摘要 本課題綜合評價了豆豉水提物對于小鼠腸道內(nèi)的a - 葡萄糖苷酶的體外抑制活性，初步推斷 豆豉樣品產(chǎn)生* 葡萄糖苷酶抑制活性的機理，并從高活性的豆豉樣品中分離、純化a _ 葡萄糖苷酶 抑制活性成份；此外，利用三種霉菌制備純種發(fā)酵豆豉，分別為米曲霉( a s p e r g i l l u s o o , z a e 3 9 5 1 ) 型、毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s3 1 1 8 ) 型和根霉( r h z o p u sa r r h i z u s3 0 7 8 ) 型豆豉，分析豆豉的 生產(chǎn)工藝與其a 葡萄糖苷酶抑制活性之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)；最后，對豆豉中分離純化得到的小葡萄糖 苷酶抑制活性成份進行理化特性分析，并進一步對豆豉樣品水提物及其純化的昏葡萄糖苷酶抑制 活性成份進行* 淀粉酶的體外抑制試驗研究，最終得到如下結(jié)論： 1 我國傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉均對小鼠腸道內(nèi)的昏葡萄糖苷酶具有抑制活性，其抑制斜率值( 1 【i ) 由0 5 - 1 3 8 不等，其中5 # ( l y ) 豆豉、1 6 # ( w n h ) 豆豉，以及2 1 # ( m w ) 豆豉水提物對小 葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性( p o 0 5 ) ，其抑制斜率值( 鼬) 分別為1 3 0 6 3 ，1 3 8 6 3 和1 2 2 3 0 ： 同時對我國另一種大豆發(fā)酵食品窿乳進行體外弘葡萄糖苷酶抑制試驗，結(jié)果顯示腐乳水提物 的* 葡萄糖苷酶抑制能力均較弱，l 【i 值均在5 0 以下； 2 使用米曲霉( 彳o r y z a e 3 9 5 1 ) 、雅致放射毛霉( 一e l e g a n s 3 1 1 8 ) 及少孢根霉( 尼a r r h i z u s 3 0 7 8 ) 純種發(fā)酵的豆豉，在前發(fā)酵階段豆豉曲的弘葡萄糖苷酶抑制活性均隨著發(fā)酵時間的延長 而略有增強；在后發(fā)酵階段，豆豉的m 葡萄糖苷酶抑制活性也呈增強趨勢，其中米曲霉( 彳o r y z a e 3 9 5 1 ) 型發(fā)酵的豆豉在后酵4 周后時表現(xiàn)較強的抑制活性( p o 0 5 ) ；毛霉( e l e g a n s3 1 1 8 ) 和根霉( 足a r r h z u s3 0 7 8 ) 型發(fā)酵的豆豉活性要相對弱些；此外在豆豉后酵過程中不同的食鹽添 加量也對豆豉的* 葡萄糖苷酶抑制活性產(chǎn)生影響，5 o 和7 5 的加鹽量制得的豆豉要比加鹽量 為1 0 0 0 0 和1 2 5 的豆豉活性要高； 3 豆豉中洳葡萄糖苷酶抑制成份使用s e p h a d e xg - 2 5 以及p o l y a c r y l a m i d e - 2 0 分離，確定為分 子量在1 0 0 0 d 以下的小分子物質(zhì)；利用高效液相色譜( h p l c ) 進行初步純化，最終在2 3 0 r i m 波 長下保留時間為1 9 2 1m i l l 之間得到一單峰，經(jīng)體外抑制試驗檢測結(jié)果顯示，此峰物質(zhì)對a _ 葡萄 糖苷酶具有較強的抑制活性； 4 豆豉水提物經(jīng)熱處理( 1 0 0 ，3 0 m i n ) 和纖維素酶處理( 1 ，l h ) 之后，表現(xiàn)出對* 葡 萄糖苷酶抑制活性略有增強；但經(jīng)脂肪酶，a 淀粉酶、b 淀粉酶以及胰蛋白酶處理之后抑制活性 變化不大； 5 豆豉樣品中a - 葡萄糖苷酶抑制活性成份不僅對* 葡萄糖苷酶有較強的抑制活性，而且對小 淀粉酶也有很強的抑制活性 關(guān)鍵詞：豆豉，a - 葡萄糖苷酶抑制，純化，發(fā)酵，o 一淀粉酶 a b s t r a c t c h i n e s et r a d i t i o n a l l yf e r m e n t e ds o y b e a n ( o o u c b i ) f r o mv a r i o u so r i g i n sw a st e s t e di t sa n t i - a g l u c o s i d a s e ( f r o mr a ts m a l li n t e s t i n e ) a c t i v i t y nv t r o t h ed o u c h is a m p l e ，w h i c hh a st h es t r o n g e s t i n h i b i t o r ya c t i v i t yo nr a ti n t e s t i n a lc t - g l u c o s i d a s e w 鷂f u r t h e rs t u d i e dj nt h ep r e s e n te x p e r i m e n t t h e a c t i v ef r a c t i o ni nd o u c h is a m p l ew a si s o l a t e da n dp u n f i e di na d d i t i o n , a s p e r g i l l u so r y z a e3 9 5 