高表達JNK3促進表阿霉素誘導的細胞凋亡【摘要】 目的： 構建人cJun氨基末端激酶3（JNK3）真核表達載體，轉染HEK293細胞，建立穩(wěn)定表達細胞系；以表阿霉素作為凋亡誘導劑研究JNK3與細胞凋亡關系. 方法： 以pDBLeuJNK3質粒為模板PCR擴增人JNK3基因全長，DNA重組技術將其定向插入到真核表達載體pcDNA3.1/mycHis B，經(jīng)PCR和酶切鑒定，DNA測序正確，脂質體轉染法轉染HEK293細胞，通過G418選擇培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達細胞系. RTPCR，Western Blot檢測攜帶Myc標簽的JNK3融合蛋白的表達，流式檢測表阿霉素對穩(wěn)定表達JNK3基因的HEK293細胞的促凋亡作用. 結果： 成功構建了pcDNA3.1JNK3真核表達載體并已穩(wěn)定轉入HEK293細胞，建立了穩(wěn)定表達細胞系，成功地表達目的基因；與對照細胞相比表阿霉素能明顯促進高表達JNK3基因的HEK293細胞發(fā)生細胞凋亡. 結論： JNK3穩(wěn)定表達細胞系的建立和高表達JNK3促進表阿霉素誘導的細胞凋亡，為進一步研究JNK3的功能提供了良好的實驗基礎. 【關鍵詞】 CJum氨基末端激酶 真核表達載體 轉染 因表 細胞凋亡0引言cJun氨基末端激酶(cJun Nterminal kinases，JNKs)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)超家族之一. 在脊椎動物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三種基因編碼，表達的JNK1，JNK2，JNK3蛋白主要位于細胞質，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶. JNK3與JNK1，JNK2的不同在于：JNK3有一個與位于JNK1，JNK2的N末端保守的甲硫氨酸殘基融合在一起的延長的N末端區(qū)域1；JNK1，JNK2在組織內(nèi)廣泛表達，JNK3在腦、心臟、睪丸等組織特異表達. 近年來研究發(fā)現(xiàn)JNK3參與神經(jīng)細胞凋亡的調控，可促進缺血、缺氧和有毒化學物質導致的神經(jīng)細胞的凋亡. 目前對JNK3促細胞凋亡機制還不是很清楚. 我們通過構建穩(wěn)定轉染JNK3基因的細胞系，以表阿霉素作為凋亡誘導劑研究JNK3與細胞凋亡的關系，為研究JNK3促進細胞凋亡機制提供細胞模型.1材料和方法1.1材料菌株E.coli JM109，質粒pDBLeuJNK3，pcDNA3.1/mycHis B和HEK293細胞由本實驗室保存. DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（Life Technologies公司）；PCR及酶切產(chǎn)物純化試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒、反轉錄試劑盒（Promega公司）；DNA Marker，DNA限制性內(nèi)切酶(EcoR，Xho)、pyrobest DNA polymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4 DNA連接酶（New England Biolab公司）；Trizol、轉染試劑脂質體lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；AnnexinFITC 試劑盒（晶美生物工程有限公司）；Myc抗體、actin抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG和ECL檢測試劑（Santa Cruz公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1引物設計與合成根據(jù)GenBank登錄的人JNK3基因的序列(序列號為NM_002753)設計引物, 上游引物為：5ccggatatcATGAGCCTCCATTTCTTAT3，下游引物為：5ccgctcgagCGCTGCTGCACCTGTGCTG3，分別在上游引物和下游引物的5端加入EcoRV，XhoI的酶切位點和3個保護堿基，引物由賽百盛公司合成.1.2.2人JNK3基因全長的獲取以pDBLeuJNK3質粒為模板，采用PCR擴增人JNK3基因，全長1269 bp. PCR 50 L反應體系中加pDBLeuJNK3質粒模板1 L，10PCR Buffer 5 L，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 L, 10 mol/L JNK3上下游引物各2 L，pyrobest DNA polymerase 0.25 L，加無菌水至50 L. 