Genistein對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)及CyclinD1基因和bcrabl融合基因表達(dá)的影響作者：王瑋孫秉中于文彬馮琦【關(guān)鍵詞】染料木黃酮關(guān)鍵詞:染料木黃酮；CyclinD1基因；CDK4蛋白；bcr-abl融合基因摘要:目的研究Genistein抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制及對(duì)CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表達(dá)的影響.方法用RT-PCR方法檢測(cè)Genistein作用于K562細(xì)胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表達(dá)變化，用免疫熒光、流式細(xì)胞儀和電鏡檢測(cè)CDK4蛋白的表達(dá)、細(xì)胞周期及凋亡.結(jié)果K562細(xì)胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mR-NA和CDK4蛋白表達(dá)陽性，用Genistein與K562細(xì)胞共同孵育后，bcr-abl融合基因的mRNA表達(dá)陰性，CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞阻滯于G2/M期，K562細(xì)胞出現(xiàn)凋亡.結(jié)論bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562細(xì)胞中高表達(dá)，Genistein能使K562細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，誘導(dǎo)其凋亡，抑制bcr-abl基因的mRNA表達(dá)，并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表達(dá)下降，表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4對(duì)慢粒發(fā)展存在內(nèi)在關(guān)系.Keywords:Genistein；CyclinD1gene；CDK4protein；bcr-ablfusiongeneAbstract:AIMToinvestigatethemechanismofhowGenis-teinrestrainsthegrowthofK562cells，anditseffectontheexpressionofCyclinD1geneandbcr-ablfusiongene.METHODSGenisteinwasincubatedwithK562cells，themRNAofCyclinD1geneandbcr-ablfusiongenewereexam-inedbyRT-PCRandtheexpressionofCDK4protein，cellcy-cleandapoptosiswereexaminedbyimmunofluorescence，flowcytometryandelectron-microscopeatthesametime.RESULTSTheexpressionofCyclinD1geneandbcr-ablfu-siongenemRNAwaspositiveinK562cells.AfterK562cellswasincubatedwithGenistein，theexpressionofbcr-ablfusiongenemRNAandCDK4proteinwerenegative，mRNAofCyclinD1genedecreased.AndthecellwasblockedinG2/Mphase.Usingelectron-microscopewecouldobservethecellsapoptosis.CONCLUSIONCyclinD1geneandbcr-ablfusiongenearehighlyexpressedinK562cells.ThegrowthofK562cellscouldberestrainedbyusingGenistein，whichinducesK562cellsapoptosis，represstheexpressionofbcr-ablfusiongene，andmakesCyclinD1andCDK4proteinde-crease.ThisilluminatesthatCyclinD1gene，CDK4proteinandbcr-ablfusiongenemayhaverelationtothepathogenesisofchronicmyelogenousleukemia（CML）.0引言腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)密切相關(guān)，細(xì)胞周期有關(guān)的原癌基因（如CyclinD1）與細(xì)胞增殖相關(guān)的癌基因（如bcr-abl）在腫瘤發(fā)展上存在密切關(guān)系.已有文獻(xiàn)1，2報(bào)道，用RT-PCR方法檢測(cè)到K562細(xì)胞中CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA高表達(dá)，我們進(jìn)一步用酪氨酸激酶抑制劑Genistein作用于K562細(xì)胞后，觀察CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表達(dá)的變化，同時(shí)觀察Genistein對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)、周期變化及凋亡的影響，探討其抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制.1材料和方法1.1材料K562細(xì)胞株由西京醫(yī)院血液科于文強(qiáng)博士惠贈(zèng).Genistein購(gòu)于美國(guó)Sigma化學(xué)制劑公司，CDK4單抗購(gòu)于美國(guó)SantaCruz化學(xué)制劑公司（由博士德公司提供），擴(kuò)增CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的引物由大連寶生物Takara公司合成.1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)K562細(xì)胞用含100mL・；L-1胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置37，50mL・；L-1CO2孵箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞.繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，每隔24h臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞存活率.1.2.2RT-PCR檢測(cè)CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為3109・；L-1，加入40mg・；L-1的Genistein，置37，50mL・；L-1CO2孵箱中培養(yǎng)48h后，采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增Cy-clinD1基因的引物順序:上游引物5-CTGGCCAT-GAACTACCTGGA-3，下游引物5-GTCACACT-TGATCACTCTGG-3，擴(kuò)增483個(gè)bp1；擴(kuò)增bcr-abl基因引物序列:上游引物5-GATGCTGAC-CAACTCGTGTG-3，下游引物5-ACACCATTCC-CCATTGTGAT-3，擴(kuò)增376個(gè)bp3，10g・；L-1瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物.1.2.3檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡及CDK4單抗用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取2106個(gè)細(xì)胞，700mL・；L-1乙醇（-20預(yù)冷）固定24h，離心，棄去乙醇，細(xì)胞重懸浮于PBS液中離心洗滌2次，去上清，細(xì)胞重懸浮于DNA染液中（含碘化丙錠），室溫避光染色30min，取波長(zhǎng)488nm藍(lán)色激發(fā)光檢測(cè)4.參照文獻(xiàn)5檢測(cè)CDK4單抗.電鏡觀察K562細(xì)胞凋亡形態(tài).2結(jié)果2.1Genistein抑制K562細(xì)胞株生長(zhǎng)Genistein濃度40mg・；L-1時(shí)即可明顯抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，50.0%細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制時(shí)間約48h，作用72h內(nèi)臺(tái)盼藍(lán)染色未見死細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如Fig1.2.2CyclinD1基因和bcrabl融合基因的mRNA表達(dá)降低K562細(xì)胞中CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表達(dá)均為陽性.Genistein作用48h后，bcr-abl融合基因的mRNA表達(dá)陰性，CyclinD1基因mRNA表達(dá)降低，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光亮度輕度減弱（Fig2，3）.2.3Genistein阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)于G2/M期及誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)K562細(xì)胞S期細(xì)胞占47.7%，提示其DNA的合成、復(fù)制活躍，細(xì)胞增殖旺盛（Fig4）；Genistein與K562細(xì)胞共同作用后，阻斷K562細(xì)胞生長(zhǎng)主要在G2/M期，使G2/M期細(xì)胞數(shù)大量增加，S期細(xì)胞明顯減少（19.5%），并在細(xì)胞周期圖中的二倍體峰前可見一亞二倍體峰-凋亡峰（apoptosispeak），提示其能抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡（Fig5）.圖1圖3略2.4CDK4蛋白的表達(dá)下降K562細(xì)胞中CDK4蛋白表達(dá)陽性（平均熒光強(qiáng)度2.10），Genistein作用24h后，CDK4蛋白的表達(dá)水平明顯下降（平均熒光強(qiáng)度0.807，F(xiàn)ig6，7）.圖4圖7略2.5電鏡觀察到K562細(xì)胞凋亡Genistein作用24h后，K562細(xì)胞變小，胞質(zhì)輕度變性腫脹，核濃縮深染，核膜清楚，染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀，靠近核膜邊緣（Fig8）.并可見早期凋亡小體，核碎裂呈團(tuán)塊狀散布于胞質(zhì)，被細(xì)胞膜所包繞，其中無各種細(xì)胞器.3討論K562細(xì)胞為慢性粒細(xì)胞白血?。＃┘弊兗?xì)胞株，含有Ph染色體，產(chǎn)生bcr-abl融合基因，編碼p210Bcr-Abl蛋白，具有異常的高酪氨酸激酶活性，使細(xì)胞惡性增殖6.近來研究發(fā)現(xiàn)慢粒發(fā)病和凋亡受抑7以及細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)8有密切聯(lián)系，Genis-tein治療慢粒的機(jī)制主要是阻斷信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡.其是否在基因水平及細(xì)胞周期調(diào)控角度發(fā)揮抗腫瘤作用，值得進(jìn)一步研究.Carler等9研究發(fā)現(xiàn)Genistein能誘導(dǎo)慢?；颊吖撬柚蠦cr/Abl陽性集落進(jìn)入凋亡，我們用Genis-tein作用于K562細(xì)胞后，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯，說明Genistein除能抑制p210蛋白的酪氨酸激酶活性外，尚能從促進(jìn)凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期角度抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng).其誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制，主要是阻斷了與bcr-abl相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑（如Ras途徑）后，抑制抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，并促使凋亡基因fas等發(fā)揮作用10.此外，細(xì)胞周期的改變，亦是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因素，因G2/M期細(xì)胞明顯增加，變異基因bcr-abl被阻滯于G2/M期檢測(cè)點(diǎn)，不能進(jìn)入M期進(jìn)行有絲分裂，使其在退出細(xì)胞周期過程中逐漸發(fā)生凋亡.圖8略我們發(fā)現(xiàn)，Genistein能抑制bcr-abl融合基因的mRNA表達(dá).Carmelo等2的研究已排除Genistein通過抑制bcr-abl的轉(zhuǎn)錄起作用的機(jī)制，故可能是抑制了bcr-abl基因的復(fù)制.從細(xì)胞周期角度分析，Genistein作用K562細(xì)胞后使S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，導(dǎo)致DNA的合成、復(fù)制減少，變異基因bcr-abl的合成和復(fù)制相應(yīng)減少，故bcr-abl融合基因的表達(dá)降低.同時(shí)發(fā)現(xiàn)Genistein能使cyclinD1基因的mR-NA表達(dá)下降.Cortez等11研究bcr-abl融合基因的高酪氨酸激酶活性，可使造血細(xì)胞在失去生長(zhǎng)因子的條件下激活CDK蛋白.本實(shí)驗(yàn)用Genistein抑制了K562細(xì)胞中的高酪氨酸激酶活性后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)能抑制CDK4蛋白的表達(dá)，而CyclinD1的表達(dá)依賴于CDK4蛋白的活化，因而CyclinD1基因的表達(dá)水平下降.在K562細(xì)胞中同時(shí)有CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的高表達(dá)，表明CyclinD1基因和bcr-abl基因?qū)β０l(fā)展可能有密切的聯(lián)系.Cy-clinD1的過表達(dá)使細(xì)胞周期中G1/S期檢測(cè)點(diǎn)功能低下，變異的bcr-abl癌基因失去調(diào)控而進(jìn)入S期復(fù)制，不能啟動(dòng)凋亡途徑而凋亡，還能使細(xì)胞周期及癌基因的復(fù)制加速，故CyclinD1基因?qū)cr-abl融合基因的表達(dá)起促進(jìn)作用.但原癌基因CyclinD1單獨(dú)作用不能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化12，必須通過癌基因bcr-abl而發(fā)揮作用.參考文獻(xiàn):1UchimaruK，TaniguchiT，YoshikawaM，AsanoS，ArnoldA，F(xiàn)ujitaT，MotokuraT.DetectionofCyclinD1（bcl-1，PRAD1）over-expressionbyasimplecompetitivereversetranscription-polymerasechainreactionassayint（11，14）（q13，q32）-bearingB-cellmalignanciesand/orMantlecelllymphomaJ.Blood，1997；89（3）:965-974.2CarmeloCS，GianpietroD，LinaM，EsterR，DanielaG，Anto-nioB，CamilloA，GabriellaS，BarbaraS，MariaTR，VittorioR.SelectionofmyeloidprogenitorslackingBCR-ABLmRNAinchronicmyelogenousleukemiapatientsafterinvitrotreatmentwiththetyrosinekinaseinhibitorGenisteinJ.Blood，1996；88（89）:3091-3100.3FengQ，SunBZ，ZhaoYT，SunK，YanZ，HanW，ZhangYQ.Studyonthecleavageabilityofthreerihozymesspecifictothedifferentsitesofbcr-ablfusiongeneJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），1999；20（4）:284-287.4CaoRX，LiuZG，QuP，ZhangYF.ArapidwayofdeterminingactivityofcellsbyflowcytometryJ.Di-siJunyiDaxueXue-bao（JFourthMilMedUniv），2000；21（7）:S198.5CaoYX，LiuZG，ZhongXN，DongJY.Indirectstainingofpe-ripheralbloodsamplesforflowcytometryJ.Di-siJunyiDax-ueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；21（2）:244-246.6FengQ，SunBZ，ZhaoYT，SunK，YanZ，HanW，ZhangYQ.Constructionandidentificationofachronicmyeloidleukemiaspecificbcr-abl3-unitsribozymeJ.Di-siJunyiDax-ueXuebao（JFourthMilMedUniv），1998；19（4）:471-472.7ShangZC，SunBZ，F(xiàn)engQ，WangCH，XieXP，SongTT，ZhuHF.Thesynergisticeffectsofbcr-ablandc-mycanti-senseoligodeoxynucleotidesonchronicmyeloidleukemiaJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；21（3）:275-277.8BediA，BarberJP，BediGC，DeneyWS，SidranskyD，ValaMS，