1 ， a c t i n o m u c o re l e g a n s3 1 1 8a n dr h 拓o p u s 橢把w3 0 7 8w e r eu s e dt op r e p a r ed o u c h ii nt h el a b o r a t o r y t h er e l a t i o n s h i po ft h ep a r a m e t e r si nm a k i n gd o u c h ia n da n t i - a - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yo ft h e mw a s d i c m s e d m o r e o v e r , t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h ea c t i v ef r a c t i o ni nd o n c h is a m p l ea f t e rh e a t i n ga n d d i g e s t i n gw i t hv a t i o u $ e l m y n * w a sa l s od e t e c t e d t h er e s u l t sw e i e a st h ef o l l o w i n g ： 1 a - g l u c o s i d a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo f d o u c h is a m p l e sw a t e r - e x t r a c tw e r et e s t e d nm t r o t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta l m o s ta l lt h e s ed o u c h is a m p l e sw a t e r - e x t r a c th a v ea l li n h i b i t o r ya c t i v i t yo nr a ti n t e s t i n a l a - g l u c o s i d a s ei n 訂加a m o n gt h e m , n o 5 皿nn o 1 6 ( w n 均a n dn o 2 1o 訂w ) d o u c h is a m p l e e x p r e s s e dah i g h e s ti n h i b i t i o no na - g l u c o s i d a s ep 代替，在微孔板振蕩器上混合均勻最后在所有的微孔中注入5 0 止的4 - n p g 溶液，再次振 蕩混合均勻，在3 7 培養(yǎng)箱保溫4 0 - 5 0r a i n 最終以5 0 皿的n a 2 c 0 3 溶液的加入終止反應。使 用酶標儀在4 0 5r d n 波長下測定吸光值最終以樣品的梯度濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標， 繪制回歸直線，求其斜率值l 【i ，k 值越大，表示樣品抑制活性越強。 2 2 2 3 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖含量的測定 使用蔗糖和d 葡萄糖紫外檢測試劑盒進行檢測，具體方法如下： ( 1 ) 準備試劑盒 試劑h 三乙醇胺緩沖液( p i i7 6 ) ，n a d p ( 1 1 0 r a g ) ，a t v ( 2 6 0 n a g ) ，硫酸鎂； 1 4 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文 第二章豆豉水提物對a 葡萄糖苷酶體外抑制活性研究 試劑2 ：己糖基酶( 3 2 0u ) ，6 - 磷酸葡萄糖脫氫酶( 1 6 0u ) ； 試劑3 ：檸檬酸緩沖液( p h4 6 ) ，p 果糖苷酶( 7 2 0u ) ； 使用時在b o t t l e l 中加入4 5 m l 蒸餾水溶解均勻，加入3 0 m l 蒸餾水在b o t t l e3 中。 ( 2 ) 試驗方法 具體方法見表2 5 囊2 5 蔗糖，m 葡萄糖蘩外檢蔫方法 t a b l e2 5 u v m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o no f $ 1 1 c r 0 a n d m 暑i u c e 注年加任胃蕾捌 2 2 2 4 豆豉樣品中異黃酮檢測 ( 1 ) 異黃酮的檢測 豆豉中異黃酮的檢測方法參考y i n e ta 1 ( 2 0 0 4 ) 和w a n g e t a l ( 2 0 0 6 ) ，在本試驗條件下又做 了相應的改進 取豆豉凍干粉，使用8 0 甲醇溶解( 濃度：1 0 ，w v ) ，振蕩混合均勻，在8 0 ( 2 水浴提取4 h ，離心( 3 7 0 0r p m ，1 5r a i n ) ，取上清液，經(jīng)0 4 5 岬微孔過濾膜后收集在1 0 m l 離心管中待用。 高效液相色譜( h p l c ) 用于檢測豆豉中異黃酮的操作條件： 色譜柱：d i k r a ad i a m o n s i lc 1 8 ( 4 6m m x 2 5 0m m ，0 5u m ) ； 柱溫：4 0 ： 靈敏度：1 0 0 0 a u f ； 進樣量：2 0 u l ； 檢測波長：2 5 4n n l ； 流速：1 0m l m i n ； 流動相：0 1 ( v v ) 7 , 酸的水溶液( 溶液a ) ，o 1 ( v v ) 乙酸的乙腈溶液( 溶液b ) ； 洗脫程序：見圖2 i 。 