福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 縮略語(yǔ) a l t a m c c | 4 f r g a l g l c a s t h b h b v h p l c m a l l m d a p s r h a s o d s w p 縮略詞表 英文全稱中文名稱 a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s 谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 a r a b i n o s e t e t r a c h l o r i d e f r e er a d i c a l g a l a c t o s c g l u c o s e g l u t a m i co x a l o a c e t i ct r a n s a m i n a s e 阿拉伯糖 四氯化碳 自由基 半乳糖 葡萄糖 谷草轉(zhuǎn)氨酶 h e p a t i t i sb 乙型病毒性肝炎 h e p a t i t i sb v i r u s 乙型肝炎病毒 h i l g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a h y高效液相色譜 m a l l n o s e m a l e i cd i a l d e h y d e p o l y s a c c h a r i d e s r h a m n o s e 甘露糖 丙二醛 多糖 鼠李糖 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 s a r c o p y r a m i sn e p a l e n s i s w a l l sp o l y s a c c h a r i d e s 楮頭紅總多糖 t a o ct o t a la n t i o x i d a t i v ec a p a c i t y總抗氧化能力 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位( 畢業(yè)) 論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的 研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的 地方外，論文中不包含其他入發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn) 的同志，都在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行 為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位( 畢業(yè)) 論文作者親筆簽名矛袖仁e g q ： 論文使用授權(quán)的說(shuō)明 e 6 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位( 畢業(yè)) 論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán) 送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可 以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在年后解密可適用本授權(quán)書。 口 不保密，本論文屬于不保密。 口 引呦一躲孛僅玨飆咖7 “ 指導(dǎo)教師親多 d 1 a 蠲a ) 、6 、6 摘要 目的：從楮頭紅全草中分離提取多糖，并優(yōu)化提取務(wù)件；純化多糖并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分 析和體內(nèi)體外生物活性研究。為楮頭紅藥材臨床應(yīng)用和楮頭紅多糖產(chǎn)品的 開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù) 方法：( 1 ) 采用經(jīng)典的水提醇沉的方法和苯酚一硫酸法測(cè)定多糖含量，在單因素分 析( 提取時(shí)問(wèn)，提取次數(shù)料液比，酒精用量) 的基礎(chǔ)上進(jìn)行l(wèi) 9 3 4 正交分析， 優(yōu)化提取條件： ( 2 ) 將粗多糖依次通過(guò)s e v a g 法去除蛋白、去色素和d e a e 一5 2 柱、s e p h a d e x g 一2 0 0 柱純化分級(jí)得一單組分，用h p l c 法檢測(cè)純度； ( 3 ) 結(jié)合液相色譜、氣相色譜，紅外光譜，核磁共振光譜等方法和化學(xué)分析 法初步鑒定多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)及部分理化性能； ( 4 ) 通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)，體外細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)，體內(nèi)保肝( 四氯化碳肝 損傷模型) 試驗(yàn)，分析多糖的抗氧化、保肝護(hù)肝和提高免疫力等生物活性 結(jié)果：( 1 ) 正交試驗(yàn)結(jié)果表明，多糖提取的優(yōu)化條件為：溫度為1 0 0 ，固液比1 ：6 0 ， 時(shí)問(wèn)2 5 h ；提取三次，醇沉?xí)r加入四倍量乙醇按此優(yōu)化條件提取，經(jīng)測(cè) 定楮頭紅中總糖含量為1 5 9 ( 2 ) 經(jīng)過(guò)兩次柱層析分離得到兩個(gè)單一組分s w p l s w p l i ；經(jīng)h p l c 鑒定 均為組分相對(duì)單一 ( 3 ) s w p i i 經(jīng)i r 圖譜分析和n m r 分析顯示具有多糖的特征吸收峰，主鏈以 b 一型糖苷鍵連接為主，少量a 一型糖苷鍵；經(jīng)元素分析，紅外和紫外綜合 分析表明s w p i i 中沒(méi)有n 、s 元素存在，應(yīng)為非氨基糖；經(jīng)t l c 和g c 分 析其單糖組成為鼠李糖( r h a ) 葡萄糖( g i c ) 半乳糖( g a l ) ，摩爾比為 l1 6 ：1 6 4 ：2 8 6 ：經(jīng)h p l c 法分析其平均相對(duì)分子質(zhì)量為8 4 81 8 0 ( 4 ) 體外抗氧化試驗(yàn)表明，楮頭紅總多搪具有較好的抗氧化作用在總多糖 濃度為3 0 m g m l 時(shí)，其對(duì)羥自由基清除率達(dá)3 9 3 ；對(duì)超氧陰離子自由基 具有一定的清除作用；當(dāng)純一多糖( s w p i i ) 