種植年限對杭白芍根際細菌群落及芍藥苷含量的影響 本文檔格式為 WORD,感謝你的閱讀。 摘要 為探尋栽培年限對杭白芍根際細菌群落及芍藥苷含量的影響，揭示根際土壤微生態(tài)與杭白芍品質(zhì)的關系，收集了 1 4 年杭白芍的根及根際土壤，利用 PCR-DGGE檢測土壤菌群多樣性；利用 HPLC 檢測根中芍藥苷含量。結(jié)果表明，種植杭白芍能明顯降低土壤的酸性，并隨著栽培年份增加 pH 酸性持續(xù)下降，到第 4 年時土壤 pH、酶活均達到最高，而有機質(zhì)含量則最低。變性凝膠梯度電泳檢測 1 4 年的根際細菌多樣性在 3.38 3.61，多樣性隨栽培年限而上升，說明杭白芍的生長會促進土壤中的細菌多樣性。測序結(jié)果表明，杭白芍土壤中的優(yōu)勢細菌為 變形菌、 變形菌、放線菌、酸桿菌及厚壁菌等，其中，根際特異菌主要為 變形菌、酸桿菌 Gp1 及放線菌；而在非根際土中 變形菌為特異優(yōu)勢菌群。此外， 1 4 年的杭白芍根際優(yōu)勢細菌組成基本相似，只有少數(shù)種類隨年份發(fā)生改變，表明根際細菌群落的組成主要受杭白芍物種的影響。 HPLC 檢測結(jié)果表明， 1 4 年杭白芍的芍藥苷質(zhì)量分數(shù)分別為 3.26%， 3.30%， 3.36%，3.41%，均超過國家標準，且隨生長年份呈上升態(tài)勢，但無顯著性差異。相關性分析可知，芍藥苷含量與土壤 pH、細菌多樣性呈顯著正相關，與有機質(zhì)呈顯著負相關。與其他有連作障礙的作物不同的是，隨著栽培年限的延長，杭白芍根際的pH 和細菌多樣性不降反升，但優(yōu)勢菌群變化不大，這可能是該植物不產(chǎn)生連作障礙的原因之一。研究表明，農(nóng)業(yè)實踐中之所以選擇 4 年采收杭白芍根入藥的原因之一主要是產(chǎn)量而不是有效成分含量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)有效成分芍藥苷的累積與土壤 pH、有機質(zhì)和細菌多樣性關系密切，證明杭白芍的道地性與土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關。 關鍵詞 杭白芍；根際；變性凝膠梯度電泳；微生物多樣性；高效液相色譜；芍藥苷 收稿日期 2013-12-13 基金項目 中國博士后科學基金項目（ 2013M531484）；浙江省博士后科研項目（ BSH1301033）；浙江省高校中青年學科帶頭人學術(shù)攀登項目（ pd2013215） 通信作者 袁小鳳，博士，副教授，主要研究方向為藥用植物學， Tel：（ 0571） 86633051， E-mail：13184220300163.com 白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥 Paeonia lactiflora 的干燥根，在中國有悠久的栽培歷史，馳名中外，其根并入藥，能養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽。臨床用于血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗，肋痛，腹痛，四肢攣痛，頭痛眩暈。主產(chǎn)浙江、安徽、四川等地。此外，山東、貴州、湖南、湖北、甘肅、陜西、河南、云南等地亦產(chǎn)。浙江產(chǎn)杭白芍的品質(zhì)最佳，居全國芍藥之首，是著名的道地藥材 “ 浙八味 ” 之一。杭白芍為多年生草本，其生長周期 4 6年，生產(chǎn)實踐中以 4 年收獲白芍根最為常見，藥典規(guī)定白芍飲片含芍藥苷（ C）不得少于 1.2%1。目前，在我國耕地 面積降低以及后備耕地資源不足的情況下，為提高耕地利用率，有必要研究 1 4 年的杭白芍其藥效成分的累積動態(tài)及中藥品質(zhì)，了解生長年限對杭白芍品質(zhì)的影響，探索采收種植 4年杭白芍的合理性。 研究表明，道地藥材是一個與生態(tài)環(huán)境、遺傳密切相關的開放的復雜系統(tǒng) 2。道地藥材的道地性與產(chǎn)地的氣候、土壤理化條件等環(huán)境生態(tài)方面關系密切 3。