1 5 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文 第二章豆豉水提物對d 葡萄糖苷酶體外抑制活件研究 冪 、一 越 愛 摧 史 保留時間( m i n ) 圍2 。1 豆豉中異黃酮r p - h p l c 洗脫程序 f i g u r e 2 1r p - i i p l ce l u t i o np r o c e d u r eo f i s o f l v o n e si nd o u c h i ( 2 ) 大豆異黃酮標準品對m 葡萄糖苷酶的抑制活性 取1 2 種大豆異黃酮標準品，溶解于8 0 甲醇試劑中，振蕩混勻，使用0 4 5 岬過濾膜濾除 大顆粒物質(zhì)。然后檢測1 2 種大豆異黃酮標品對a 葡萄糖苷酶的體外抑制活性，抑制活性檢測方 法同2 2 2 2 2 2 - 2 5 豆豉中總糖和還原糖含量的測定 ( 1 ) 豆豉中總糖的測定( 蒽酮比色法) 取豆豉樣品溶液1 0m l ，加入到試管中，在制作標準曲線時是加入1 0 ，2 0 ，4 0 ，卯，8 0 。 1 0 0m 毋 m l 葡萄糖溶液，空白對照加入1 0m l 蒸餾水，然后分別在各管中沿壁加入5 0m l 蒽酮 試劑( o 2 9 葸酮，1 0 9 硫脲，邊攪拌邊加入1 0 0 m l 濃硫酸) ，攪拌均勻，蓋上玻璃珠，置于1 0 0 c 保溫1 0m i n 然后取出在流水中冷卻2 0m i n ，在6 2 0n m 波長下測定吸光值。 ( 2 ) 豆豉中還原糖的測定( d n s 法) 取豆豉溶液1 0m l 置于2 5m l 容量瓶中，加入水楊酸2 0m l ，置于沸水浴中煮1 5m i n 然 后加入1 0m l 的4 0 ( w v ) 的四水合酒石酸甲鈉，以流動水迅速冷卻，然后定容，搖勻，在5 4 0 n m 下測定吸光值 2 2 2 6 豆豉中水分含量的測定 精確稱取豆豉粉3 0 0 0g ，置于已干燥，冷卻稱至恒重的有蓋干燥皿中。移入1 0 s c 常壓烘 箱中。開蓋烘4h 后取出，加蓋置于干燥器內(nèi)冷卻0 5h 后稱重，記錄數(shù)據(jù)：再次置于1 0 5 c 干 1 6 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文第二章豆豉水提物對a 葡萄糖苷酶體外抑制活性研究 燥1h ，再次稱重；重復此操作，直至前后兩次質(zhì)量差不超過2m g 即算恒重，測定結(jié)果按下式計 算： w ( h 2 d ) = m l - m 2x 1 0 0 m 注：以h 2 d ) 水分含量，_ ；r 廣千攮前樣品與千爆皿質(zhì)量，d m 廣干爆后樣品與千爆皿質(zhì)量，； m 樣品質(zhì)量，厶 2 2 2 7 豆豉中粗蛋白含量的測定 采用常量凱氏定氮法，稱取豆豉原料1 0 0 0g ，加入1 5g 硫酸鉀和0 5g 硫酸銅，然后緩慢加 入2 0 m l 濃硫酸，置于消化管中，每只消化管中加入2 3 個玻璃珠，緩慢振蕩混合均勻，置于消 化爐上，在消化管上加上漏斗，將溫度調(diào)節(jié)到2 5 0 c ，緩慢消化2h ，然后升高溫度到4 5 0 5 0 0 c ， 在消化過程中要不斷輕輕搖動，將附在消化管壁上的顆粒搖動下來，直至液體完全變成淡藍綠色 的清液，將液體再保持拂騰1 5h ，取出冷卻到4 0 ，與自動凱氏定氮儀接好，取2 0 m l1 0 硼 酸置于2 5 0 m l 三角瓶中，自動蒸餾直到蒸餾液收集到2 0 0 m l ，取出加入幾滴酚酞試劑，用已標 定好的o 1m o l l 鹽酸溶液滴定，記錄所消耗的鹽酸體積。同時做空白試驗，重復試驗三次，根 據(jù)以下公式計算： 租蛋白：掣x 1 4 x 6 剮o o 洼- _ 樣品t t - # v 廣空白試驗耗用鹽酸溶液體積，t ；v 廣樣晶耗用鹽酸藩液的體積，t ；一清定鹽酸的當 濃度n 1i # o l l i 2 2 2 8 豆豉中粗脂肪含量的測定 采用國家標準g b t1 4 7 7 2 - 9 3 測定豆豉中的粗脂肪含量，首先將索氏提取器各部位充分洗滌并 用蒸餾水清洗后烘干，底瓶在1 0 3 = e - 2 3 2 的電熱鼓風干燥箱內(nèi)干燥至恒重( 前后兩次稱量差不超過 0 0 0 2g ) 。精確稱取豆豉干粉2 0 0 0 0 舀移入底部已經(jīng)鋪好脫脂棉的濾紙筒內(nèi)，濾紙筒頂部同樣鋪好 脫脂棉，用棉線捆好濾紙筒，放入索氏提取筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的底瓶。注入無水乙醚至虹 吸管高度的三分之一處。打開冷凝水循環(huán)，將底瓶浸沒在水浴中加熱，水溫控制在6 0 8 0 。一般 提取6 1 2 h 。提取完畢后?；厥仗崛∫?。取下底瓶，在水浴上蒸干并除盡殘余的提取液。在1 0 3 = l - 2 c 的干燥箱內(nèi)干燥lh 取出，置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱量。重復干燥0 5h ，冷卻，稱量，直至前 后兩次稱量差不超過0 0 0 2g 即為恒量以最小稱量為準。