濃度為4 m g m l 時(shí)，對(duì)h 2 0 2 誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率可達(dá)8 7 3 ；當(dāng)濃度為1 4 m g m l 時(shí)對(duì) 脂質(zhì)過(guò)氧化作用抑制率達(dá)到5 0 ；體外細(xì)胞培養(yǎng)表明，多糖能夠促進(jìn)脾淋巴 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力和n o 產(chǎn)生量不同程度的增強(qiáng)；小鼠體 內(nèi)免疫試驗(yàn)表明多糖對(duì)體內(nèi)相關(guān)酶( 1 9 g ，l g m 、t - a o c 、s o d ) 活性具有 增強(qiáng)作用，脾臟指數(shù)有所增加 結(jié)論：按正交試驗(yàn)得出多糖提取的優(yōu)化工藝與條件，多糖提取率高，務(wù)件溫和， 操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；經(jīng)純化得到的純多糖為雜多糖( h e t e r o s a c c h a r i d e ) ， 具有抗氧化保肝和增強(qiáng)免疫力等功能。 關(guān)鍵詞：楮頭紅；多糖；純化；結(jié)構(gòu)分析；生物活性 2 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 s t u d yo nt h ee x t r a c t i o n ，s t r u c t u r ea n db i o l o g i c a la c t i v i t yo f p o l y s a c c h a r i d e s ( s w p ) f r o ms a r c o p y r a m i sn e p a l e n s i sw a l l a b s t r a e t o b j e c t i v e ：e x t r a c t a n di s o l a t e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m s a r c o p y r a m i sn e p a l e n s i s w a l l , s e e k i n go p t i m u mc o n d i t i o n s o f e x t r a c t i o n s t u d yo nt h ep u r i f i c a t i o no f p o l y s a c c h a r i d e s ，t h es t r u c t u r eo fp o l y s a c c h a r i d e s ，a n db i o l o g i c a la c t i v i t yi nv i v oa n d v i t r o t oe l u c i d a t en e wp h a r m a c o l o g i c a la c t i o na n dn e wm e d i c i n a lv a l u e ，a n df u m i s h t h et h e o r e t i c a lb a s i sf o rd e v e l o p i n ga n de x p l o i t i n gn e wd r u gf r o ms a r c o p y r a m i s n e p a l e n s i sw a l l m e t h o d s ：( 1 ) c l a s s i c a lh o tw a t e re x t r a c t i n ga n de t h a n o lp r e c i p i t a t i n gm e t h o dw a s e m p l o y e dt oi s o l a t ep o l y s a c c h a r i d e sa n dt h ec o n t e n to ft o t a ls u g a rw a sd e t e r m i n e db y p h e n o l s u l f u r i ca c i dm e t h o d s i n g l ef a c t o rt e s t sw e r ed o n et oa n a l y z et h ei n f l u e n c eo f e a c hf a c t o ri n c l u d i n gt e m p e r a t u r e ，e x t r a c t i o nt i m e ，r a t i oo fm a t e r i a lt ow a t e r , e x t r a c t i o n t i m e s ，a n dt h ev o l u m eo fe t h a n 0 1 t h e nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o nw e r a o b t a i n e db yu s i n go r t h o g o n a ld e s i g nb 3 4 ( 2 ) a f t e rt h ec r u d es w pw a se x t r a c t e dw i t hh o tw a t e ra n dp r e c i p i t a t e dw i t h e t h a n o l ，p r o t e i na n dp i g m e n tw e r ea l s or e m o v e d d e a e c e l l u l o s ec h r o m a t o g r a p h yw a s u s e dt os e p a r a t ec r u d es w p ，f u r t h e rp u r i f i c a t i o nw a st a x i e do nb ys e p h a d e x g 2 0 0 c h r o m a t o g r a p h y f i n a l l y ，i t sh o m o g e n e i t yw a sp r o v e db yh p l c ( 3 ) t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o no fs w p1 1w a sa n a l y z e db yu s i n gt l c ，g a s c h r o m a t o g r a p h y ，u vs p e c t r u m ，i rs p e c t r u m , n m rs p e c t r u m t h em o n o s a c c h a r i d ea n d l i n k a g eo fs w p 1 1w e r oi n v e s