比活性為4.8 U/mL。3.2 發(fā)酵液PLGK的純化經(jīng)超濾、Sepharcryl S100、SepharoseSP FF后，所得PLGK半成品純度達(dá)96%以上，每升培養(yǎng)液獲得PLGK約200 mg，比活性為23.6 U/mg，純化過程分析見表1。表1 發(fā)酵液PLGK純化過程的分析3.3 純度鑒定及分子量、等電點(diǎn)測定HPLC測定半成品的純度大于96%;LCMS測定PLGK的分子量為27.787 kD;等電聚焦測定PLGK等電點(diǎn)為7.57.8(圖2)。3.4 tPA 激活PLGK和PLG分析還原性SDSPAGE后凝膠光密度掃描可見：37 激活40 min時，80%以上的PLGK和PLG被激活。PLGK激活后顯示26 kD和5 kD兩個條帶(圖3A);而PLG激活后產(chǎn)生PLM，由于部分自身降解，因此顯示66 kD、26 kD和11 kD的3個條帶(圖3B)。以三肽底物S2403進(jìn)行活性測定，證明激活后的PLGK和PLG均具有水解S2403活性，與相同摩爾濃度的纖溶酶相比，37 40 min所產(chǎn)生的水解活性皆在80%以上 (n=5)(圖3C)。4 討 論人PLG是由多個結(jié)構(gòu)域組成的糖蛋白，包括N端多肽(NTP)、5個同源的kringle區(qū)(K1-K5)、絲氨酸蛋白酶區(qū)(SP)。PA特異性水解PLG Arg561Val562,形成由二硫鍵維系的雙鏈活性纖溶酶。在堿性條件下(pH 11.0)，纖溶酶可水解PLG Arg530Lys531，產(chǎn)生由5個kringle區(qū)組成的重鏈和由SP組成的輕鏈Lys531Asn791，后者稱為微小纖溶酶原，經(jīng)PA激活后具有纖溶活性4。本室沈俊卿等構(gòu)建了一種由Phe546Asn791組成的PLGK，并通過E coli.獲得了表達(dá)，但由于大腸桿菌作為原核生物，不具備蛋白質(zhì)翻譯后加工能力，蛋白復(fù)性成為關(guān)鍵問題。PLGK具有6對二硫鍵，復(fù)性十分困難，雖經(jīng)努力，復(fù)性后顯示出纖溶活性，但活性很低5。宋鋼3等采用酵母表達(dá)，獲得高活性的PLGK。J Wang 等采用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)PLG Pro544Asn791，產(chǎn)物同樣具有較高活性，但表達(dá)量僅為312 mg/L培液，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求6。Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的極具潛力的酵母表達(dá)系統(tǒng)，既具有真核生物蛋白翻譯后加工的能力，又具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、操作簡便的特點(diǎn)，通過分泌性載體可將目的蛋白釋放到培液中，方便下游的分離純化;而且酵母可以在高密度下生長良好，據(jù)報道在合適的培養(yǎng)條件下，酵母菌密度A600可達(dá)到1 000以上，外源蛋白表達(dá)量可達(dá)5 g/L培液。本實(shí)驗(yàn)采用7.5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度培養(yǎng)，至發(fā)酵結(jié)束時A600約為280，每升培液的表達(dá)量約為400 mg，比搖瓶培養(yǎng)提高了10倍左右。由于巴斯德壁赤酵母沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以外源基因需整合入酵母染色體中，整合方式包括同源雙交換引起的基因置換和位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入。前者使宿主的AOX1結(jié)構(gòu)基因被外源基因表達(dá)盒所替換，因而使宿主失去大部分甲醇利用能力，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，即Muts (methanol utilization slow)表型：后者則并未破壞宿主的AOX1結(jié)構(gòu)基因，利用甲醇能力強(qiáng)，即Mut+ (methanol utilization plus) 表型。本實(shí)驗(yàn)所用工程菌的AOX1基因被PLGK基因取代，表現(xiàn)為甲醇利用緩慢，在甲醇誘導(dǎo)后，菌體生長速度明顯減緩。此外，過高的甲醇會對Muts酵母產(chǎn)生明顯的毒性作用，影響外源蛋白的表達(dá)。因此，優(yōu)化甲醇補(bǔ)加速率可進(jìn)一步提高PLGK表達(dá)水平。此外，由于自然界中廣泛存在PA，如葡激酶、鏈激酶、凝血酶等，易激活表達(dá)的PLGK發(fā)生自身降解，以及酵母本身存在的蛋白酶，均會導(dǎo)致PLGK表達(dá)、分泌、純化過程中出現(xiàn)降解。因此，本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)時加入1%的酪蛋白水解物，提供給蛋白酶足夠的底物，有效地降低了酵母蛋白水解酶及PLGK的自身降解作用。當(dāng)然，也可以通過降低培液的pH值、突變或缺失酵母宿主主要蛋白酶基因等方法提高外源表達(dá)蛋白在酵母菌中的穩(wěn)定性。總之，本實(shí)驗(yàn)初步建立了PLGK Pichia pastoris工程菌高密度發(fā)酵、產(chǎn)物純化工藝，并對制備的PLGK半成品進(jìn)行了理化鑒定，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前，人PLM及其突變體已用于多種疾病的治療研究，如心、腦血管梗死、深靜脈血栓形成以及阿茨海默氏病和多種眼科疾病等7，且與某些同類藥物相比具有無免疫原性、低毒副作用、效率高等優(yōu)點(diǎn)8，因此加強(qiáng)PLG生產(chǎn)工藝以及結(jié)構(gòu)與功能的研究具有重要意義。【參考文獻(xiàn)】 1 GONZALEZGRONOW M,GRENETT H E,FULLER G M,et al. 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