粗脂肪含量以質(zhì)量百分率表示，按下 式計算： j ( 1 ：竺= 竺1 0 0 m 注：，卜品中租麝肪含量( 質(zhì)量百分事) ；- 雇瓶的質(zhì)量i 雇瓶和租膳肪的質(zhì)量dr 試樣的質(zhì)量b 1 7 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文第二章豆豉水提物對a - 葡萄糖苷酶體外抑制活件研究 2 2 2 9 豆豉水提物中蛋白質(zhì)的分子量分布 采用s d s - p a g e 凝膠電泳，其中分離膠聚丙烯酰胺濃度為1 2 5 ，濃縮膠濃度為4 5 ( 含o 1 s d s ) 。取1 0 0 0 9 豆豉凍干粉，溶解于1 0 m l 蒸餾水中，振蕩溶解均勻，離，l , ( 9 0 0 0r p m ，1 0 n a n ) ， 取1 0 0 皿上清液，加入等體積的樣品緩沖液。置于沸水浴中煮5m i n ，取出上樣。上樣量l o 皿。 染色采用考馬斯亮藍r - 2 5 0 。 2 2 2 1 0 豆豉樣品外觀顏色值的測定 取豆豉凍干粉置于圓形瓶蓋中( d = 2 5 m m ) ，覆蓋均勻，使用色差計檢測顏色l ，a ，b 值，記 錄數(shù)據(jù)，平行試驗重復三次 2 2 2 1 1 豆豉水提物在不同p h 環(huán)境下的d 一葡萄糖苷酶抑制活力的變化 取豆豉凍干粉溶解于蒸餾水中，使用p h 計分別調(diào)節(jié)p h 到2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，然后混合均勻， 離心( 3 7 0 0r p m , 1 5m i t t ) 取上清液，測定不同p h 值條件下的豆豉提取液的抑制活性。 2 2 2 1 2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用s p s s1 0 0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行o n e - w a ya n o v a 分析，使用s - n k 檢驗方法確定 數(shù)據(jù)之間的差異是否顯著，在p 0 0 5 水平數(shù)據(jù)之間差異顯著 2 3 試驗結(jié)果及分析 2 3 1 豆豉水提物對小鼠腸道內(nèi)的a 葡萄糖苷酶抑制活性 1 8 ( 研) 剪索俘嗥釁 囂id皇囂寫050p i一譬。暑暑皇8 n=oik暑皇暑苜芒曹0事jo掃點苗。暑百8，i甲；目t q 一，_ e 掣蜉囂囂蕾伽囂括鼉15黃彝糍*餐嘲瓤怛霉雄zn墨 巾驃疃龔 高o葛n n_【o6zn高onn萵器nn_【n o n o _ 【8 1 上i o_t_|=n_【n_【=o【oh口_n_i - c = = fi 4_ 一 d = = l 旺= l h h i m l - i 卜扛 + - i 1 e ic i - - l h h l 怔 - - - _ - “ j l 舊 卜_ - - - - - - - o o o 心 o o o o 口_ l 議毒掣蜒器囂末母鞋缸據(jù)帶辜口韶霉職*按嘲 靜括 杈黎掣孫+鞋撲k爿摟匠導 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文 第二章豆豉水提物對d 葡萄糖苷酶體外抑制活性研究 全國各種市售豆豉樣品水提物的n 葡萄糖苷酶抑制試驗結(jié)果如圖2 2 所示，通過對收集到的 3 7 種來源不同的豆豉樣品進行體外抑制試驗，結(jié)果顯示我國大部分豆豉樣品水提物均對小鼠腸道 內(nèi)的洳葡萄糖苷酶均呈現(xiàn)一定程度的抑制活性。根據(jù)口葡萄搪苷酶體外抑制試驗方法分析，所得 到的抑制斜率值( 磁) 越高，表明樣品的抑制活性越強。因此縱觀各種豆豉樣品對o , - 葡萄糖苷酶 抑制活性圖可以看出，我國傳統(tǒng)發(fā)酵所制的豆豉對* 葡萄糖苷酶的確存在著抑制作用。 s p s s 統(tǒng)計結(jié)果顯示5 # ( l y ) 、1 6 # ( w n h ) 以及2 1 # ( m w ) 豆豉樣品的水提物對弘葡萄 糖苷酶具有較高的酶抑制活性，其抑制斜率值( ) 顯著高于其他樣品( p o 0 5 ) ，其他品牌的豆 豉樣品呈現(xiàn)一個相對次低或較低的抑制活性。就豆豉生產(chǎn)的區(qū)域角度分析，三種具有高弘葡萄糖 苷酶抑制活性的豆豉來源產(chǎn)地不同，5 # ( l y ) 豆豉來源于湖南瀏陽地區(qū)，1 6 # ( w n h ) 豆豉來 源于四川地區(qū)，而2 1 # ( m w ) 豆豉則源產(chǎn)于江西。豆豉在我國的南方以及中部地區(qū)食用廣泛， 且生產(chǎn)廠家較多，并且許多農(nóng)戶自己制作豆豉食用，因此在加工工藝上存在著一定的差異以及不 穩(wěn)定性。此外從豆豉樣品中微生物的角度而言，5 # ( l y ) 豆豉源自湖南地區(qū)，而這一地區(qū)的傳 統(tǒng)發(fā)酵的豆豉主要以曲霉型為主，1 6 # ( w n h ) 豆豉和2 1 # ( m w ) 豆豉則均為毛霉型豆豉，因 此就本實驗篩選到的三種高活性的豆豉樣品而言，其體外抑制活性強弱并不是關(guān)鍵取決于某種或 某類微生物的存在與否；另外從感官角度分析。針對豆豉樣品的顏色而言，鐘( l y ) 豆豉、1 6 # ( w n h ) 豆豉樣品的外觀顏色為黑色，2 1 # ( m w ) 豆豉樣品的顏色為棕黃色，表明豆豉顏色 深淺與其昏葡萄糖苷酶抑制活性強弱無直接關(guān)系。