t i g a t e dt h r o u g hc h e m i c a la n a l y z a t i o n ( 4 ) a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e si nv i t r oa l ed e t e r m i n e db yc e l l c u l t u r i n g ，l i v e ri n j u r yw h i c hw a si n d u c e db yc a r b o nr e t r a c h l o r i d em o d e l ，w e r ec a r r i e d o u tt oe x a m i n es w p sa n t i o x i d a t i o n ，h e p a t o p r o t e c t i v e ，i m m u n o s t i m u l a t i n ga c t i v i t y r e s u l t s ：( 1 ) t h e r e s u l t so fs i n g l ef a c t o rt e s t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h eo p t i m u ms w pe x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：s o l i d l i q u i d r a t i oi s1 ：6 0 ，t e m p e r a t u r ei s1 0 0 ，e x t r a c t i o nt i m ei s2 5h o u r s ，t h ee x t r a c t i o nt i m e si s 3 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)住論文 3a n dp r e c i p i t a t e dw i t hf o u rt i m e so f a l c o h o l 。u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ec o n t e n to f t o t a l s u g a r i s1 5 9 ( 2 ) t b ec r u d ep o l y s a c c h a r i d ew a sf r a c t i o n a t e db yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yd e a e 5 2 、s e p h a d e xg 一2 0 0 。a n ds w p1 、s w p 1w e r eo b t a i n e d i tw a sp r o v e dt ob eh o m o - g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d eo nm o l e c u l a rw e i g h t ( 3 ) i ra n dn m rs p e c t r o s c o p ya n a l y s i sr e v e a l e dt h em a i nc h a i no fs w pi im o s t l y l i n k e db yi b - g l y c o s i d i cb o n d ，r a r e l yl i n k e db y 小g l y c o s i d i cb o n d ；i r 。u va n de l e m e n t a n a l y s i ss h o w e dt h a tna n dsi sa b s e n t ，i t sn o taa m i n o s u g a r t h er e s u l t so fg ca n d t l c a n a l y s i ss h o w e dt h em o n o s a c c h a r i d ea r er h a ，g l ca n dg a l ，w i t ht h em o l a rr a t i oo f 1 1 6 ：1 6 4 ：2 8 6 t h ea v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t o f s w p i ii s8 4 8 ，1 9 0 ( 4 ) t h er e s u l t so ft h ev i t r o - a n t i o x i d a t i o n s u g g e s t e dt h a ts w ph a dg o o d a n t i o x i d a t i o na c t i o n ，w i t ht h ed o s a g eo f3 0m # m lt h ei n h i b i t o r yr a t eo nh y d r o x y l f l e er a d i c a lw a s3 9 3 e a c hd o s a g ec o u l di n h i b i t es u p e r o x i d ea n i o n , w i t ht h ed o s a g e o f4 0m m l ( s w pi i ) t h ei n h i b i t o r yr a t eo nt h er e s t r a i n i n ga u t o - o x i d i d a t i o no f e r y t h r o c y t e sw a s8 7 3 w i t h t h ed o s a g eo f1 4m g m lt h ei n h i b i t o r yr a t eo n l i p i d p e r o x i d a t i o nw a s5 0 w ef o u n dt h a ts w p i ia n dc r u d es w pc o u l di n c r e a s e p r o l i f e r a t i o n i n d e xo fs p l e n i c l y m p h o c y t e s w pc o u l ds i g n i f i c a n t l ya u g m e n tt h e p e r c e n t a g eo f a c t i v a t e dm a c r o p h a g e ，p h a g o c y t i ca c t i v i t y , t h ea m o u n to fn o e a c hd o s e g r o u po fs w pc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h ea c t i v i e so fl g g 、i g m ，t - a o c 、 s o d ，a