HPLC的保養(yǎng)和故障排除,1,HPLC的日常操作條件,最好是恒溫、恒濕溫度：1530相對濕度80%房間應(yīng)有良好的通風(fēng)空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器避免光線直射遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備,2,泵的使用與維護(hù)注意事項(xiàng),防止任何固體微粒進(jìn)入泵體（0.2um或0.45um的微孔濾膜過濾）流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性特質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)泵工作時(shí)防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、密封圈，最終產(chǎn)生漏液輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性,3,流動(dòng)相的選擇,采用“HPLC”級溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配,4,溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純,溶劑等級,微量分析、梯度洗脫,都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒),優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑,HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì),5,溶劑純度的影響,溶劑中的雜質(zhì)會導(dǎo)致出現(xiàn)“鬼峰”，特別是梯度解吸時(shí),注意：只能使用色譜級的溶劑!不能使用舊的或未經(jīng)過濾的緩沖溶液,6,緩沖的使用,使用前必須過濾使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:第二天接著用：用20%甲醇：80%水沖洗20-30分鐘隔幾天再用：用甲醇：水沖洗后，再用純甲醇沖洗易受到細(xì)菌和霉菌的影響,不能直接用有機(jī)溶劑沖洗,7,流動(dòng)相的過濾,過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其在使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí)過濾膜種類水系過濾膜水系濾膜嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會被溶解有機(jī)系過濾膜,8,脫氣目的：除去流動(dòng)相中因溶解或混合而產(chǎn)生的氣泡產(chǎn)生原因：溫度上升壓力下降溶劑混合,流動(dòng)相的脫氣,9,流動(dòng)相的貯存,流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能貯存在塑料容器中。容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)臨用現(xiàn)制。容器應(yīng)定期清洗，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。,10,流動(dòng)相過濾頭產(chǎn)生的問題,故障特征“鬼峰”(由已被污染的過濾頭造成)保留時(shí)間不斷改變(由于過濾頭堵塞或部分堵塞),清洗步驟：1.水2.稀硝酸3.水4.異丙醇5.水(超聲波清洗,玻璃慎用),11,流路中形成氣泡引起的問題,改變保留時(shí)間和峰面積流動(dòng)相中形成氣泡對液流的不良影響泵中形成氣泡使液流波動(dòng)峰變形柱中氣泡形成和累積使流動(dòng)相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲,12,1.使用流動(dòng)相溶解樣品-減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)由為重要-保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀2.進(jìn)樣前最好使用0.45um的膜進(jìn)行過濾如果樣品很臟，要使用0.2um的膜進(jìn)行過濾,樣品處理,13,梯度洗脫,優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間和提高分離精度,14,注意事項(xiàng)：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差，進(jìn)行樣品之前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰。梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）每次梯度洗脫之后要對色譜柱進(jìn)行充分的平衡。,梯度洗脫,15,溶劑混合產(chǎn)生的問題,流動(dòng)相中所使用的不同溶劑必須互溶,流動(dòng)相中溶劑不互溶會導(dǎo)致:1.基線漂移，2.保留時(shí)間的重現(xiàn)性差，3.