其中，土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心，它們直接或間接參與了土壤中幾乎所有的物理、化學和生物學反應，對土壤肥力及植物生長代謝非常重要，對道地藥材內(nèi)在成分的質(zhì)量影響最大 4。目前有 關杭白芍的研究主要集中在藥效、栽培和加工等方面，對于白芍的土壤微生物等關注不多，而了解其微生態(tài)環(huán)境對杭白芍生長的作用，以及杭白芍的生長年限反過來對微生態(tài)環(huán)境的影響，有助于闡明杭白芍道地性形成的微生態(tài)作用機制。因此，作者栽培并收集了 1 4 年杭白芍的根，同時收集其根際土壤，利用 HPLC 檢測根中芍藥苷含量，利用 PCR-DGGE檢測土壤菌群多樣性，分析杭白芍根際土壤微生態(tài)與杭白芍品質(zhì)的關系，為探索中藥道地性與環(huán)境生態(tài)的相關性提供理論支持。 1 材料與方法 1.1 實驗設計和樣品采集 野外栽培實驗 設在規(guī)范栽培基地磐安，實驗分 4 組： 2011 年栽培的杭白芍（一年生）；2010 年栽培的杭白芍（二年生）； 2009 年栽培的杭白芍（三年生）； 2008 年栽培的杭白芍（四年生）。實驗地設在同一塊地，土壤類型完全相同，每一組 1 m5 m ，相鄰而種，整個實驗過程設專人管理。 2011 年的 7 月 12 日晴天下午 14：00 左右采樣，用五點取樣法分別采集一至四年生杭白芍根及其根際土壤 5。采樣時，刨去表層土壤，將白芍整個植株挖出，輕輕抖掉根系上的大塊土壤，收集仍舊黏附于根部的土壤顆粒，每組大概隨機采集 10 株左右，所收集的土壤混 勻，過 20 目篩，以去除動植物殘體和石塊，此為根際土。將混合的根際土裝入 50 mL 無菌離心管，每組 3 管，放入冰盒，速帶回實驗室，保存于 -20 冰箱中，用于菌群多樣性檢測。同時采集 50 g 左右的根際土裝入無菌袋中，這部分土樣將自然風干，用于土壤理化性質(zhì)檢測。非根際土為對照土，是指與根際土相對應的土壤，采自與植物杭白芍根際有一定距離的同一地塊中，采集后現(xiàn)場處理方法同根際土。此外，采挖芍藥根，除去根莖及須根，洗凈，刮去粗皮，入沸水中略煮，使芍根發(fā)軟，撈出曬干、切片、打粉后待用 1。每個樣品 3 個重復。 1.2 土壤 pH、有機質(zhì)及酶活的檢測 采用電極法 6測土壤 pH，低溫外熱重鉻酸鉀氧化 -比色法 7測土壤有機質(zhì)，苯酚 -次氯酸鈉比色法 8測土壤脲酶活性，磷酸苯二鈉比色法 8測定土壤磷酸酶活性。 1.3 土壤總基因組 DNA 提取及 PCR 擴增 稱取 1.0 g 土壤樣品進行總基因組 DNA 的提取，具體的提取步驟按照UltraClean dNTPs， 2.5 L 的二甲基亞砜（ DMSO）以及 5 U的 Taq DNA 聚合酶。采用 Touchdown-PCR 策略： 94 預變性4 min，前 20 個循環(huán)， 94 變性 45 s， 65 退火 75 s（每個循環(huán)下降 0.5 ）， 72 延伸 1 min；后 10 個循環(huán)為94 變性 45 s， 55 退火 75 s， 72 延伸 1 min，最后再72 延伸 5 min。 PCR 擴增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將 PCR 產(chǎn)物進行純化（ Axygen DNA 分離純化試劑盒，美國）， -20 冰箱保存。 1.4 DGGE 及測序 利用 DGGE（ BioRad，美國）分離 PCR產(chǎn)物。制備變性梯度膠，使其變性梯度為 30% 60%，電泳緩沖液為 1TAE 。 DGGE 電泳條件為：電壓 160 V， 溫度60 ，時間 6.5 h。電泳結(jié)束后， SYBR-green I 染色 30 min，將染色后的 DGGE 膠用凝膠成像系統(tǒng) Gel Doc 2000（ BioRad，美國）拍照保存，用于多樣性分析。 DGGE 電泳之后，選擇相對比較清晰的條帶進行割膠回收，用 F357/R518引物進行 PCR 擴增，純化 PCR 產(chǎn)物。分子克隆選用 pMD18-T載體，宿主為 Escherich coli DH 5 （ Takara，日本）。將質(zhì)粒送檢測序（ Invitrogen，上海），運用 Blastn 程序?qū)⑺鶞y序列與 GenBank 進行同源比對（ http：/./blast），并在 RDP 數(shù)據(jù)庫中（ http： /）對序列進行種屬鑒定。 