n dc a l le n h a n c et h ew e i g h to f l i v e ra n ds p l e e nc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p c o n c l u s i o n ：b yu s i n gs i n g l ef a c t o rt e s t sa n do r t h o g o n a ld e s i g n ，w eg o tt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o re x t r a c t i o no fs w p u s i n gt h i sm e t h o d ，t h ee x t r a c t i o ny i e l di sh i g h ，t h e r e a c t i o nc o n d i t i o n sa r e g e n t l e ，e a s y t o o p e r a t e ，a p t t oi n d u s t r i a l i z a t i o n t h e h o m o g e n e o u sh e t e r o s a c c h a r i d es w p , o b t a i n e db yt h eo p t i m i z e de x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nm e t h o d ，s h o w e dag o o da n t i o x i d a t i o na n dh e p a t o p r o t e c t i v e a c t i v i t i e sa n d a l s oh a da s t r o n gi m m u n i t ya c t i v i t i e s k e yw o r d s ：s n e p a l e n s i sw n l l ，p o l y s a e c h a r i d e ，p u r i f i c a t i o n ，s t r u c t u r ea n a l y s i s ， b i o l o g i c a la c t i v i t i e s 4 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 楮頭紅 前言 楮頭紅瞧n e p a l e n s i s w a l l ) ，又名肉穗草、風(fēng)鼓斗草( 風(fēng)柜斗草) ，屬于野牡 丹科o v l e l a s t o m a c e a e ) 中的肉穗草, 氍( s a r c o p y r a m i sw a l l ) 直立草本，高l o 3 0 c m 莖脆弱，有4 棱，無(wú)毛葉對(duì)生，卵形或卵狀披針形，長(zhǎng)2 6c m 寬l 一 3 5c m ，邊緣有細(xì)鋸齒，葉面粗糙，疏生粗毛葉背隙上有疏毛；葉柄長(zhǎng)0 5 2 c m 。花數(shù)朵簇生枝預(yù)或葉腋，紫紅色；萼管長(zhǎng)3 6 m m ，先端鈍齒；花瓣4 片， 卵形長(zhǎng)0 7 一lc m ；雄蕊8 枚，花藥項(xiàng)端孔裂；子房半下位蒴果倒圓錐形7 一 1 0 月開(kāi)花i l 】。生于林下、溝邊陰濕處主要分布于東南亞和我國(guó)的四川云南， 廣西廣東、江西臺(tái)灣福建等地?fù)?jù)中藥大詞典記載：楮頭紅全草可藥 用，具有濤熱解毒。清肝瀉火之效，是治療急性肝炎，肺熱咳嗽，蛇頭疔，無(wú)名 腫毒、胃腸炎等疾病的珍稀名貴中草藥2 1 對(duì)急性肝炎( 甲肝，乙肝急性期) 療效 最佳，對(duì)慢性肝炎及乙肝病毒攜帶者有效，在福建民聞已廣泛應(yīng)用，療效顯著， 安全可靠，使用方便，是一種良好的中草藥資源，值得研究開(kāi)發(fā)和推廣運(yùn)用根 據(jù)文獻(xiàn)記載i 孫，野牡丹科約有2 4 0 屬，3 0 0 0 多種，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，尤 以美洲最多，我國(guó)有2 5 屬，1 6 0 種，其中的大部分植物均具有抗炎抗茵、抗 病毒等功效，在民間作為中草藥治病廣為使用所以開(kāi)展對(duì)楮頭紅活性成分及其 生物學(xué)功能的研究可為廣泛研究開(kāi)發(fā)野牡丹科天然藥用植物資源提供借鑒 乙型病毒性肝炎( h b ) 是嚴(yán)重危害人民健康的常見(jiàn)傳染性疾病，世界衛(wèi)生 組織估計(jì)全球有3 。5 億人感染了乙型肝炎病毒( h b v ) 1 4 】，大約1 4 的h b v 攜帶者 最終轉(zhuǎn)化為慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化肝癌患者目前我國(guó)約有1 2 億人為乙肝 病毒攜帶者1 5 1 ，現(xiàn)有乙肝患者迭3 千萬(wàn)人之多，每年有近5 0 萬(wàn)人死于與乙肝有關(guān) 的疾病，而且這一數(shù)字目前正呈上升趨勢(shì)長(zhǎng)期以來(lái)，面對(duì)這種4 。a g t 手的病癥， 人們一直苦于缺少有確定療效的藥物加強(qiáng)對(duì)慢性乙型肝炎藥物的研究意叉重 大目前世界上還沒(méi)有專門殺滅乙肝病毒的特效藥，大都通過(guò)保肝，提高機(jī)體的 免疫力來(lái)抵抗病毒近3 0 年來(lái)，發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的多方面的生物活性和功能， 已成為天然藥物及保健品研發(fā)的重要組成部分據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道【6 】，已有近1 0 0 余種 植物的多糖被分離提取出來(lái)?yè)?jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2 0 0 2 年全球糖類藥物及保健品銷售 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 額已達(dá)到1 9 3 4 l 美元，預(yù)計(jì)到2 0 1 0 年我國(guó)保健市場(chǎng)銷售額將達(dá)到1 0 0 0 億元人民幣， 其中植物多糖將是極有應(yīng)用潛力的資源之一國(guó)內(nèi)已研制并應(yīng)用到臨床的靈芝多 糖，牛膝多糖等產(chǎn)品，已收到較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益所以植物多糖作為一種免 疫促進(jìn)劑和抗病毒劑在治療乙肝方面具有很高的研發(fā)價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景 