但是不同的豆豉樣品又的確存在著a _ 葡萄糖苷 酶抑制能力的差異，那么差異產(chǎn)生的原因可能在于豆豉樣品生產(chǎn)廠家的加工工藝的區(qū)別，因此發(fā) 酵溫度、大豆品種、蒸煮條件、處理工藝以及發(fā)酵時間等等工藝條件的不同都有可能是導致豆豉 樣品弘葡萄糖苷酶抑制活性不同的因素。 綜上所述，盡管由于不同豆豉樣品的加工工藝不同而導致了豆豉樣品對。一葡萄糖苷酶抑制 活性的強弱不同，但可以明確的是我國傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉樣品的確具有顯著抑制小鼠腸道內(nèi)a 一葡 萄糖苷酶的作用，預示著我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉具有潛在的降血糖活性。 2 3 2 腐乳水提物對小鼠腸道內(nèi)洳葡萄糖苷酶的抑制活性 各種腐乳樣品水提物對葡萄糖苷酶的抑制活性測定結(jié)果見圖2 3 。試驗結(jié)果顯示雖然有部 分的腐乳樣品水提物對m 葡萄糖苷酶有抑制作用，但是活性很弱，其抑制斜率值鼬基本在4 0 以下；與豆豉水提物相比，腐乳樣品的抑制能力均較弱，其抑制能力水平僅相當于豆豉中最弱的 樣品，豆豉樣品中活性較高的三種豆豉樣品( 5 # ，1 6 # 及2 1 # ) 的抑制斜率值要顯著高于各種腐乳 樣品的抑制斜率值( p o 0 5 ) 。豆豉、腐乳同樣屬于大豆發(fā)酵食品，所使用的原料豆豉大豆，但是 二者的加工工藝明顯不同，豆豉是屬于整豆粒接種發(fā)酵，基本無成份的流失；而腐乳則不同，其 加工工藝存在三個關(guān)鍵點，一是研磨成漿時會排除豆渣，豆渣則是以纖維素、多糖、蛋白等組成： 二是在制作豆腐過程中，會擠壓排掉豆腐中的水分，因此會導致一些可溶性的蛋白、氨基酸及糖 類物質(zhì)的流失；三是在腐乳的后酵時期是采用豆腐坯在接種之后浸泡在水中發(fā)酵，這一階段也會 導致部分水可溶性成份的丟失。上述這些成份恰恰就有可能是能被微生物所利用合成a 葡萄糖苷 酶抑制劑活性成份，目前所發(fā)現(xiàn)的大部分a 葡萄糖苷酶抑制劑如寡糖、異黃酮、皂甙及生物堿類 2 0 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文 第二章豆豉水提物對a 葡萄糖苷酶體外抑制活性研究 物質(zhì)均是一些小分子的物質(zhì)，因此在腐乳制作過程中由于丟失了生成小分子物質(zhì)的前體或者直接 導致某些小分子的成份的丟失，因此就可能導致最終產(chǎn)品的降糖活性差或者幾乎無活性。 1 6 1 2 毒 捌8 鉻 在 纂 霉 4 o 鹵，王雨 宙譬 國t 目目一占由目宙目l | ! | | 1 23456 7 891 0l l1 21 3 樣品編號 圈2 3 腐乳水提物對d 葡萄糖苷酶的抑制活性 f i g u r e2 3a n t i 刪u c o s i d a s ea c t i v i t yo f s u f uw t e r - e x t r a d 2 3 3 豆豉水提物中蔗糖和葡萄糖的含量 豆豉水提物中葡萄糖和蔗糖的檢測結(jié)果如表2 6 。由于在r 葡萄糖苷酶體外抑制試驗中， 蔗糖和葡萄糖會產(chǎn)生一定的干擾作用，使得所測定的結(jié)果偏高；同時豆豉作為潛在降糖食品，對 明確其中葡萄糖以及蔗糖的含量也是十分必要的。檢測結(jié)果表明。部分豆豉樣品中的確含有一定 量的葡萄糖和蔗糖，如開渭口，永川豆豉等等，含量維持在1 8 以下。對于篩選得到三種具有高 抑制活性的豆豉樣品( 5 # 、1 6 # 和2 1 # ) ，在試驗的檢測范圍內(nèi)并沒有檢測到蔗糖的存在，但有微 量的葡萄糖存在，1 6 # ( - n h ) 樣品中含有1 8 8 的葡萄糖，2 1 # ( 乩) 豆豉中含有0 1 5 3 的 葡萄糖，而5 # ( l y ) 未檢到葡萄糖。與此同時配制相同濃度的葡萄塘標準品溶液，檢測其體外 口_ 葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果顯示其抑制活性僅在5 札8 ，而豆豉樣品水提物的抑制活性可以達 到6 0 左右因此本試驗結(jié)果表明盡管豆豉中有微量的葡萄糖存在，但所起的抑制作用甚微，因 此對豆豉樣品抑制活性檢測結(jié)果影響不大，同時也預示著豆豉中還存在著其他可以強烈抑制r 葡萄糖苷酶的活性成份，因此對于下一步的分析研究排除了干擾。 2 l 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文 第二章豆豉水提物對a 。葡萄糖苷酶體外抑制活性研究 囊2 6 豆豉中蔗糖和葡萄糖的含量( 單位：窖j 1 0 0g ) t a b l e2 6c o n t e n t so f s u c r o s en d g l u c o s ei nd o u c h is a m p l e s n i t ：g 1 0 0 曲 洼，。選出的一需性樣品l 一- 赫蓖一束t 舅 2 3 4 豆豉樣品的感官顏色與其q 葡萄糖苷酶抑制活性之間的關(guān)系 出于對豆豉與腐乳具有明顯差異的o 葡萄糖苷酶的抑制活性，考慮到可能原因之一是源于 二者的外觀顏色不同。通常情況下，豆豉由于在發(fā)酵過程中g(shù) a i l l a r d 反應的發(fā)生而產(chǎn)生了大量的 羰氨聚合物，導致豆豉最終產(chǎn)品顏色成黑褐色。而腐乳在不添加曲的情況下，顏色通常為白色。 全國市售豆豉的顏色值測定見表2 7 。