1.5 芍藥苷含量的檢測 根據(jù)中國藥典 2010 年版規(guī)定，利用高效液相色譜法檢測杭白芍根部芍藥苷的含量 1。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈 -0.1%磷酸溶液（ 1486 ）為流動相；檢測波長 230 nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于 2 000。取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成 60 mg L 芍藥苷溶液，即得對照品溶液。取本品中粉末 0.l g，精密稱定，置 50 mL 量瓶中，加稀乙醇，即為供試品溶液。將供試品利用 HPLC 進行芍藥苷含量的檢測。 1.6 數(shù)據(jù)分析及處理 利用軟件 Quantity One 4.4（ Bio-Rad，美國）分析 DGGE 圖譜。根據(jù) DGGE 膠條帶的位置和強度計算 Shannon 指數(shù) 10。數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件作 Pearson 相關性分析和主成分分析。實驗數(shù)據(jù)用 s（ STDEV）表示，方差分析認為， P四年生（ 3.59） 二年生（ 3.39） 一年生（ 3.38），可以看出，隨著杭白芍生長年限的延長，根際土壤的細菌多樣性整體呈上升趨勢。此外，與非根際土相比，杭白芍根際土的 多樣性指數(shù)顯著高于非根際土，說明杭白芍的生長促使在細菌在根部富集，體現(xiàn)出明顯的根際效應。 為進一步了解杭白芍土壤菌群結(jié)構(gòu)，將 DGGE 圖譜中比較清晰的條帶進行割膠回收（圖 1），共回收了 21 條帶，進行分子克隆后測序，在 NCBI 和 RDP 數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果見表2。測序結(jié)果表明， 21 個克隆全部為未培養(yǎng)菌，條帶長度在168 194 bp，主要隸屬于 變形菌 Gammaproteobacteria（ 5 條帶， 24%）， 變形菌 Alphaproteobacteria（ 3 條帶， 14%），放線菌 Actinobacteria（ 4 條帶， 19%），酸桿菌 Acidobacteria（ 2 條帶， 10%），厚壁菌門 Firmicute（ 2條帶， 10%）以及未知菌（ 5 條帶， 23%），說明杭白芍的根際土壤中的優(yōu)勢細菌為 變形菌、 變形菌、放線菌、酸桿菌以及厚壁菌。從圖 1 可以看出， S6（ uncultured Actinobacterium clone E1B-B3-114，放線菌）， S8（ uncultured Bacterium clone mus-c48，酸桿菌 Gp1）， S9（ uncultured Bacterium clone 106.52， 變形菌）， S10（ uncultured Alphaproteobacterium clone 3OL8， 變形菌）， S11（ uncultured bacterium RNA B1001R002_G23，酸桿菌 Gp1）， S15（ uncultured Bacterium RNA，未知菌）是根際土的特有條帶，說明杭白芍根際特有菌主要為 變形菌，酸桿菌 Gp1 和放線菌。 S1， S2， S5， S7 條帶在非根際土特有，而且非常亮，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)除 S2 為未知菌外，其余均為 變形菌，說明 變形菌為非根際土中的優(yōu)勢菌群。 2.3 不同生長年限杭白芍的芍藥苷累積動態(tài) 按照藥典 1規(guī)定，從實驗基地采回杭白芍根后，洗凈，除去頭尾和細根，置沸水中煮后除去外皮、生曬、切片、打粉后備用。從不同栽培年份的杭白芍的新鮮根可以非常明顯看到側(cè)根的生成以及次生生長。隨著杭白芍的生長，根系越來越發(fā)達，根的次生生長導致木質(zhì)化比例增加，周皮的顏色加深，主根越來越粗，而側(cè)根也越來越多。與一至三年生的杭白芍相比，四年生的根的生物量顯著增加，因此可以說，產(chǎn)量因素是選擇四年生杭白芍入藥的原因之一。