出現(xiàn)肩峰和“鬼峰”的問題.,16,無流動(dòng)相流出，又無壓力指示,泵內(nèi)有大量氣體,打開泄壓閥，以較大流量（5mL/min)運(yùn)轉(zhuǎn)，,密封圈損壞,更換,壓力和流量不穩(wěn),有氣泡,打開泄壓閥，以較大流量（5mL/min)運(yùn)轉(zhuǎn)，,單向閥內(nèi)有異物,稀硝酸超聲清洗,壓力高,堵,壓力低,漏,故障可能原因解決辦法,輸液泵發(fā)生故障及相應(yīng)排除措施,17,操作注意點(diǎn)：1）樣品溶液必須用0.45um的濾膜過濾2）樣品溶液pH小于10,進(jìn)樣器的保養(yǎng),18,進(jìn)樣體積,過大的進(jìn)樣體積會導(dǎo)致產(chǎn)生寬峰或峰形不對稱,通常引起色譜柱過載或超出檢測器的檢測限是由于樣品濃度過高而不是體積的問題,注意：使用微徑柱時(shí)，必須保證柱子不要過載,19,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng),柱的保養(yǎng),20,當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動(dòng)相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)樣樣品要提純控制進(jìn)樣量每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品每天工作結(jié)束后用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?dāng)分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存,21,噪音高或基線漂移,常見問題,可能原因柱子沒有平衡好雜質(zhì)組分從色譜柱中緩慢流出雜質(zhì)在柱子中的富集檢測器或色譜柱的溫度差異系統(tǒng)有氣泡檢測器氘燈需更換電壓不穩(wěn)造成干擾,解決辦法繼續(xù)沖洗色譜柱至平衡利用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱沖洗色譜柱；提高樣品的預(yù)處理；使用色譜純的溶劑使用色譜柱恒溫箱流動(dòng)相脫氣；更換氘燈使用穩(wěn)壓電源；檢查供電系統(tǒng),22,出現(xiàn)“鬼峰”,常見問題,可能原因上一針樣品中沒有完全流出的物質(zhì)色譜柱被污染溶劑中有雜質(zhì)流動(dòng)相和溶解樣品的溶劑不互溶,解決辦法待樣品中的組分盡可能完全流出后才進(jìn)下一個(gè)樣品；每運(yùn)行完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱；改進(jìn)樣品的預(yù)處理每運(yùn)行完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖色譜柱；改進(jìn)樣品的預(yù)處理使用色譜純的溶劑盡量用流動(dòng)相溶解樣品；,23,出現(xiàn)肩峰或前延峰,常見問題,可能原因柱頭“塌陷”造成死體積溶解樣品的溶劑選擇錯(cuò)誤干擾物質(zhì)的存在；樣品中的雜質(zhì)色譜柱過載柱外效應(yīng)的影響,解決辦法更換色譜柱用流動(dòng)相溶解樣品改進(jìn)樣品預(yù)處理；使用色譜純?nèi)軇悠废♂寵z查管路連接,24,峰形展寬,常見問題,解決辦法更換色譜柱或預(yù)柱減少進(jìn)樣體積；稀釋樣品用流動(dòng)相溶解樣品檢查管路連接檢查是否有漏；使用小的檢測池提高色譜柱溫度更換色譜柱,可能原因色譜柱或預(yù)柱被污染或不合適色譜柱“過載”或進(jìn)樣體積過大溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)柱外效應(yīng)的影響色譜柱和檢測器之間有漏；檢測器的檢測池過大色譜柱溫度太低；流動(dòng)相的黏度太高色譜柱柱效下降,25,出現(xiàn)脫尾峰,常見問題,解決辦法減少樣品體積；改進(jìn)樣品預(yù)處理；調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成；使用流動(dòng)相改性劑（如三乙胺）；降低流動(dòng)相的pH值；使用堿性去活的色譜柱更換濾網(wǎng)；使用柱前過濾系統(tǒng)；將樣品過濾檢查管路連接更換色譜柱；,可能原因色譜柱過載干擾峰；雜質(zhì)硅膠表面未完全鍵合的硅羥基的影響色譜柱的濾網(wǎng)堵塞柱外效應(yīng)的影響；死體積色譜柱有“塌陷”、短流或斷流,26,出現(xiàn)雙重峰或分叉峰,常見問題,可能原因樣品體積過大；色譜柱過載溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)色譜柱有“塌陷”、短流或斷流色譜柱濾網(wǎng)堵塞進(jìn)樣器沒有徹底清洗,解決辦法減少進(jìn)樣體積；稀釋樣品；將樣品在流動(dòng)相中溶解更換色譜柱；使用較溫和的分離條件更換色譜柱的濾網(wǎng)；使用柱前過濾裝置；過濾樣品徹底清洗進(jìn)樣器；更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子,27,保留時(shí)間變長,常見問題,可能原因流速降低硅膠表面有活性點(diǎn)鍵合相流失流動(dòng)相的組成有變化溫度降低,解決辦法檢查系統(tǒng)是否有漏；更換泵的密封圈；排凈氣泡；使用流動(dòng)相改性劑（如加入三乙胺）；使用堿性去活的色譜柱保持流動(dòng)相pH值在2-7.5范圍內(nèi)檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解使用色譜柱恒溫箱,28,保留時(shí)間縮短,常見問題,可能原因流速升高色譜柱過載鍵合相流失流動(dòng)相組成發(fā)生變化溫度升高色譜柱老化,解決辦法檢查泵；檢查流速降低樣品的濃度或進(jìn)樣體積流動(dòng)相的pH值保持在2-7.5范圍內(nèi)檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解使用色譜柱恒溫箱更換色譜柱；使用預(yù)柱,29,保留時(shí)間無規(guī)則改變,常見問題,可能原因流速發(fā)生變化色譜柱尚未平衡；流動(dòng)相組成發(fā)生變化；流動(dòng)相中的溶劑互溶性差色譜柱溫度發(fā)生變化雜質(zhì)在色譜柱中“堆積”,解決辦法檢查是否有漏；更換泵的密封；排凈氣泡至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱；檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解使用色譜柱恒溫箱沖洗色譜柱；,30,檢測器的保養(yǎng),紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時(shí)，打開