色差測定分析，外觀顏色l 值表示的是樣品的顏色黑白程 度，當l 越大表示所測得的樣品外觀顏色偏白，l 越小表示樣品外觀顏色偏黑；a 值越大則偏紅， 越低則偏綠；b 值表示隨其增大，顏色越偏黃，反之偏藍從表2 7 中可以看出，三種高活性的 豆豉樣品5 # ( l y ) 的l 值為2 0 0 3 5 ，1 6 # ( w n h ) 的l 值為1 8 1 5 0 ，而2 1 # ( m w ) 的則是 4 5 0 6 0 ；從感官評價來看，也的確如此，2 1 # ( m w ) 豆豉的顏色更偏黃些，另外兩種豆豉的顏色 里深黑色。根據(jù)表2 7 的試驗結(jié)果顯示。豆豉樣品并沒有隨著顏色l ，a ，b 值的升高而活性升高 或降低，也就是并不會呈現(xiàn)相應的變化。即二者之間不存在相關(guān)性。因此本試驗也表明豆豉中存 在的一些美拉德反應的產(chǎn)物可能不是導致豆豉高* 葡萄糖苷酶抑制活性的原因，因此豆豉的外觀 顏色與其抑制活性的高低不存在相關(guān)性或相關(guān)性很小。 裹2 7 豆豉樣品外觀顫色值 ：! ! ! ! ! ! ：! ! 竺! ：翌! ! ! 竺! ! 竺竺：坐! ! 竺! 竺 顏色值 編號 樣品代碼 一 a v e r ( l ) 士s da v e r ( a ) s da v e r ( b ) s d l y j q 1 2 8 l 士0 o l 8 0 9 士o 0 91 4 9 8 ：- 0 0 5 2 & s 1 5 ，0 9 5 士o 0 28 5 1 士o 0 21 6 3 4 - x - 0 ，0 4 3 x q1 8 6 9 - 0 o i8 7 3 - - 00 52 1 ，2 1 ：t = 0 0 3 4 h s 1 6 1 2 5 z 0 o l8 5 伽o l 1 9 2 6 = 1 = 0 0 1 5l 一 2 0 0 3 5 - - 0 0 5 94 5 5 - 士0 0 72 i 3 3 5 - 0 1 0 6 t n q 2 0 0 7 5 - 0 0 3 1 0 5 - 0o l2 2 7 3 5 - j = 0 0 9 7 y e x 3 2 1 8 士0 0 3 l n 0 4 士0 0 32 6 9 8 5 = , = 0 o l 8 q w 2 6 2 9 5 - , = 0 0 2 7 6 7 ：f 0 0 32 1 3 3 ：1 = 0 0 6 9 t ，m s 3 1 2 4 5 - x - 0 0 49 9 3 5 i - 0 0 2：2 5 3 9 5 - x 4 ) 0 3 1 0 & m 2 6 1 4 5 - 00 61 4 4 4 5 - - 0 0 53 1 8 8 5 0 0 3 l l j 2 4 5 i f r o 0 89 7 = 1 ：0 0 1 2 4 8 士o 0 2 1 2y 一 3 5 3 8 5 - 0 0 21 2 3 8 - i = 0 0 1 3 2 3 2 士0 0 | 1 3 】x 3 6 9 9 5 - 女0 0 71 2 3 5 5 = l = 0 o l 3 2 7 9 5 - 00 2 1 4w 一4 4 0 7 5 ：- 0 0 1 1 1 0 5 5 = t ：0 0 2 3 1 a 2 5 - 0 o l 1 5 f w 2 7 7 1 5 - j = o o i 9 9 1 - 0 o i2 2 8 6 i - 0 o l 1 6 w n 1 8 1 5 0 - - 0 0 2 1 2 4 1 = 1 = 00 22 5 9 4 5 j = 0 0 3 1 7 t c 1 4 7 6 5 - 0 0 4 1 2 2 6 5 - 00 22 1 1 8 5 - 0 0 2 1 8 j x 4 9 9 3 5 卸0 3 1 6 5 8 - * 0 0 44 7 2 9 - - 00 7 1 9 d x 2 0 1 3 5 - - 0 0 47 9 4 5 - t 0 ，0 61 8 9 5 5 0 0 2 2 0j 一 2 2 1 4 5 00 88 8 ( k - 0 0 3 2 1 6 - 0 0 5 2 l m w 4 5 0 6 0 士0 0 2 1 2 6 3 5 - x - 0 o l3 7 3 9 - j = 0 0 4 2 2 q x 5 1 6 0 5 - - 0 0 3 9 1 缸- 0 0 13 3 3 3 5 0 0 6 2 3 g y 5 4 3 5 0 士0 o i9 5 6 士o 0 53 3 9 8 _ 4 - 0 o l 2 4 l y 2 0 1 3 0 士0 o il1 0 4 - j = o o l2 1 1 8 2 - 4 - 0 0 3 2 5 y 一 2 8 3 0 0 0 0 31 1 1 7 5 - x - 0 0 1 2 8 7 2 5 - 士o 0 2 2 6 n n 3 6 3 6 鋤0 45 2 9 i 0 o i 2 2 1l = l = o 0 l 2 7y 一4 5 5 5 5 - x - 0 0 2 1 5 2 8 5 - 0 0 2 4 1 7 2 5 - x - 00 2 2 8 j l1 0 # 5 9 8 4 士0 0 78 9 4 - 0 0 3 3 3 5 6 5 i - 0 0 3 2 9 j l9 #4302士o03 1 0 3 0 = l = 0 ，0 62 9 3 8 2 - i = 0 o l 3 0x 一 3 9 9 4 5 - 0 2 8 1 3 1 7 5 = 1 = 0 0 33 6 0 4 - a ：o 0 2 3 l t j 2 5 7 2 0 0 0 l 1 4 2 6 5 i 0 o t2 7 7 4 f r i - 0 0 2 3 2 z j 2 8 3 1 1 - 0 0 11 2 3 3 7 - 0 0 22 5 6 2 3 - 0 o l 3 3l s 一4 5 ，0 4 5 4 ) 0 2 1 0 1 5 5 ：t - 0 0 23 0 4 2 6 卸0 3 3 4 k m 4 8 7 5 5 4 ) 0 51 5 6 7 ：1 = 0 0 3 4 3 9 5 士o 0 l 3 5 x f j 4 1 0 1 5 - 0 0 3 1 1 ，7 9 - j ：0 0 23 1 6 3 = 1 = 0 0 5 3 6w 一1 8 0 2 2 - 0 0 2 1 0 1 i = l = o o i1 7 8 8 - 0 0 5 2 ：竺：! ：竺! ! ：j ! ! 