將采來的樣本處理好后，利用高效液相色譜法對不同生長年限杭白芍的芍 藥苷含量進行了測定，見圖 2。隨著生長年限的延長，芍藥苷的含量逐漸上升，其中一年生的含量最低，質(zhì)量分數(shù)為 3.26%，四年生的芍藥苷含量最高，質(zhì)量分數(shù)達 3.41%，但不同年份含量的統(tǒng)計性差異未達到顯著水平。由于一至四年生的杭白芍的芍藥苷含量均遠遠超過國家標準，說明生長年限對芍藥苷的含量的影響不大，應該不是選擇四年生杭白芍入藥的主要原因，之所以選擇四年生杭白芍入藥其主要因素應該是產(chǎn)量而不是芍藥苷的含量。綜合外觀性狀質(zhì)量、產(chǎn)量以及指標成分含量分析，栽培杭白芍以四年生最為適宜。 2.4 土壤性質(zhì)與芍藥苷含量 的相關性分析 為了探索土壤對杭白芍生長的影響，對不同年限杭白芍根際土壤的 pH、有機質(zhì)、酶活以及土壤細菌多樣性、芍藥苷含量的相關性進行了分析（ Spearman， 1-tailed），結(jié)果見表 3。 pH 與有機質(zhì)呈極顯著負相關，磷酸酶和脲酶活性呈顯著正相關，芍藥苷含量與土壤 pH、細菌多樣性呈顯著正相關，與有機質(zhì)呈顯著負相關。以上關系表明，芍藥苷的累積與土壤 pH、有機質(zhì)和細菌多樣性密切相關。 3 討論 pH 對土壤微生物群落有著復雜的作用，它可以通過影響營養(yǎng)吸收及根外細胞酶的分泌，進而影響土壤微生物的 生長，一般來說，弱堿性適合細菌和放線菌的生長，酸性適合真菌的生長 12。土壤 pH 與栽培方式和種植年限密切相關，劉建霞等分析種植年限與黃瓜溫室土壤理化性質(zhì)變化規(guī)律的關系發(fā)現(xiàn)，土壤 pH 隨種植年限的延長顯著降低 13。許多研究均發(fā)現(xiàn)在持續(xù)一定年限后，設施栽培普遍出現(xiàn)土壤酸化和鹽漬化等現(xiàn)象 14，在一些不適合連作的作物中表現(xiàn)尤為明顯，與本研究結(jié)果正好相反。分析認為，這可能跟作物是否適合連作有關。不適合連作的植物多為一年生草本，而杭白芍為多年生半灌木，需連續(xù)種植 4 5 年才采收，這種栽培模式不同于連作，杭白芍在生 長過程中與土壤的互作可能與其他易產(chǎn)生連作障礙的作物不同，其根泌物的成分可能會導致pH 上升而不是下降，當然杭白芍根泌物的成分還有待下一步實驗證明。同時，隨著杭白芍的栽培年限延長，細菌多樣性也明顯上升，該結(jié)果與連作障礙的作物也不同 15-16。事實上，不同作物連作對土壤微生物的影響特性是不同的 17，而作物連作對土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的這種不同影響，可能也是有的作物不能連作，而有的作物能夠連作的原因之一18。 酸桿菌廣泛存在于自然界，在許多生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，主要分為 8 個類群 Gp1-8，大多 為嗜酸菌，目前對它們的了解還很少 19。其中， Gp1 類群對土壤 pH 非常敏感，當土壤 pH6.5 時在土壤中幾乎檢測不到 20。研究發(fā)現(xiàn)，杭白芍的根際土壤 pH 均 6.0， Gp1 被證實是杭白芍根際的優(yōu)勢菌群之一。有趣的是，在酸性最強的非根際土中 GP1 卻不是優(yōu)勢菌群。推測酸桿菌 Gp1 的生長和聚集除了 pH 以外，必定還與其他因素相關，可能與杭白芍的根泌物有關。目前對它們的研究還很少，值得進一步挖掘。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)杭白芍的另一類根際優(yōu)勢菌主要為 -變形菌，而非根際土中為 -變形菌。 -變形菌除包括光合的種類外，還有代 謝 C1 化合物的種類以及與植物共生的細菌等。 -變形菌包括一些醫(yī)學上和科學研究中很重要的類群，如腸桿菌科Enterobacteraceae、弧菌科 Vibrionaceae 和假單胞菌科Pseudomonadaceae，很多重要的病原菌屬于這個綱 21-22。由此可見，因為杭白芍的存在直接影響和決定了根際的優(yōu)勢菌群。 在植物生長過程中，根系作為植物和土壤的接觸部分，在從土壤中吸收水分、養(yǎng)分的同時，通過根分泌的方式向根周圍釋放出各種化合物，產(chǎn)生根際效應，進而調(diào)控或影響植株的生長發(fā)育 23。