密級 論文編號： 中國農業(yè)科學院 博士 學位論文 固氮斯氏假單胞菌四碳二羧酸轉運基因的 功能 鑒定 及表達調控研究 on of on of A i 摘 要 斯氏假單胞菌（ 一株分離自我國南方水稻根際土壤的聯(lián)合固氮菌，具有固氮和分泌植物激素等優(yōu)良特 性，但由于其碳源供應不足，聯(lián)合固氮效率不穩(wěn)定，在農業(yè)生 產中的應用潛力受到極大的限制。本研究采用生物信息學、分子生物學 等技術手段，以斯氏假單胞菌 碳二羧酸轉運（ 統(tǒng)為研究對象，構建了四碳二羧酸轉運調節(jié)基因 構基因 突變株和融合表達載體、開展了較為系統(tǒng)的生物學功能和表達調控研究，為通過基因工程途徑改造四碳二羧酸轉運系統(tǒng)，提高聯(lián)合固氮效率奠定理論基礎。 為研究四碳二羧酸轉運相關基因的 生物學功能，首先 構建了 攜帶功能完整的 因片段、可互補 點突變的廣宿主質粒 分恢復了突變株的四碳二羧酸轉運和固氮能力。在琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上， 攜帶功能完整 質粒 提高野生型菌株固氮活性 采用自殺性質粒 建了 斯氏假單胞菌四碳二羧酸轉運結構基因 極性突變株與非極性突變株， 極性突變株使得其下游的 因失活，突變株均不能利用琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸等四碳二羧酸進行生長和固氮作用。 采用插入突變技術構建了斯氏假單胞菌四碳二羧酸轉運結構基因 變 株，在以蘋果酸，延胡索酸，琥珀酸等四碳二羧酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上突變株不能生長，而野生型生長良好 。固氮酶的結構基因 合表達載體在 極性突變株與非極性突變株 、變株中較野生型菌株中的表達量大大降低，在以琥珀酸、蘋果酸或延胡索酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上測定的半乳糖苷酶活力最高僅為野生型菌株中的 表明斯氏假單胞菌的 因在四碳二羧酸轉運和高效固氮均具有重要作用。 通過功能互補、 融合基因表達等，開展了固氮斯氏假單胞菌四碳二羧酸轉運 建了 因啟動區(qū) 合基因表達載體，將其分別轉入 變株、 54 因子突變株或 變株中，通過測定半乳糖苷酶活性，檢測 動子的表達活性，結果表明： 動子為 54 依賴型啟動子，其表達需要 因子。葡萄糖抑制 因表達水平，四碳二羧酸誘導 因的表達，蘋果酸的誘導水平高于琥珀酸、延胡索酸，表明 因啟動子為誘導型啟動子。 包含 動子區(qū)及完整的 片段的質粒可以互補 突變，而不包含 動子區(qū)僅包含 片段，不能互補 突變，表明 用一個啟動子。 驗結果發(fā)現(xiàn)， 變株 1501，僅為野生型表達量的 ，進一步驗證了 動子表達需要調節(jié)因子 建了 因啟動區(qū) 合基因表達載體，誘導實驗結果表明 低水平組成型表達。 實驗結果結合生物信息學分析表明，固氮斯氏假單胞菌的四碳二羧酸轉運（ 統(tǒng) 由 兩個操縱子構成， 調節(jié)基 因， 結構基因。 四碳二羧酸轉移酶系由 因編碼， 含跨膜區(qū)， 跨膜區(qū)， 負責四碳二羧酸的跨膜轉運 。 跨膜蛋白，感應外界 四碳二羧酸 信號，激活 化的 白與 54 協(xié)同 啟動 因的表達。 