密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 博士學位論文 水稻苗 /穗瘟防衛(wèi)反應相關基因的分離與鑒定 .) .) I 摘 要 水稻對稻瘟病的抗性存在較大的差異，一些品種不但具有廣譜抗性且具有全生育期抗性，而另一些品種不但 對不同病原菌小種的抗性反應不同，而且不同生育期對同一病原菌小種的抗性反應也不同。為了探討小種特異抗性和生育期特異抗性的分子基礎，第一，選用穗期對稻瘟病抗 /感反應 差異的一對水稻品系，利用抑制消減雜交 （ ，分離水稻對穗瘟防衛(wèi)反應相關基因；第二，選用一個具有小種特異抗性的水稻品種，分離水稻 親和互作中差異表達的基因，并對篩選到的差異表達基因在不同生育期的表達進行了 析。 為了進一步研究差異表達基因的功能，還構建了水稻抗稻瘟病苗期和穗期兩個全長 庫。 選用遺傳背景相近、對葉瘟抗 性相同但對穗瘟抗性不同的兩個水稻株系 ， 利用 建穗瘟抗 /感消減 庫，經(jīng)差異篩選及序列分析，共獲得 90 個獨立的差異表達 隆。利用析了 26 個所篩選到的 隆在抗 /感植株接種后的表達， 17 個基因的表達差異得到驗證。 對這些 基因在穗期抗 /感植株中接種 稻瘟菌 后的表達譜進行 析，它們在抗 /感植株中受稻瘟菌感染后 或 被誘導或被抑制，但 在 抗 /感植株中被誘導 和 被抑制所發(fā)生的時間以及程度 不同 。 推測 號傳導途徑在水稻防衛(wèi)穗瘟過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用， 以同一水稻品種中 156 接種 不同稻瘟菌 小種， 通過 建水稻 親和互作消減 庫，結合差異篩選，經(jīng)序列 測定 及 析 ，共獲得 25 個獨立的 經(jīng)驗證的 差異表達 隆， 并對它們在苗期水稻 親和 /親和互作早期的表達譜 進行了分析 ，被檢測基因在非親和 /親和互作零點的表達水平相同，而在接種后 ，它們的表達發(fā)生變化，說明所有這些變化都是由于接種引起的；在兩種不同的互作反應中，大部分基因 的表達 變化趨勢一致，但存在程度的差異；少數(shù)基因表達變化在兩種互作中不一致， 說明這些表達的變化僅僅與接種的不同小種有關，肯定 了所分離到的基因及其表達變化的可靠性。 部分基因 在穗期受 不同 稻瘟病菌 小種 侵染后也 發(fā)生變化 ，但變化趨勢 與苗期有所 不同 。 信息學功能分析表明，苗期和穗期所篩選到的參與水稻稻瘟病防衛(wèi)反應的基因，都涉及到 病原菌或 環(huán)境 脅迫應答、信號傳導、轉錄、蛋白 合成與 修飾、代謝 、轉座 等生物學 功能。 本研究表明，無論在穗期或苗期，還是寄主特異或小種特異抗性的防衛(wèi)反應中，大多數(shù)參與水稻對稻瘟病防衛(wèi)反應的基因在抗病和感病反應過程中都被誘導或被抑制，這些基因可能作為基礎抗性基因參與到防衛(wèi)反應過程中，但由于它們表達發(fā)生變化的時間和程度的差異而 導致了抗性反應的不同；而少數(shù)基因在抗 /感反應過程中受病原菌侵染后的表達變化趨勢存在較大差異，甚至呈現(xiàn)完全相反的變化趨勢，這些基因可能在抗病反應過程中起主要的調(diào)節(jié)作用。但苗期和穗期對稻瘟病的防衛(wèi)反應存在一定的差異，因此推測，由于一些參與防衛(wèi)反應的基因不但受病原菌小種的誘導，而且也受水稻本身生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生了病原菌小種特異抗性和寄主生育期特異抗性。 關鍵詞 ： 稻瘟菌， 穗 /葉 瘟 抗性 ，小種特異抗性，防衛(wèi)反應相關基因 ， 抑制消減雜交，水稻 is a to in of of it be to to it to in in to at In to of to we to in by of in a to of of in SH in of 95/to by of 7 of 6 in of 6 at of or in or of in to of it is a in to be of of a 56 an a B1 of to SH in in of of 5 at of h of by or in of to of of in It is in of of of of 5 at to to at be or at of So we to in 56 be by of of to of in be in of or in of at as as in or in as in be of at of of A in in in in at of It be of by of of in to at .) 錄 第一章 緒論 . 1 物抗病的分子生物學基礎 . 1 物抗病基因的結構 . 1 蛋白的結構賦予了它的功能 . 4 基因與 因的互作 . 5 物抗病的特異性 . 7 原菌小種特異抗性的分子基礎 . 7 譜抗性的分子基礎 . 8 號傳導相關因子的克隆及結構 . 9 物防衛(wèi)反應相關基因 . 11 稻抗病性的分子機理研究進展 . 12 稻的抗病基因 . 