生：絲 ! ：! ! ：! ：絲! ：! ! 墊：! ! 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文第二章豆豉水提物對a 葡萄糖苷酶體外抑制活性研究 2 3 5 豆豉水提物在不同p h 條件下對* 葡萄糖苷酶的抑制能力 選擇6 種具有相對較高的a 葡萄糖苷酶抑制活性的豆豉，研究其在不同p h 環(huán)境條件下抑制 活性是否受到影響( 圖2 4 ) 。試驗結(jié)果顯示豆豉水提物在分別調(diào)節(jié)p h 在2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 后，6 種豆豉所表現(xiàn)出來的抑制活性并無明顯變化。通過本試驗結(jié)果說明豆豉水提物中的* 葡萄糖苷酶 抑制活性成份不受酸堿條件的影響。由于本試驗所收集到的豆豉樣品的p h 在4 8 6 8 之間，為了 排除豆豉中的酸類物質(zhì)會對小葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用，因此針對豆豉樣品在不同p h 環(huán)境下的 體外抑制活性進行了檢測。通過本試驗結(jié)果也初步確定：( 1 ) 豆豉中所存在的活性成份可能并非 是某些有機酸類物質(zhì)，因為酸性物質(zhì)在不同的p h 條件下，其結(jié)構(gòu)、結(jié)合能力，活性基團都可能 會發(fā)生變化，因此就會導致其功能活性的差異；( 2 ) 豆豉中的活性物質(zhì)不受酸堿條件的影響，例 如是一些小分子的糖類，小肽類或者是異黃酮等等，這些物質(zhì)在各種p h 下通常結(jié)構(gòu)不會發(fā)生變 化。因此活性保持一致，能過較好的維持其話性 v 爵 幕 霉 p h 值 圄2 4 豆蕞在不同p l l 條件下對p 奢蕾簟苷蕾鈞押翻事 i q g u r e 2 aa l t j - a - z l m c o s i d t s et c t i v i i y d o a c b is i n p - a t j o u sp l i 2 3 6 豆豉中總糖和還原糖含量對其q 一葡萄糖苷酶抑制活性的影響 豆豉中總糖及還原糖含量的測定結(jié)果見圖2 5 、2 6 和表2 8 。測定結(jié)果顯示部分豆豉樣品隨 著其總糖和還原糖含量的升高其a 啼萄糖苷酶抑制活性增強，如圖2 5 中i i # 、1 6 # 、2 1 # ，3 2 # 以及3 6 # 等等，均是還原糖含量相對較高，同時也表現(xiàn)出較高的抑制活性；但也有例外情況，在 圖2 5 中的n o 5 ( l y ) 樣品盡管具有較強的a 一葡萄塘苷酶抑制活性，但是還原糖含量較低對 于總糖分析結(jié)果顯示( 圖2 6 ) ，部分具有較高抑制活性的豆豉樣品同時總糖含量也相對較高。依 據(jù)本試驗結(jié)果綜合分析，確定豆豉樣品中總糖及還原糖與其a 一葡萄塘苷酶活性存在一定關(guān)系， 說明豆豉中存在的。一葡萄糖苷酶抑制成份有可能是糖類物質(zhì)或者是糖類的衍生物。而且目前所 發(fā)現(xiàn)的。一葡萄糖苷酶抑制劑大多為糖類物質(zhì)( 多糖、寡糖及羰胺類物質(zhì)) ，又如一些化學合成的 中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文第二章豆鼓水提物對n 葡萄糖苷酶體外抑制活件研究 。一葡萄糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖，伏格列波糖等也都是具有類似糖類結(jié)構(gòu)的化學成份但試 驗結(jié)果同時也表明豆豉中的降血糖活性成份可能不只是糖類成份，還有其他的成份在發(fā)揮著相同 的作用。抑或不同豆豉樣品中存在著不同結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的降糖成份。盡管如此，試驗結(jié)果無疑明確 了豆豉中的糖類物質(zhì)是。一葡萄糖苷酶抑制成份的一種組成。 囊2 8 豆豉原料中總糖和還原糖含量的測定 t a b l e 2 名c o n t e n t s o f t o 伽s u g a r dr e d u c e ds u g a r n d o u c h l 編號樣品代碼 還原糖( )總糖( - ) 抑制斜率值( k i ) 1 y ，j q 1 8 7 3 so 4 3 乞0 0 5 o 2 68 4 7 4 5s so 船l s 0 1 50 8 3 5 s 0 2 5 1 3 0 6 3 6x q 2 4 9 l s 0 0 93 0 0 2 士o 1 2 7 4 6 7 7h s2 3 4 4 so 2 l4 5 9 2 o 2 l 6 0 4 1 9l y0 2 4 士0 1 80 7 4 8 6 s 0 2 7 4 3 6 5 l o t p q 4 8 5 6 s o o l l o 2 2 + 0 0 31 8 1 2 l ly p ，x5 3 2 6 士o 0 3 1 2 8 3 6 s o 0 38 9 3 0 1 2 q w 1 4 8 5 s o 0 95 3 3 8 o ，1 9 4 3 0 0 1 5t m so 8 7 2 士0 3 82 7 8 5 士o 3 4 5 7 4 6 1 6r ，m6 0 3 1 s o o l 1 2 9 7 3 士o 。