楮頭紅用于治療乙肝在民間已廣為使用，但藥理作用尚不清楚，國(guó)內(nèi)外尚無(wú) 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，據(jù)我們初步研究，楮頭紅含有豐富的多糖，且有抗氧化抗小鼠 肝脂質(zhì)化和保肝功能，可能是其治療乙肝的活性物質(zhì)之一說(shuō)明了楮頭紅被廣泛 用于治療乙型肝炎具有一定的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，這是本研究立論的基礎(chǔ)和依據(jù)開(kāi) 展對(duì)楮頭紅多糖提取分離和成分結(jié)構(gòu)鑒定以及保肝利膽免疫促進(jìn)作用等藥理活 性以及構(gòu)效關(guān)系研究，進(jìn)而通過(guò)構(gòu)效關(guān)系對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾與改構(gòu)，以改進(jìn)多 糖的理化性質(zhì)和生物活性，為開(kāi)發(fā)治療乙肝新藥提供參考，對(duì)多糖藥物的藥理研 究具有很好促進(jìn)作用在豐富糖生物學(xué)和糖化學(xué)研究?jī)?nèi)容方面具有重要學(xué)術(shù)意 義楮頭紅藥材人工栽培已成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，我國(guó)乙肝患者眾多，開(kāi)發(fā)該多糖類 治療乙肝藥物，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景 2 多糖 2 1 多糖的研究概述 多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ，p s ) 又稱多聚糖，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一， 作為高等植物、動(dòng)物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁中的天然高分子化合物，人們對(duì)糖類 的早期研究只注意到它作為能源物質(zhì)的重要性和細(xì)胞的組成成分長(zhǎng)期以來(lái)，中 藥化學(xué)與藥理研究工作多側(cè)重于脂溶性化學(xué)成分，而對(duì)水溶性中藥多糖類有效成 分重視不夠，多糖在生物體中的作用僅被認(rèn)作能量資源或結(jié)構(gòu)材料，在天然生物 活性成分研究中往往當(dāng)作雜質(zhì)被除去自2 0 世紀(jì)7 0 年代以來(lái)【刀科學(xué)家發(fā)現(xiàn)多糖 及糖復(fù)合物在生物體中不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一 切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的一類天然大分子化合物多糖作為藥物始于1 9 4 3 年，但是， 在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)沒(méi)有得到足夠的重視5 0 年代隨著化學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展和分離 技術(shù)的提高人們才開(kāi)始認(rèn)識(shí)到多糖的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜多樣的，其生物學(xué)功能也 決非僅僅是能量和結(jié)構(gòu)上的功能6 0 年代前后，多糖作為廣譜免疫促進(jìn)劑引起 人們極大的興趣，逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的多方面的生物活性和功能7 0 年 6 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)住論文 代以來(lái)，隨著免疫物質(zhì)、生物膜和各種生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展表明，發(fā)現(xiàn)糖類在 體內(nèi)具有各種關(guān)鍵的生物功能8 0 年代以后人們得到了有關(guān)糖的結(jié)構(gòu)和功能的 越來(lái)越多的信息特別是近十年來(lái)a d r j 對(duì)糖的認(rèn)識(shí)有了質(zhì)的飛躍，認(rèn)識(shí)到糖是除 核酸和蛋白質(zhì)之外另一重要的生命物質(zhì)，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)，具有 多種多樣的生物學(xué)功能，特別是免疫調(diào)節(jié)作用 許多中草藥的活性與糖有著密切的關(guān)系【8 】從2 0 世紀(jì)6 0 年代以來(lái)，多種不 同結(jié)構(gòu)和組成的糖類不斷被發(fā)現(xiàn)，對(duì)其新功能的認(rèn)識(shí)不斷加深，逐漸發(fā)現(xiàn)許多對(duì) 腫瘤，肝炎，心血管、抗衰老等方面有獨(dú)特的生物活性，且細(xì)胞毒性極低中國(guó) 在蕓芝多糖、銀耳多糖，刺五加多糖、竹黃多糖和黃芪多糖等的研究中取得很大 的成績(jī)?nèi)缃瘢絹?lái)越多的研究表明，多糖有增進(jìn)機(jī)體免疫功能，它不但能治療 機(jī)體免疫系統(tǒng)受到的嚴(yán)重?fù)p傷的腫瘤，還能治療多種免疫缺陷疾病，如慢性病毒 性肝炎和某些耐藥細(xì)茵或病毒引起的慢性病近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，多糖可作為 生命活動(dòng)中起核心作用的遺傳物質(zhì)，它能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng) 與袁老 植物源多糖類化合物由于其獨(dú)特功能和低毒性，在臨床中顯示出越來(lái)越廣闊 的前景，1 9 9 7 年全球從植物中提取的糖類藥物的銷售額達(dá)7 3 4 r 。美元1 9 】到目前為 止，已有3 0 0 多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被提取出來(lái)，其中從中藥中獲得的 水溶性多糖最為重要，已發(fā)現(xiàn)有1 0 0 $ 種中藥中的多糖類化合物具有免疫促進(jìn)作 用我國(guó)近年來(lái)對(duì)植物多糖，特別是具有中國(guó)特色的中草藥多糖的藥物活性已有 廣泛報(bào)道，例如：報(bào)道降血糖的中草藥已達(dá)到1 0 0 余種，其中有顯效的也有2 0 種 其它如具有抗腫瘤、抗衰老，抗病毒，抗放射。