離子交換柱層析法分離氨基酸一、實驗原理離子交換層析是利用離子交換劑對需要分離的各種離子具有不同的親和力（靜電引力）而達(dá)到分離目的的分離技術(shù)。離子交換層析的固定相是離子交換劑，流動相是具有一定pH和離子強度的電解質(zhì)溶液。樹脂（惰性支持物）上結(jié)合了陽離子或陰離子后，可與陰離子或陽離子結(jié)合，改變?nèi)芤旱碾x子強度則這種離子結(jié)合又解離。由于不同的氨基酸在不同的pH值和離子強度溶液中的所帶電荷各不相同，故對離子交換樹脂的親和力也各不相同。從而可以在洗脫過程中按先后次序洗出，達(dá)到分離的目的。帶電荷量少，與交換劑親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量大，與交換劑親和力大的后被洗脫下來。本次實驗采用的是Amberlite IR-120陽離子交換樹脂作為離子交換劑，分離的樣品為Asp和Lys兩種氨基酸的混合液。在一定的pH下，Asp和Lys的帶電情況不同，與磺酸集團(tuán)的親和力不同，因此被洗脫下來的次序不一樣。將各收集管分別用茚三酮顯色后，測定吸光度，從而得到洗脫曲線。二、實驗器材實驗儀器：層析柱、恒流泵、試管*30、吸管、移液槍、燒杯、紫外分光光度計實驗試劑：Amberlite IR-120陽離子交換樹脂、檸檬酸緩沖液（pH5.3）、0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸樣品（0.005mol/L的Asp和Lys，用0.02mol/L的HCl配制）三、實驗操作記錄1、樹脂的處理干樹脂經(jīng)蒸餾水膨脹，傾去細(xì)小顆粒，然后用4倍體積的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分別用蒸餾水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小時（轉(zhuǎn)型），用蒸餾水洗至中性。2、裝柱前的準(zhǔn)備選擇直徑1cm，長度1520cm的層析柱，觀察柱底端濾膜是否完好，分別用流水和蒸餾水沖洗干凈。將層析柱垂直裝在鐵架臺上，柱進(jìn)水口和出水口裝上橡皮管，關(guān)閉柱底端出口，在柱內(nèi)注入少許（約1cm高）的洗脫液，打開出水口，排凈管內(nèi)空氣后關(guān)閉出水口。3、裝柱向盛有已處理好的樹脂的燒杯中加適量洗脫液，用玻棒輕輕將樹脂攪成懸浮狀，然后沿柱內(nèi)壁小心地加至適當(dāng)高度。倒入速度不要太快，以免產(chǎn)生泡沫和氣泡。待樹脂在柱底部有明顯沉積（約1cm高）后，緩慢打開出口（或用滴管吸出柱內(nèi)上層過多的洗脫液），繼續(xù)加入樹脂直至樹脂沉積達(dá)5cm高。裝柱要求連續(xù)，均勻，無文格、無氣泡，表面平整，液面不得低于樹脂表面，否則要重新裝柱。4、平衡層析柱裝好后，接上已調(diào)好流速的恒流泵，用洗脫液以0.4mL/min的流速進(jìn)行平衡，直到流出液的pH與洗脫液pH相同（約需23倍柱床體積）。5、加樣關(guān)閉恒流泵，關(guān)閉層析柱底端出口，移去層析柱上端出口塞，緩慢打開層析柱底端出口，小心使層析柱內(nèi)液體流至層析柱床體表面時，立即關(guān)閉出口。用移液槍吸取0.5mL樣品液沿柱內(nèi)壁緩慢加入柱中，以免沖壞樹脂表面。加樣完畢后，慢慢打開層析柱底端出口，使液面降至與樹脂表面相平處關(guān)閉。吸取少量緩沖液沖洗柱內(nèi)壁數(shù)次，加緩沖液至液層34cm左右，接上恒流泵。加樣時應(yīng)注意避免沖破樹脂表面，避免將樣品全部加在某一局限部位。6、洗脫以檸檬酸緩沖液洗脫，洗脫流速24mL/h，每管4mL，10min一管（試管收集前提前編號）。7、測定分別取各管洗脫液1mL，各加入茚三酮顯色劑1mL，混合后沸水浴5min，冷卻，各加0.1%CuSO4溶液3mL,混勻，測定A570nm。以吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫液累計體積（每管4mL，故4mL為一個單位）為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。四、實驗結(jié)果1、吸光度測定結(jié)果試劑/mL0123456樣液1.01.01.01.01.01.0緩沖液1.00.5%茚三酮1.01.01.01.01.01.01.00.1%CuSO43.03.03.03.03.03.03.0A570nm0.0000.0150.4390.8850.0410.0890.090試劑/mL78910111213樣液1.01.01.01.01.01.01.0緩沖液0.5%茚三酮1.01.01.01.01.01.01.00.1%CuSO43.03.03.03.03.03.03.0A570nm0.1010.1040.0840.1380.1110.1220.0942、洗脫曲線按要求繪制洗脫曲線得：五、分析與討論1、由洗脫曲線可大致看出由兩個洗脫峰：第一個峰出現(xiàn)在約12mL時，這個峰形狀較明顯，峰窄而高，上升和降落都較為陡峭,判斷應(yīng)為Asp的洗脫峰。因為Asp的pI為2.97，pH5.3時Asp帶負(fù)電荷受陽離子交換樹脂的磺酸基團(tuán)排斥下，優(yōu)先洗脫出來。由于受到靜電排斥力的作用，Asp的洗脫較快且較為集中，故峰形狀窄而高。第二個峰出現(xiàn)在約40mL時，這個峰較為平坦，難以區(qū)分。從洗脫曲線可以看出，從20到52mL，吸光度的變化不大，且在48mL處還出現(xiàn)了小起伏，很難判斷峰出現(xiàn)在何處。第二個峰應(yīng)為Lys的洗脫峰，Lys的pI為9.74，pH為5.3時Lys帶正電荷，與樹脂的磺酸基團(tuán)親和力較高，故在通過樹脂時，會被樹脂吸附。之后在洗脫液的沖洗下逐漸與樹脂脫離從而洗脫出來。推測：因為促使Lys洗脫的只有重力和洗脫液的沖擊，而不像Asp那樣有靜電斥力，所以洗脫較為緩慢，所以峰平坦而不明顯，且持續(xù)較長時間。2、本次實驗中出峰較晚，第一個峰出現(xiàn)在第三管（其他同學(xué)大多出在