關鍵詞 ：斯氏假單胞菌 因，突變，表達，調控 1501980, on of or of In of to of is In of of of in or as of in of as of of of of of on as of of in in 1501. on as It is to in of of in as to of of 54 of a 54of of of of of of of of a of in is of ct of a 4 4is by 1501. as a 4of 54 of 44of 1501， 錄 摘 要 . i . 一章 引言 . 1 碳二羧酸轉運載體的研究進展 . 2 菌四碳二羧酸轉運載體的分類 . 2 轉運載體 . 3 轉運載體 . 5 體 . 7 體 . 8 碳二羧酸轉運系統(tǒng)在生物固氮過程中的重要作用 . 9 生固氮菌中四碳二羧酸轉運系統(tǒng)研究進展 . 10 合固氮菌中 統(tǒng)研究進展 . 13 過對四碳二羧酸轉運系統(tǒng)的改造提高固氮菌的固氮水平 . 13 工作的立題依據(jù)與研究內容 . 14 第二章 四碳二羧酸轉運調控基因 能研究 . 16 驗材料 . 16 株和質粒 . 16 . 17 用緩沖溶液 . 18 用溶液 . 18 白電泳溶液 . 19 劑 . 20 驗方法 . 20 裂解法提取質粒 . 20 段的回收與純化 . 21 體和目標片段的連接 . 21 受態(tài)細胞的制備 . 21 接產物轉化感受態(tài)細胞 . 22 粒的接合轉移 . 22 組質粒的 測 . 23 株生長曲線的測定 . 23 株固氮活性測定 . 24 白含量的測定 . 24 核表達載體的構建及誘導表達 . 24 白質 丙烯酰胺凝膠電泳 . 26 果與討論 . 27 結構域分析 . 27 因表達載體的構建 . 27 建攜帶固氮斯 氏假單胞菌 因的質粒 . 28 變對 用四碳二羧酸能力的影響 . 30 因對菌株固氮活性的影響 . 32 v 第三章 四碳二羧酸轉運結構基因 功能研究 . 34 料與方法 . 34 株和質粒 . 34 入突變株的構建方法 . 34 性與非極性突變株的構建 . 35 提取 . 37 增反應 . 37 克隆 . 39 性突變體 段與非極性突變體 段的克隆 . 40 構建 . 40 . 41 接產物轉化感受態(tài)細胞 . 41 變株對四碳二羧酸利用的測定 . 41 果與分析 . 42 入突變株的構建 . 42 變株 生長特性的測定 . 44 變株的構建 . 46 變株對四碳二羧酸的利用情況 . 50 變株固氮酶活性的測定 . 51 論 . 52 第四章 因的表達調控的研究 . 54 料和方法 . 54 株和質粒 . 54 菌培養(yǎng) . 54 劑 . 54 物 . 55 性的測定 . 56 提 . 56 一鏈合成 . 57 的基因擴增 . 57 果與分析 . 58 變株的互補實驗 . 61 氮斯氏假單胞菌 合基因的構建 . 66 氮斯氏假單胞菌 合基因的構建 . 69 論 . 72 第五章 結論 . 75 參考文獻 . 76 附錄 . 85 致謝 . 89 中國農業(yè)科學院博士學位論文 引言 1 第一章 引言 氮素是限制農業(yè)生產的最重要的營養(yǎng)元素之一。世界農業(yè)對氮的需求平均每年增加 2%?；实氖┯秒m然對農業(yè)生產的提高做出了巨大的貢獻，但其過量施用產生硝酸鹽和亞硝酸 鹽，污染地下水，進而對人體健康造成威脅，同時還造成土壤板結，肥力下降。盡管自然界中只有部分原核生物能夠固氮，但生物固氮有效地維持了生物圈內的氮素平衡。