抗突變抗遺傳損傷、抗凝血， 抗血栓等藥物活性的報(bào)道很多，但弄清結(jié)構(gòu)說(shuō)明構(gòu)效關(guān)系尚少見(jiàn)中草藥作為藥 物開(kāi)發(fā)及理論研究，我國(guó)已落后于日本，韓國(guó)目前在中草藥中的某些品種，特 剮是生物活性明確的中草藥來(lái)源的多糖如何能較快達(dá)到符合國(guó)際規(guī)范的新藥是 很迫切的任務(wù) 國(guó)際上對(duì)糖類的研究日新月異，內(nèi)容包括糖生物學(xué)、糖工程等，并且相繼多 次召開(kāi)了有關(guān)“糖生物學(xué)和糖工程”的專題會(huì)議，1 9 9 5 年3 月亞洲分子生物學(xué)組 織( a m b o ) 還在日本舉辦了“糖生物學(xué)和糖工程”培訓(xùn)班目前，日本、美國(guó)， 及歐盟十分重視糖類的研究1 ，且在糖的研究與開(kāi)發(fā)處于領(lǐng)先地位，并且提出各 福建農(nóng)林走擘碩士孝位論文 自的重大科研計(jì)劃歐盟在1 9 9 4 - - 1 9 9 8 年的研究計(jì)劃中啟動(dòng)了“歐洲糖研究與開(kāi) 發(fā)平臺(tái)”，旨在協(xié)調(diào)歐洲的糖研究與開(kāi)發(fā)，強(qiáng)化在糖的研究成果轉(zhuǎn)化成商品與美 國(guó)和日本競(jìng)爭(zhēng)的能力值得指出的是我國(guó)對(duì)于糖的研究尚無(wú)重大計(jì)劃縱觀近十 年，有關(guān)多糖的研究日益增多，到目前為止，雖然只有云芝多糖、豬苓多糖，香 菇糖、裂褶多糖，茯苓多糖等少數(shù)應(yīng)用于臨床，但它們?cè)诳鼓[瘤，抗凝血，抗突 變、降血脂抗衰老、抗病毒等疑難病癥的治療方面已顯示了誘人的前景有關(guān) 專家預(yù)言“2 l 世紀(jì)將是多糖的時(shí)代”預(yù)示著多糖研究的廣闊前景 糖化學(xué)已有上百年的發(fā)展史f 1 2 】，多糖以及糖結(jié)合物的分離、純化，組分測(cè)定 和結(jié)構(gòu)分析也有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但由于其結(jié)構(gòu)和立體化學(xué)的多樣性，仍然是“成熟” 了的化學(xué)所難于處理的對(duì)象，但與蛋白質(zhì)和核酸的研究相比還有很大差距，還不 夠深入，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面【1 3 1 4 ：1 ) 多糖的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系至今仍然是 多糖研究的薄弱環(huán)節(jié)，大多還是憑科學(xué)家的分析和推測(cè)，而對(duì)多糖的溶液構(gòu)象和 晶體結(jié)構(gòu)的研究幾乎還是空白；2 ) 多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法還遠(yuǎn)未達(dá)到像核酸和蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定那樣的自動(dòng)化、微量化和標(biāo)準(zhǔn)化。由于糖分子中每個(gè)多糖殘基都有 多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，這使糖苷鍵具有多種可能性而構(gòu)型又有a 和p 兩種，這使得多糖 的結(jié)構(gòu)測(cè)定還遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)靜核酸結(jié)構(gòu)測(cè)定來(lái)得困難雖然近來(lái)有人用質(zhì)譜弄口核磁 共振以及毛細(xì)管電泳等技術(shù)來(lái)測(cè)定多糖的結(jié)構(gòu)，但是局限性也較大3 ) 多糖的 合成( 目前實(shí)際上只是寡糖的合成) 也遠(yuǎn)比多肽和多聚核酸的合成復(fù)雜和困難； 4 ) 多糖在體內(nèi)的作用機(jī)制還未十分明了該領(lǐng)域還有待人們通過(guò)大量創(chuàng)新性， 探索性工作去進(jìn)行深入研究作為重要的植物化學(xué)成分，多糖已成為現(xiàn)在科學(xué)家 研究的重要領(lǐng)域，不斷受到人們的關(guān)注多糖正逐漸成為當(dāng)今新藥開(kāi)發(fā)的重要方 向之一 2 2 多糖來(lái)源 多糖是自然界中含量最豐富的生物聚合物，幾乎存在于所有的生物體中多 糖按來(lái)源不同分為四大類：植物多糖，動(dòng)物多糖，藻類多糖及微生物多糖其中 研究得比較多的是植物多糖和微生物多糖 2 3 多糖的提取和純化 2 3 1 多糖的提取、分離 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 目前常用的提取多糖的方法主要有6 】： 水提醇沉法多糖常與其它成分共存于中藥中?？衫枚嗵遣蝗苡谝掖嫉?性質(zhì)在提取液中加乙醇，甲醇或丙酮使多糖從提取液中沉淀出來(lái)，達(dá)到初步純化 的目的如岑穎洲等提取羊棲菜多糖1 1 5 ) 水提醇沉是現(xiàn)在提取多糖應(yīng)用最多的一 種方法 堿提取法多糖的結(jié)構(gòu)不同，可用弱堿性水溶液提取舍有糖醛酸的多糖堿 法提取雖然可提高多糖的收率，且可縮短提取時(shí)間，但提取液中含有其它雜質(zhì)， 如蛋白質(zhì)等，粘度過(guò)大，過(guò)濾困難 酸提取法含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖，也可用乙酸或鹽酸使成酸性再 加乙醇，使多糖沉淀析出，也可加入銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀而析出 應(yīng)注意的是在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，且對(duì)容器造成腐蝕，除 弱酸外，一般不宜采用 微波提取法微波萃取技術(shù)作為一種新型的萃取技術(shù)，其特點(diǎn)體現(xiàn)在微波的 選擇性高，萃取時(shí)間短，適用于熱敏性成分的萃取，可供選擇的溶劑較多，同時(shí) 減少了溶劑的用量同時(shí)還可將算與超臨界流體萃取結(jié)合運(yùn)用，解決微波萃取中 溶劑殘留問(wèn)題如王莉等應(yīng)用微波技術(shù)提取板藍(lán)根多糖 ， 超聲法超聲提取一般是在常溫條件下進(jìn)行，避免了高溫對(duì)有效成分的破壞 以除去單糖和低聚糖。