反應條件：94 5 min；94 30 s，62 30 s，72 80 s，35個循環(huán)；72 10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定并膠回收純化.1.2.3人JNK3真核表達載體的構建將上述PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1/mycHis B質粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoR和Xho酶切后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉化E.coli JM109感受態(tài)，鋪在含氨芐青霉素的LB平板上篩選，選取陽性克隆進行菌落PCR和酶切鑒定，陽性克隆經(jīng)測序分析后證實并命名為pcDNA3.1JNK3.1.2.4建立穩(wěn)定表達人JNK3的HEK293細胞系HEK293細胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37，50 mL/L CO2 的飽和濕度下培養(yǎng). 待細胞融合至7080時按照Lipofectamine 2000操作說明書進行重組質粒pcDNA3.1JNK3和空質粒pcDNA3.1/mycHis B的轉染. 轉染48 h后，用胰蛋白酶消化細胞，重新鋪在直徑為10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，換含有G418(1400 mg/L)的選擇性培養(yǎng)基加壓培養(yǎng)2 wk，每3 d換液清除死亡細胞，待細胞培養(yǎng)皿中長出肉眼可見的單克隆時挑選單克隆并依次轉移至96孔板、24孔板、6孔板、培養(yǎng)瓶內(nèi)擴大培養(yǎng). 篩選出的穩(wěn)定表達人JNK3和Myc標簽的HEK293細胞系，分別命名為HEK293JNK3細胞和HEK293mock細胞.1.2.5RTPCR檢測JNK3的表達收集HEK293JNK3細胞和HEK293mock細胞，按Trizol試劑說明書抽提細胞總RNA，按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄. 取1 g定量后的RNA，加水補至10 L，70 10 min，加10反應緩沖液2 L，MgCl2 4 L，dNTP 2 L，OligodT 1 L，rRNasin 0.5 L，AMV（15 U）0.75 L. 反應體系共20 L；42 1 h；95 5 min；4 5 min. 以 GAPDH（900 bp）為內(nèi)參進行PCR反應. 在25 L PCR反應體系中加入cDNA模板1 L，10PCR Buffer 2.5 L，2.5 mmol/L dNTP 2 L，10 mol/L JNK3和GAPDH上下游引物各0.5 L，rTaq酶0.15 L，加水補足至25 L，反應條件為：94 5 min；94 30 s，58 30 s, 72 80 s，30個循環(huán)；72 10 min. 取等體積RTPCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析.1.2.6Western Blot 檢測JNK3蛋白的表達收集篩選細胞，用含蛋白酶抑制劑的單去污細胞裂解液裂解細胞，4，12 000 g，離心10 min，收集上清. 對收集的蛋白樣品進行定量，取20 g處理后的蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，電轉移至PVDF膜上，50 g/L 脫脂奶粉室溫振蕩封閉2 h，與12000稀釋后的Myc一抗4 孵育過夜，TBST洗膜3次. 然后與15000稀釋后的HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色系統(tǒng)檢測目的蛋白，顯影.1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡對數(shù)生長期的HEK293JNK3細胞和HEK293mock細胞，調整細胞計數(shù)為2108/L，接種于50 mL 細胞培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，同時加入終濃度為0.2，0.5，1.0 mg/L的表阿霉素，空白對照組加入等量DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，進行Annexin V/PI標記：將細胞懸浮于250 L 結合緩沖液中，調細胞數(shù)為1109 /L, 加Annexin V/FITC 5 L， 20 mg/L碘化丙錠溶液10 L，混勻，室溫避光孵育15 min，用適量稀釋緩沖液稀釋，流式細胞儀檢測.2結果2.1人JNK3基因的擴增PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，所得PCR片段約為1269 bp，與預期的人JNK3 cDNA全編碼區(qū)的長度相符(圖1).2.2真核表達載體pcDNA3.1JNK3的構建和鑒定篩選出的pcDNA3.1JNK3陽性克隆質粒經(jīng)EcoR和Xho酶切后得到2個條帶(圖2)，1條為約1300 bp大小的目的條帶，1條為5500 bp大小的空載體條帶；以pcDNA3.1/mycHis B載體上的通用引物進行測序，證實pcDNA3.1JNK3重組質粒插人片段的序列與人JNK3的cDNA序列完全一致，表明人JNK3的真核表達載體構建成功. 