地球上結合態(tài)氮總量的 70%來源于生物固氮作用，據(jù)國際權威機構估計（ 1995），每年全球通過微生物固定的氮素總量可達 2 億噸，約占全球作物需氮量的四分之三，相當于工業(yè)生產氮肥的三倍多，可見其在減少化肥施用、緩解環(huán)境污染、提高農作物產量等方面具有極大的潛力。 根據(jù)固氮菌與植物之間的關系，通常可以將生物固氮分為自生固氮、共生固氮和聯(lián)合固氮三種類型。研究最深入的 是自生固氮菌，迄今為止，有多種自生固氮菌的固氮基因組成已基本清楚，其中包括 固氮分子調控方面的研究，以 K. 為深入，該菌早在二十世紀七十年代就已經成為生物固氮調控研究的模式菌株 (S. 1971)。對共生固氮菌的研究自荷蘭的 1988）從豆科植物分離出根瘤菌以來已有 100 多年的歷史，在根瘤菌的形態(tài)學、生理學、生態(tài)學、生物化學、遺傳學取得了重要進展，近年來在共生固氮基因的定位、調控及與豆科植物的相互作用等方面取得了許多新的進展（黃大昉等， 2001）。在共生固氮菌中， 苜蓿根瘤菌） 生型大豆根瘤菌）和 菁固氮根瘤菌）等三種 共生固氮菌的固氮基因組成及固氮調節(jié)機制研究得較多（ 994）。聯(lián)合固氮菌存在于禾本科作物和牧草等植物的根際，并定植于植物的根際，但不與植物形成類似根瘤的特異化結構，其中包括桿菌屬）、 氮弧菌屬）、 氮螺菌屬）、 氮菌屬）、 桿菌屬）、 螺菌屬）、 氏桿菌屬）單胞菌屬）等（ 989， et 1987， et 1990，et 999）。在眾多的聯(lián)合固氮菌中，目前國內外以巴西固氮螺菌（ 斯氏假單胞菌（ 原命名糞產堿菌）、陰溝腸桿菌（ 研究的較為深入（黃大昉等， 2001，林敏等， 1989，平淑珍等， 2000，陳明等， 1999，江群益等， 1990）。涉及的基因有 固氮酶結構基因和氮代謝調控基因，四碳二羧酸運輸基因 氫酶基因 。 近年來，以聯(lián)合固氮為主的非共生固氮研究越來越受到各國政府和科學家的重視。聯(lián)合固氮菌廣泛分布于糧食作物如水稻、小麥、玉米以及各種水果蔬菜植物的根際，作為一種潛在的生物肥源具有固氮和分泌植物激素等諸多重要的生物學特性。聯(lián)合固氮菌主要結合于植物根表，不形成類似根瘤的特異化結構，與共生固氮體系相比，其固氮活性受外界環(huán)境因素影響較大，聯(lián)合固氮效率普遍較低，實際接種效果不穩(wěn)定，極大 地限制其在農業(yè)生產中的推廣應用。 眾所周知，生物固氮是一個非常耗能的過程，在最理想的條件下固氮酶將 原為 要 16 個 在自然條件下則更高。生物固氮過程極其復雜多樣，涉及到能量物質轉運系統(tǒng)、固氮酶合成和表達調節(jié)等分子機制，特別是對于生態(tài)分布廣泛而固氮效率低下的聯(lián)合固氮微中國農業(yè)科學院博士學位論文 引言 2 生物，研究其生物固氮機制，提高其聯(lián)合固氮效率，既具有實際應用價值，同時又具有重大的理論意義。 碳二羧酸轉運載體的研究進展 四碳二羧酸是細菌重要的碳源與能源物質，四碳二羧酸包括琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸和天門冬氨酸（四 碳二羧基氨基酸）等，它們可以在有氧和無氧條件下被細菌代謝產能。在有氧條件下，這些基質作為碳源與能源通過檸檬酸循環(huán)被氧化為二氧化碳。這一代謝過程需要四碳二羧酸向內轉運系統(tǒng)的參與。在某些代謝過程中，作為代謝終產物的四碳二羧酸必須被排出胞外，這一過程同樣需要四碳二羧酸轉運載體的參與（ , . 1997）。 