土壤微生物在 植物根際的定殖及分布也會受到根系生長發(fā)育、環(huán)境條件等因素的影響而表現(xiàn)出較為明顯的根際效應，并且根際微生物在調(diào)節(jié)根際微生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡、提高藥材對環(huán)境的適應性等方面起著非常重要的生態(tài)效應 24-25。根系分泌物是植物根系與根際微生物相互作用的信息物質(zhì)和決定因素 26，由于根根際效應往往導致根際及根表面的微生物種群密度和種類要明顯高于非根際土 27-29。杭白芍也不例外，其根際土壤 pH、有機質(zhì)含量、酶活性以及細菌多樣性明顯高于非根際土，體現(xiàn)出典型的根際效應，這與杭白芍根際向環(huán)境中釋放有機化合物有關。 HPLC 檢測結(jié)果表明，一年生的杭白芍其芍藥苷質(zhì)量分數(shù)已達 3.26%，符合藥典規(guī)定，也就是說從藥效成分的含量方面來看，一年生的根就可入藥，但生產(chǎn)實踐中，一般要 4 年以后才采收，究其原因，可能主要跟產(chǎn)量和效益有關。杭白芍為多年生亞灌木，一年生的根部與 4 年的根相比，由于根的次生生長導致地下部粗厚的程度和產(chǎn)量大大增加。此外，相關性分析表明，芍藥苷的累積與土壤 pH、有機質(zhì)和細菌多樣性關系密切，研究發(fā)現(xiàn)在道地產(chǎn)區(qū)磐安杭白芍的芍藥苷含量相當高，初步證明杭白芍的道地性與磐安土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關。在下一步的實驗中，將 研究杭白芍的根分泌物的組成以及非道地產(chǎn)區(qū)與道地產(chǎn)區(qū)的杭白芍對比，進一步探索杭白芍道地性形成的微生態(tài)作用機制。 參考文獻 1 中國藥典 .一部 S. 2005： 205. 2 肖小河， 陳士林， 黃璐琦， 等 . 中國道地藥材研究 20 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In the fourth year， soil pH and enzyme activity reached the highest level， while organic matter content was the lowest. The bacterial diversity had a positive correlation with growing years varied from 3.38 to 3.61. Sequencing results demonstrated that Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Actinobacteria， Acidobacteria and Firmicutes were predominant bacteria kinds in the soil of P. lactiflora. Gammaproteobacteria was only detected in the bulk soil， while Alphaproteobacteria， Acidobacteria_Gp1， Actinobacteria were only in the rhizosphere soil and the bacterial community among different growing years were similar except few species. HLPC results showed that paeoniflorin content was 3.26%， 3.30%， 3.36%， 3.41% separately from one to four-year-old P. lactiflora with an upward trend. The correlation analysis indicated that the paeoniflorin content had a positive correlation with soil pH and bacterial