1：DNA Marker(DL 2000)； 2：JNK3 PCR片段.圖1人JNK3基因的PCR擴增（略）1：DNA marker(DL 15 000)； 2：pcDNA3.1/mycHis B； 3：pcDNA3.1JNK3.圖2pcDNA3.1JNK3重組質粒的雙酶切鑒定（略）2.3JNK3穩(wěn)定細胞株的篩選和鑒定提取G418篩選出的穩(wěn)定細胞株HEK293JNK3和HEK293mock細胞中的總RNA，RTPCR檢測JNK3的表達. HEK293JNK3所提RNA能擴增出代表JNK3基因(1269 bp)及內(nèi)參GAPDH基因(900 bp)的條帶；而HEK293mock細胞所提RNA僅能擴增代表內(nèi)參GAPDH基因的900 bp的條帶，說明JNK3基因在穩(wěn)定細胞株中mRNA水平上得到了表達(圖3). 提取HEK293mock和HEK293JNK3細胞中的總蛋白，Western Blot檢測JNK3融合蛋白的表達，HEK293JNK3用Myc抗體檢測到約46 ku的JNK3融合蛋白條帶，而HEK293mock對照細胞則沒有相應的條帶,表明JNK3基因在穩(wěn)定細胞株中蛋白水平上得到了表達(圖4).1：DNA marker(DL 2000)；2：HEK293mock；3：HEK293JNK3.圖3穩(wěn)定細胞株中JNK3的RTPCR分析結果（略）1：HEK293mock； 2:HEK293JNK3.圖4穩(wěn)定細胞株中JNK3融合蛋白的表達（略）2.4流式細胞術檢測表阿霉素誘導的細胞凋亡用0.2,0.5,1.0 mg/L 終濃度表阿霉素處理HEK293mock細胞的凋亡率分別為25%，31%，78%；處理HEK293JNK3細胞的凋亡率分別為38%，61%，93%. 與HEK293mock細胞相比表阿霉素能明顯促進高表達JNK3基因的HEK293細胞發(fā)生細胞凋亡（P0.05）.圖5高表達JNK3促進表阿霉素誘導的細胞凋亡（略）3討論JNK信號通路是MAPK中重要的通路之一. 由JNK1，JNK2和JNK3成員組成，JNK1和JNK2在組織廣泛表達，JNK3局限在大腦、心臟和睪丸表達. 近年來研究發(fā)現(xiàn)JNK3在帕金森綜合征、阿爾茨海默、中風等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用2. JNK3與細胞凋亡密切相關. 穩(wěn)定轉染JNK3p54的PC12細胞，能明顯增強UV和紫杉醇誘導的細胞凋亡3. JNK3和p38促進亞砷酸鈉誘導的皮質神經(jīng)元凋亡4. JNK3基因敲除小鼠可拮抗興奮性毒性氨基酸誘導的海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡5, 減少局部腦缺血缺氧導致的神經(jīng)細胞凋亡 6-7.由于JNK3在組織表達非常局限，與細胞凋亡的關系又非常密切. 我們以pDBLeuJNK3質粒為模板，通過PCR的方法獲得人JNK3基因全長，并成功地將其插入pcDNA3.1/mycHis B載體的CMV啟動子下面，構建了JNK3的真核表達載體. 經(jīng)PCR和酶切鑒定后，用載體通用引物測序證明序列準確無誤后，通過脂質體介導將pcDNA3.1JNK3重組載體轉染HEK293細胞，通過G418篩選建立了穩(wěn)定表達細胞株，即HEK293JNK38. 以空質粒轉染HEK293細胞為對照, 用RTPCR和Western Blot方法分別從轉錄水平和蛋白水平檢測了JNK3基因的表達，結果表明重組人JNK3基因在HEK293細胞中能被有效地轉錄和翻譯，表明構建穩(wěn)定表達JNK3細胞株成功. 以表阿霉素作為凋亡誘導劑，與空質粒轉染HEK293細胞對照相比表阿霉素能明顯促進高表達JNK3基因的HEK293細胞發(fā)生細胞凋亡，為進一步研究JNK3促進細胞凋亡機制提供了細胞模型.【參考文獻】 1 Gupta S, Barrett T, Whitmarsh AJ, et al. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factorsJ. EMBO J, 1996, 15(11):2760-2770. 2 Resnick L, Fennell M. Targeting JNK3 for the treatment of neurodegenerative disordersJ. Drug Discov Today, 2004,9(21): 932-939. 3 Waetzig V, Herdegen T. A Single cJun Nterminal Kinase Isoform(JNK3p54)Is an Effector in Both Neuronal Differentiation and Cell DeathJ. 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