在厭氧條件下的能量代謝過程中，由于缺少檸檬酸循環(huán)，琥珀酸不能參與能量代謝，僅有其它的幾種四碳二羧酸能夠參與能量代謝。延胡索酸在延胡索酸呼吸產生能量的過程中作為電子受體，而蘋果酸 與天門冬氨酸可以通過脫水和脫氨基等途徑轉化為延胡索酸 ,然后在延胡索酸呼吸產生能量的過程中作為電子受體（ et 2002 ； R et 2002 ）。延胡索酸呼吸過程中產生的代謝終產物琥珀酸則需要通過與延胡索酸、蘋果酸、天門冬氨酸的反向運輸排泄至胞外。 其它一些細菌可以通過細胞間質中的一些酶將延胡索酸還原，而不需要延胡索酸的由膜外向膜內的轉運系統(tǒng)（ J et 1994）。在很多發(fā)酵過程中，琥珀酸來源于糖類。琥珀酸不 能進一步代謝而被排出胞外（ A, et 1990），在腸桿菌的混合酸發(fā)酵過程中每摩爾的葡萄糖可以產生 爾的琥珀酸，在 檸檬酸發(fā)酵過程中琥珀酸作為最終產物而被檸檬酸與琥珀酸的反向運輸排出胞外（ , et 1980； , 1997）。 大量厭氧細菌的生長以四碳二羧酸的脫羧基作為能量來源， 生長需要以琥珀酸脫羧轉變?yōu)楸猁}的過程提供能量，并且需要琥珀酸與丙酸鹽的反向運輸系統(tǒng)。在蘋果酸乳酸發(fā)酵過 程中，乳酸細菌脫去蘋果酸的羧基，并通過乳酸與蘋果酸反向運輸系統(tǒng)，將乳酸排出胞外（ , 1998, ,et 1991）。 在真核細胞的葉綠體與線粒體中發(fā)現(xiàn)了不同的四碳二羧酸載體蛋白，由于其可以作為碳和氫的轉運載體而將線粒體的三羧酸循環(huán)和細胞質的糖酵解、糖的異生、乙醛酸循環(huán)聯(lián)系了起來，例如酵母在乙醇和乙酸上生長需要琥珀酸和檸檬酸的反向運輸（ , 1994）。 細菌中存在大量不同的四碳二羧酸載體蛋白，這些不同的四碳二羧酸載體需要完成大量不同的功能，并且 催化四碳二羧酸與 H ， 的同向轉運和同質、異質逆轉運，許多細菌具有一種以上的四碳二羧酸轉運載體。 菌四碳二羧酸轉運載體的分類 細菌的四碳二羧酸載體可以依據(jù)蛋白序列的相似性分為五類，四碳二羧酸轉運蛋白 膜外向膜內轉運四碳二羧酸的載體 不依賴 三組分周質轉運載體蛋白（ 大部分載體可以以四碳二羧酸（琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸）和天門冬氨酸作為轉運基質，但是由于四碳二羧酸的種類不同，其 也不盡相同。 好氧與兼性厭氧細菌中存在大量的 白家族的成員，它們是在有氧情況下催化向內轉運四碳二羧酸的載體。 族是四碳二羧酸與離子同向轉運載體蛋白家族，在細菌，古菌和中國農業(yè)科學院博士學位論文 引言 3 真核細胞中都有發(fā)現(xiàn)，它可以催化 H 和 與四碳二羧酸的同向轉運。革蘭氏陰性菌中與高 的 體，構成了 白家族的幾個亞類（ T, et 998 1998）。從低 量的革蘭氏陽性細菌 得到 革蘭氏陰性細菌中的 K.,2000）， 的 其他細菌的 緣關系很遠（ S. J. et 999, O. K, 1989, C. W., 1984）。 體僅存在于進行延胡索酸呼吸的厭氧與兼性厭氧細菌中，他們組成了一類獨立的蛋白家族（ et 1996,S et 1994, et 999, et 2000 ）。 同源蛋白，其相似性為 36， 體蛋白具有進行膜內外交換，向內轉運四碳二羧酸的功能，具推測也具有由膜內向膜外運輸四碳二羧酸的功能。 白家族被分為 個亞類。根據(jù) 變株的研究推測 轉運功能相似（ .,et 994）。 相似性僅有 22 24（ 998）， 具有的功能與 體類似，即在厭氧條件下具有進行膜內外交換，向膜內