如江發(fā)壽等研究了超聲提取法提取沙棗多糖i ，經(jīng)烘干處 理的沙棗采用超聲法提取植物多糖，可避免因結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論，造成 研究工作的復(fù)雜化但現(xiàn)在超聲萃取仍多用于實(shí)驗(yàn)室，在生產(chǎn)中很少應(yīng)用 酶法近年來(lái)，酶法已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于中藥花粉多糖，藥用茵胞內(nèi)多糖及動(dòng) 物藥多糖的提取如李道榮等研究了蒲黃花粉的酶法破壁條件【1 6 1 酶法作用條件 溫和，通過(guò)酶法破壁去除雜質(zhì)可以明顯提高收率但該技術(shù)同時(shí)存在著一定的局 限性：酶的最佳溫度及最佳p h 值往往在一個(gè)很小的范圍內(nèi)，為使酶的活性提高到 最大值，必須嚴(yán)格控制酶反應(yīng)時(shí)的溫度及p h 值，反應(yīng)務(wù)件的微小波動(dòng)，都可能 使酶的活性大大降低，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有較高的要求；酶法提取用于工業(yè)化的中 藥提取中還需綜合考慮酶濃度，底物濃度抑制荊和激動(dòng)刺等對(duì)提取物有何影響 c 0 2 超臨界萃取超臨界流體萃取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的提取 分離技術(shù)如廖周坤等采用超臨界c o ：萃取法從藏藥雪靈芝中提出了多糖類成 9 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 分由于超臨界c 0 2 具有較好的溶劑特性，對(duì)于揮發(fā)性較強(qiáng)的成分熱敏性物質(zhì) 和脂溶性成分的提取分離效果明顯，具有保持有效成分的活性和無(wú)殘留溶劑等優(yōu) 點(diǎn)。 超濾法超濾是一種膜分離技術(shù)，其作用原理主要是篩分作用如念保義等 用超濾膜分離裝置對(duì)香菇多糖浸提液進(jìn)行了分離、濃縮【t s i 超濾法分離多糖效率 極高，很少破壞，且操作簡(jiǎn)便，只需控制操作壓力，流速和濾液濃度即可這對(duì) 于分子量相對(duì)較大，且分布范圍較寬，溶液粘度大且不穩(wěn)定的多糖來(lái)說(shuō)，是一種 極具發(fā)展?jié)摿Φ姆蛛x手段 隨著對(duì)多糖認(rèn)識(shí)的不斷加深，尋找一種有效的提取方法是迫切需要解決的問(wèn) 題目前提取多糖的方法很多，每種都有其優(yōu)缺點(diǎn)要根據(jù)提取物的性質(zhì)、提取 成本、工藝設(shè)備等選擇適合的提取方法，提高多糖類的提取率，減少原材科的消 耗 提取多糖時(shí)蛋白質(zhì)常會(huì)一起被提取，且多糖走多因含色素而顏色較深，需加 脫色劑除去色素和脫蛋白目前常用的脫色荊有活性碳、h 2 0 2 等，常用的脫蛋 白方法有s e v a g 法，三氯乙酸沉淀法z n s 0 4 沉淀法，酶法及鞣酸法等 2 3 2 多糖的純化 多糖常用的純化方法有i t 1 8 1 ： 分部沉淀法不同多糖在不同濃度的低級(jí)醇或酮中具有不同溶解度，按比例 由小到大加入這些醇或酮( 常用甲醇乙醇和丙酮) 分部沉淀適宜于分離各種溶 解度相差較大的多糖如廣西綠茶多糖的分離純化 季胺鹽沉淀法醵l 生多糖能與其成鹽形成不溶性化合物，可分離酸t(yī) 生a - 4 性 多糖常用的季胺鹽是十六烷基三甲基溴化銨掃十六烷基吡啶 纖維素陰離子交換劑柱層析常用的交換荊為d e a e 一纖維素常用交換荊 為d e a e 一纖維素e c t e o l a 一纖維素和羧甲基纖維素此法適合于分離各種 酸性、中性及粘多糖p h = 6 時(shí)，酸性多糖吸附于交換劑上，中性多糖不吸附， 然后用不同離子強(qiáng)度的緩沖液按酸性強(qiáng)弱將各種多糖依次洗脫洗脫方式可以是 階梯式或梯度式：- 若p h d 堿性，中性多糖也能吸附中性多糖還能與硼砂形成 絡(luò)合物，若將柱處理成硼砂型后，改變硼砂液濃度也能將不同中性多糖洗脫下來(lái) 另外，雜質(zhì)會(huì)吸附于拄上端而達(dá)到部分純化的目的多糖在柱上的吸附力與其結(jié) 1 0 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)住論丈 構(gòu)有關(guān)吸附力一般隨分子中酸性基團(tuán)的增加而增大對(duì)于線性分子，分子量大 的比小的易吸附，直鏈多糖比分枝多糖易吸附此法適合于分離各種酸性、中性 多糖和粘多糖吸附力一般隨多糖分子中酸性基團(tuán)的增加而增加 凝膠柱層析根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同進(jìn)行分離常用的凝膠有葡萄 聚糖凝膠( s e p h a d e x ) 及瓊脂糖凝膠( s e p h a r o s e ) 也有人用d e a f _ - s e ：p h a d e x 分離 多糖 膜分離法膜分離是近年發(fā)展起來(lái)的超過(guò)濾技術(shù)，不需加熱和化學(xué)物質(zhì)處 理，不僅節(jié)約能源，無(wú)環(huán)境污染，且保留生物活性成分的高效價(jià)，因而得到廣泛 的應(yīng)，町目前所用超濾膜是高分子材料制成，較多為纖維素膜和聚砜膜不同的 超濾膜具有允許不同分子量和形狀的物質(zhì)通過(guò)的性質(zhì)，多糖溶液通過(guò)各種已知的 超濾膜就能達(dá)到分離 制備性高壓液相色譜( h p l c ) h p l c 是在經(jīng)典柱層析原理的基礎(chǔ)上，采用分 布窄，粒徑細(xì)的顆粒作載體，將流動(dòng)相以高壓注入柱內(nèi)，樣品組分迅速而不斷地 在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行反復(fù)多次平衡分配，彼此分離，并向下遷移，遷移速 率依賴于各組分與固定相之間的相對(duì)親和力 2 , 3 3 純度檢查 比旋度；- k t l 9 1 不同的多糖具有不同的比旋度，在不同濃度的乙醇中具有不同 溶解度故多糖水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀所得沉淀物，若具有相同比旋度， 則證明該多糖為均一組分如沙棘果水溶性多糖的純度檢查 超離心法微粒在離心力場(chǎng)中沉降的速度與微粒的密度，大小與形狀有關(guān) 如果某一多糖在離心力場(chǎng)作用下形成單一區(qū)帶，說(shuō)明微粒具有相同沉降速度，表 明其分子的密度、大小和形狀相似 高壓電泳法多糖在電場(chǎng)作用下，按其分子大小形狀及其所帶電荷的不同 而移動(dòng)的距離不同在相同電場(chǎng)作用下，某一特定的多糖移動(dòng)的距離應(yīng)有一特定 值如采用玻璃纖維紙電脈檢測(cè)沙棘果水溶性多糖的純度；采用醋酸纖維薄膜電 