3 t1 3 8 6 3 1 9a j3 0 0 5 士o 2 5 3 7 9 8 s o ，2 53 2 0 0 2 0y c2 3 9 8 s o 1 8 3 4 2 9 s o 1 28 0 6 0 2 1j , x6 3 2 8 士o 2 7 6 0 4 士o 2 71 2 2 3 0 2 4w zo 5 8 士o 0 51 9 4 3 s o 0 5 6 6 5 1 2 6f w0 7 0 l o 0 7 o 9 5 9 o 0 73 0 6 0 3 0w n h1 6 4 3 s o u 3 5 6 7 s o o t2 2 0 3 3 2t c4 5 5 3 o 2 6 5 0 2 3 s o 1 66 2 3 8 3 3j xo 4 3 so 0 6 o 9 8 7 士0 0 9o 3 0 l 3 6d x y 4 8 7 6 士o 2 75 6 7 8 3 士o 2 25 7 9 9 3 7j x 2 3 4 5 s o 2 22 粥8 土o 2 4 o 5 5 4 1 6 1 4 1 2 1 0 毒 糌8 磊 霖6 4 2 o 霉 v 骼 最 1 6 1 4 1 2 1 0 0 l2345 67 還原糖含量( ) 圖2 5 豆豉中還原糖含量與其抑制活性之問的關(guān)系 f i g u r e 2 $ t h er e l a t i o n s h i p o f r e d u c e d s u g a r a n d a n t i a - g l u c o s i d 目s e a c t i v i t y o f d o u c h i o2 468 總糖含量( ) 1 21 4 圖2 6 豆豉中總糖含量與箕抑制活性之間的關(guān)系 f i g u r e 2 6 t h er e l a t i o n s h i p o f t o t a ls u g a r a n d a n t i - a - g l u c o s i d a s e a c t h a y o f d o u c h i 中國農(nóng)業(yè)大學博七學位論文第二章豆豉水提物對a 葡萄塘苷酶體外抑制活性研究 2 3 7 豆豉樣品中水分、粗蛋白及粗脂肪的含量 豆豉部分營養(yǎng)成份的檢測結(jié)果見表2 9 。測定結(jié)果顯示，豆豉的體外抑制活性與其粗蛋白及 粗脂肪含量之間并無相關(guān)性，即表明豆豉中的活性成份并非蛋白類或者脂肪類成份。我國各地所 生產(chǎn)的豆豉的粗蛋白以及粗脂肪含量存在差異，高低不一。首先這與豆豉制作時所用的原料大豆 關(guān)系極大，普通的原料大豆粗蛋白含量大約為3 0 - 4 0 ，脂肪含量為2 0 左右；東北產(chǎn)大豆的粗 蛋白含量要略低于比華北及黃淮地區(qū)產(chǎn)的大豆( 李輝尚，2 0 0 5 ) ，而脂肪含量東北地區(qū)產(chǎn)大豆要 稍高，因此對于使用何種地區(qū)所產(chǎn)的大豆作為原料是直接影響豆豉最終蛋白含量的關(guān)鍵。大豆經(jīng) 過微生物作用之后發(fā)酵形成豆豉，大分子量的蛋白質(zhì)被水解成小分子的多肽或者氨基酸，一方面 提高了消化率，另一方面也是至關(guān)重要的，就是在此過程中會產(chǎn)生具有某些生物活性的小分子物 質(zhì)( j i a n - h u az h a n g , 2 0 0 6 ；y u n g - h s i a n g ，2 0 0 7 ) 目前大豆仍然作為食用油工業(yè)的主要原料，油脂 含量豐富且不飽和脂肪酸含量高，對機體有益。豆豉在發(fā)酵過程中微生物所分泌的脂肪酶會降解 利用掉一些油脂成份，但仍然存在1 0 左右油脂是風味組成中的重要成份，且很大程度上決 定了豆豉的口感，本實驗所使用的豆豉大部分含量均在1 0 以上，且經(jīng)品嘗均口感良好，風味 濃郁。 裹2 9 豆豉原料中水分、粗蛋白及精肪含量的定 1 t a b l e 2 9c o n l e n t l lo f m o l s l t u t e , p r o t e i n - n df h 缸d o u c 編號樣品代碼水分含量( )租蛋白含量( ) 脂肪含量( 薯)抑制斜率值( k i ) l y j q 1 2 5 9 + 0 1 31 5 3 1 2 + 0 2 31 4 8 7 9 ：t ：0 1 48 4 7 4 5s s 2 0 6 9 5 4 - o 1 12 5 4 5 2 o - 0 5 1 4 7 4 3 o o2 2 1 3 0 6 3 6x o 1 5 2 2 3 4 - _ o 1 72 5 8 1 7 o 0 8 n 1 2 3 o 0 5 7 4 6 7 7 h s1 7 9 9 士0 0 3 2 7 9 0 1 4 - o o l9 船7 4 - 0 1 56 0 4 1 9l y7 9 9 士o 1 32 0 0 0 6 4 - o