12 稻的防衛(wèi)反應相關基因 . 14 物基因克隆方法 . 16 制差減雜交技術的基本原理 . 16 制消減雜交法的特點 . 17 術在植物基因克隆中的應用 . 17 望 . 18 研究的背景和意義 . 19 第二章 水稻穗瘟防衛(wèi)反應相關基因的分離與鑒定 . 20 料方法 . 20 稻材料 . 20 瘟菌接種 . 21 取和 離 . 21 制消減雜交 . 22 SH 庫的構建 . 23 減 庫的差異篩選 . 23 序及序列相似性搜索 . 24 異表達克隆的 析 . 24 果 . 25 SH 庫的構建 . 25 庫的差異篩選與 源性分析 . 25 異表達 隆的功能分類 . 26 向和反向文庫中差異表達克隆的比較 . 26 瘟抗感反應進程中 隆的 析 . 27 論 . 28 術和差異篩選 . 28 水稻抗稻瘟病研究中的應用 . 29 病和感病反應中差異表達基因的異同 . 29 V 稻穗瘟防衛(wèi)反應相關基因的功能分析 . 30 稻穗瘟抗性過程中的 號傳導途徑 . 34 第三章 水稻對不同小種稻瘟菌抗性差異表達基因的鑒 定 . 43 料與方法 . 43 稻材料 . 43 瘟病菌的接種 . 43 制消減 庫的構建和差異篩選 . 44 列測定及 源性分析 . 44 異表達基因的 析 . 44 果 . 45 減 庫的構建和差異篩選 . 45 選的差異表達基因 索與功能分類 . 45 異表達基因在苗期非親和 /親和互作中的表達譜分析 . 45 選的基因在穗期受稻瘟病菌侵染后的表達譜分析 . 46 論 . 47 親和 /親和互作中的差異表達基因的篩選 . 47 期非親和 /親和互作中差異表達基因的表達 . 49 異表達基因在苗期和穗期 受稻瘟病菌侵染后的表達分析 . 50 第四章 水稻抗稻瘟病全長 庫的構建 . 57 料方法 . 57 稻材料 與稻瘟病菌接種 . 57 長 庫的構建 . 57 庫質(zhì)量的檢測 . 59 菌體 變?yōu)橘|(zhì)粒 . 60 粒 提取 . 61 庫插入 小的分析 . 61 果 . 61 提取和 純 化 . 61 合成及其分級分離 . 62 庫的質(zhì)量分析 . 62 論 . 62 參考文獻 . 74 致謝 . 94 個人簡歷 . 945 圖及附表清單 圖 SH 庫插入片段凝膠分析 . 40 圖 于 差異篩選代表性結果 . 40 圖 向和反向文庫中差別表達克隆的功能類別百分比比較 . 41 圖 分所選克隆在抗 /感植株接種稻瘟病菌后的 達 . 42 圖 分所選到的克隆在抗 /感植株中的表達譜分析 . 43 圖 分差異表達克隆在中 156 中苗期接種不同小種后的 達譜 . 55 圖 分差異表達克隆在中 156 中穗期接種不同小種后的 達譜 . 56 圖 醛變性凝膠電泳圖譜 . 65 圖 鏈 脂糖凝膠電泳圖譜 鏈 酶切消化后的分級分離純化電泳圖譜 . 66 圖 白斑篩選測定文庫重組率中的一個平板 . . 66 圖 庫克隆 入片段的瓊脂糖凝膠圖譜 . 57 表 期抗 /感 庫篩選與序列同源搜索結果 35 表 期篩選到的克隆及其功能注釋 . 35 表 期抗 /感 庫中重復篩選到的克隆 38 表 SH . 39 表 5 個小種特異抗性差異表達克隆的 物列表 . 51 表 稻 親和互作中篩選到的差異表達基因 果 . 52 表 異表達基因在苗期和穗期接種稻瘟病菌小種 表達 . 54 表 156 苗期抗稻瘟病全長 庫的質(zhì)量檢測結果 . 64 表 梅 2 號穗期抗稻瘟病全長 庫的質(zhì)量檢測結果 . 64 第一章 緒論 1 第一章 緒論 植物抗病性及其 抗病 機制研究一直是植物病理學和植物抗病育種中的熱點問題 ， 多年來，通過傳統(tǒng)育種已成功培育出了許多抗病作物品種。 近年來， 分子生物學的發(fā)展為在分子水平上分析抗病機理成為可能，可以對植物防御和寄主 可以通過分子標記輔助選擇等更先進的技術制定選育作物新品種的策略，為長期的作物改良提供了新的現(xiàn)代生物技術方法 。 在自然環(huán)境中，植物不斷地受到病原菌微生物如真菌、細菌和病毒等的侵襲。在受到病原菌侵襲時，植株體內(nèi)產(chǎn)生生理和生化變化來防御脅迫。 植物對外界病原菌的防御體系包括其自身固有的和病原菌誘導的兩種。前者主要包括細胞壁的角質(zhì)、蠟質(zhì)、木質(zhì)素、特殊的氣孔結構、小分子抗病物質(zhì) (如毒性脂肪酸、酚類化合物、類萜與類黃酮類植保素以及有關的過氧化物酶、多酚氧化酶與苯丙氨酸解氨酶等 )、種子固有的抗真菌蛋白和能與真菌幾丁質(zhì)結合的凝集素、破壞真菌細胞透性的蛋白質(zhì)和核糖體失活蛋白等 (王鈞， 1998)。而后一類屬于植物第二層防御體系，只有 當病原菌突破植物固有的第一道防線時才起作用。 如果寄主植物具有抗病基因（ 能夠識別病原菌并激活植物的防御反應，則表現(xiàn)出局部或系統(tǒng)抗性 （ et 1996）。只有在先天防御不充分，或不能有效識別病原菌，或防御反應軟弱無效，且環(huán)境適宜等條件下，植物表現(xiàn)出感病。植物 抗病 基因與病原菌無毒基因（ 物 之 間直接或間接互作導致產(chǎn)生的 “基因 基因 ”的抗性是植物抗病性的 主 要形式 (1