泳檢測(cè)鬼臼多糖及猴頭多糖的純度；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)西洋參多糖和鬼臼 多糖的純度：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)西洋參多糖的純度等 凝膠過(guò)濾法由于凝膠具有一定大小的孔徑，不同形狀和大小的多糖分子在 凝膠層析柱中移動(dòng)速度不同，其流出液經(jīng)示差檢測(cè)儀檢測(cè)，如只有一個(gè)峰，則表 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)住論丈 明為均一組分凝膠層析法可分為常壓凝膠柱層析及高效凝膠柱層析兩種如鬼 臼多糖的純度檢查 紙層析法取多糖水溶液點(diǎn)樣于新華中速或慢速濾紙上，在室溫下展開(kāi)，顯 色，進(jìn)行純度檢測(cè)如箬葉多糖的純度檢查 凍融法取多糖溶液經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融，應(yīng)無(wú)沉淀析出如沙棘果水溶性多糖的 純度檢查 2 4 多糖的結(jié)構(gòu)分析 多糖結(jié)構(gòu)分析比蛋白質(zhì)或核酸要復(fù)雜得多因?yàn)榻M成多糖的單糖品種繁 多，而且即使只有一種單糖組成的多糖，因其連接方式的不同并可能有分支，也 有可能得到結(jié)構(gòu)很復(fù)雜的多糖此外，由于多糖結(jié)構(gòu)的微觀不均一性，或分子量 發(fā)散，使多糖結(jié)構(gòu)分析很難得出完全準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)式多糖結(jié)構(gòu)的描述包括單糖組 成，單糖閏的連接方式糖苷鍵構(gòu)型分支位點(diǎn)及分支數(shù)目，最終確定其重復(fù)結(jié) 構(gòu)單元多糖結(jié)構(gòu)分析的手段有物理方法，如紅外光譜核磁共振光譜質(zhì)譜等， 也可用化學(xué)降解法( 完全酸水解部分酸水解，氧化性裂解等) ，還可用酶降解， 免疫化學(xué)法等。但目前還沒(méi)有一種方法可以單獨(dú)完成其結(jié)構(gòu)分析，必須將多種方 法結(jié)合使用 2 4 1 化學(xué)分析法 包括水解法，高碘酸氧化、s m i t h 裂解，甲基化反應(yīng)等，由于該類方法已較 成熟，故此不再詳述 2 4 2 儀器分析法 儀器分析法是在化學(xué)分析法的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步地了解和研究多糖的結(jié)構(gòu)特 性1 1 8 刪與化學(xué)分析法相比，儀器分析法具有快速、準(zhǔn)確，靈敏、操作方便等優(yōu) 點(diǎn)，是糖鏈分析不可缺少的手段目前，在此方面應(yīng)用較多的有u v i r 、g c h p l c 、m s ，n m r 及電泳等這些現(xiàn)代分析技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展以及儀器的聯(lián)用， 大大促進(jìn)了糖鏈結(jié)構(gòu)研究工作的發(fā)展 紫外分析法( u v ) 【2 1 捌在多糖的結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用較廣如苯酚喊酸法中測(cè) 定多糖的含量及糖醛酸含量等測(cè)定此外，還可利用在2 6 0i l m 2 8 0n m 處觀察有 無(wú)吸收來(lái)爭(zhēng)l 斷多糖中是否有蛋白質(zhì)，多肽及核酸 紅外光譜法( i r ) 為分析多糖結(jié)構(gòu)非常得力的技術(shù)人們經(jīng)常以多糖的特征 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 吸收峰來(lái)鑒定多糖- i a 8 4 0c m 。吸收峰可以判別a 糖苷鍵的存在，8 9 0c m 1 吸收峰 來(lái)判別b 糖苷鍵的存在吡喃糖苷在11 0 0 1 0 1 0c m 1 問(wèn)應(yīng)有3 個(gè)強(qiáng)吸收峰，而呋喃 糖苷在相應(yīng)區(qū)域只有2 個(gè)峰；另外，8 1 0 ，8 7 0c m 4 是甘露糖的吸收峰，1 2 6 0 與1 7 3 0 c m - i 是酯基或0 乙?；奶卣魑辗宥ピ? 7 4 0c m 一，羧酸離子在1 6 0 0c m ， 1 4 1 4c m 1 ，酰胺在1 6 5 0 咖，1 5 5 0c m o 附近出現(xiàn)振動(dòng)吸收 氣相色譜法( g c ) 和高效液相色譜法( h p l c ) 主要用于單糖和甲基化單糖的 分離和鑒定。使用凝膠柱的水相h p g p c 法還可以用來(lái)測(cè)定樣品的分子量對(duì)于 g c 而言，需要進(jìn)行樣品的衍生化，而h p l c 則可直接進(jìn)樣g c 的樣品可以做成 糖醇醋酸酯衍生物，或進(jìn)行糖腈乙酰化。 質(zhì)譜法( m s ) 利用m s 法研究糖類始于上世紀(jì)5 0 年代末由于m s 法在糖鏈結(jié) 構(gòu)分析中具有快速靈敏，樣品用量少，結(jié)構(gòu)信息直觀的特點(diǎn)而得到越來(lái)越廣泛的 應(yīng)用近年來(lái)各種軟電離技術(shù)的誕生，如快原子轟擊質(zhì)譜( f a b m s ) ，電噴霧質(zhì) 譜【e s - m s ) ，基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜( m a l d i - m s ) 等使糖結(jié)構(gòu)分析的研究 取得了日新月異的發(fā)展 核磁共振法( n m 砧自上世紀(jì)7 0 年代n m r 被引入多糖結(jié)構(gòu)的研究，并且發(fā) 揮著越來(lái)越重要的作用，現(xiàn)已成為多糖研究的常規(guī)手段用n m 瞰術(shù)研究糖鏈 結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是不破壞樣品糖鏈的結(jié)構(gòu)特征通過(guò)化學(xué)位移，偶合常數(shù)，積分面積， n o e 及遲豫時(shí)間等參數(shù)表達(dá)一維的n m r 包括1 h 2 - n m r 扣t 3 c - n m r 在自然界 中，1 3 c 的天然豐度很低，使得”c n m r 的靈敏度低于1 h - n m r ，后來(lái)出現(xiàn)的微型 計(jì)算機(jī)脈沖傅利葉轉(zhuǎn)換方式使得”c - n m r 能夠得到清晰的光譜，其化學(xué)位移范圍 遠(yuǎn)較1 h - n m r 寬，達(dá)到2 0 0p p m 目前，1 3 c n m r 在多糖結(jié)構(gòu)分析上的