密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 犬細小病毒 因的克隆、表達及在診斷應用上的研究 P2 P2 I 摘要 犬細小病毒?。?是由犬細小病毒 (起犬的一種急性傳染病。本病在世界各地均有發(fā)生，各種年齡、品種的犬易感，尤其是斷奶后幼犬的發(fā)病率和死亡率均很高。 隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，對犬病的防控日趨 重要。因此，制定積極有效的預防措施，獲得及時準確的診斷信息至關重要。 本試驗通過設計合成特異性引物，擴增 因并進行了原核表達，純化后獲得 組蛋白，以其為包被抗原建立敏感、特異、檢出率高的間接 法；同時用此方法對抗 異性單抗進行篩選，以獲得了抗 異性單抗。 根據 布的 因序列 ， 設計并合成一對特異性引物 ， 以 增出 因片斷，將其 克隆到 體中 。經過測 序后，將 因亞克隆至原核 表達載體 ，然后 轉入表達宿主菌 ， 表達了目的蛋白， 表達量為 29%， 分子量約為 67通過 明該重組蛋白具有抗原性 。 組蛋白 經 鎳離子親和樹脂 純化，純度達到 用 組蛋白作為包被抗原， 確定了最佳優(yōu)化條件和結果判定標準。通過特異性試驗證明包被的抗原僅與 準陽性血清發(fā)生反應，不與犬瘟熱、犬腺病毒、犬副粘病毒、波特氏桿菌等疫病的標準陽性血清發(fā)生交叉反應；與進口 劑盒進行比對，對血清樣品 92 份的檢測結果表明符合率為 對相同的血清樣品 48 份進行了 4 次重復試驗變異系數小于 16%。因此本試驗成功的 建立了檢測 清抗體的間接 法。應用該方法對國內部分地區(qū)采集的血清樣品 227 份進行檢測，其中 164 份為陽性，陽性率為 以純化的 免疫 c 小鼠，應用雜交瘤技術，采用已建立的間接 株，分別命名為 類鑒定結果表明 它為 鏈均為 k 型。果表明均與 組蛋白和 生反應，證明這些單抗具有良好的特異性。 關鍵詞 犬細小病毒， 組蛋白，間接 克隆抗體，應用 is an of by be in of by in of of it is to In of be to P2 P2 is in P2 by of P2 by A of is to P2 is 9% of a of 7a ml is by P2 as be PV is 2 of 8 of of is 6%. is on in of we 27 64 of is to c of c 4 P2 by of P2 P2 錄 前言 . 1 1 犬細小病毒病概述 . 1 原 . 1 態(tài)特點和理化性質 . 1 凝特性 . 1 養(yǎng)特性 . 2 基因組結構 . 2 碼的蛋白及功能 . 2 病機理 . 4 細小病毒病的流行病學 . 4 起源和的進化 . 4 的抗原型 貓中的出現 . 5 原流行情況 . 6 床特征和病理變化 . 6 細小病毒診斷方法 . 6 凝和血凝抑制試驗 . 7 毒分離 . 7 鏡與免疫電鏡 . 8 疫色譜法 . 8 聯免疫吸附試驗 . 8 合 酶鏈式反應 . 9 克隆抗體技術 . 9 2 研究目的和意義 . 10 實驗報告一 因的克隆及其在大腸桿菌中 的表達 . 11 1 材料與方法 . 11 料 . 11 毒 . 11 體與菌株 . 11 化試劑及試劑盒 . 11 要儀器設備 . 12 法 . 12 毒 提取 . 12 因的克隆與鑒定 . 12 組表達質粒的構建與鑒定 . 15 組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達 . 16 組蛋白的可溶性分析 . 16 達產物的純化 . 17 達蛋白的 定 . 17 2 結果 . 17 增 . 17 組克隆載體酶切鑒定 . 17 2.3 苷酸序列測定結果 . 18 V 組表達載體酶切鑒定 . 18 組蛋白 表達與純化 . 19 組蛋白 表達 . 19 組蛋白的純化及 果 . 19 3 討論 . 20 組蛋白原核表達 . 20 達載體的選擇 . 20 核表達條件的優(yōu)化 . 21 涵體蛋白的純化 . 21 目的蛋白的選擇及應 用 . 22 實驗報告二 接 斷方法的建立 . 23 1 材料與方法 . 23 料 . 23 驗用血清 . 23 要的儀器設備 . 23 接 作程序 . 24 接 斷方法的建立 . 24 原最適包被量與血清最適稀釋度的確定試驗 . 24 標抗體最適稀釋倍數與最適作用時間確定試驗 . 24 作條件的優(yōu)化 . 25 定標準試驗 . 25 法性能評價 . 26 異性試驗 . 26 感性試驗 . 26 內重復試驗 . 26 全病毒 測試劑盒檢測結果比較試驗 . 26 接 斷方法的應用 . 27 2 結果 . 27 接 斷方法的建立 . 27 原最適包被量與血清最適稀釋度的確定 . 27 標抗體最適稀釋倍數與最適作用時間確定 . 28 作條件的優(yōu)化 . 28 定標準 . 29 法性能評價 . 30 異性試驗 . 30 感性試驗 . 31 內重復試驗 . 31 全病毒 測試劑盒檢測結果比較試驗 . 32 用建立的診斷方法檢測國內部分地區(qū)樣品的結果 . 32 3 討論 . 32 接 法的條件優(yōu)化 . 32 接 斷方法的判定標準及應用 . 33 實驗報告三 抗 克隆抗體的制備與鑒定 . 35 1 材料與方法 . 35 料 . 35 胞、毒株與實驗動物 . 35 主要試劑 . 35 要儀器 . 35 法 . 36 原制備及純化 . 36 物免疫 . 36 細胞準備 . 36 飼養(yǎng)細胞的準備 . 36 疫脾細胞的制備 . 37 胞融合及選擇性培養(yǎng) . 37 性克隆的篩選 . 37 染和控制 . 38 胞的凍存 . 38 鼠腹水的制備 . 38 克隆抗體特性鑒定 . 38 2 結果 . 40 交瘤細胞的篩選 . 40 克隆抗體的腹水效價的測定 . 40 克隆抗體亞類鑒定 . 40 原識別位點分析 . 40 定 . 41 3 討論 . 41 性克隆篩選的要點 . 41 克隆抗體的 應用 . 42 結 論 . 43 參考文獻 . 44 附 錄 . 49 致 謝 . 52 作者簡介 . 53 中國農業(yè)科學院碩士論文 前 言 1 前言 1 犬細小病毒病概述 犬細小病毒?。?是由犬細小病毒 (起犬的一種急性傳染病，各種年齡的犬都能感染（ V, et 。 斷奶后的幼齡犬最為易感，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高達 70 以上 （ P M,et 。隨著年齡的增長， 成年犬一般只出現感染后的免疫反應，無明顯的臨床癥狀。 自 1983 年，徐漢坤等 （ 徐漢坤， 1983）正式報道犬細小病毒病在我國流行以來，該病對我國養(yǎng)犬業(yè)造成了極大的危害。 原 態(tài)特點和理化性質 細小病毒科，細小病毒亞科，牛犬細小病毒屬 的成員（ 方忠意， 2005） ， 具有細小病毒屬的典型形態(tài)和結構。病 毒粒子為等軸對稱的二十面體，無囊膜。在電鏡下觀察，病毒顆粒的外觀呈圓形或六邊形，直徑約 261993） 。核酸由單股 成， 占整個病毒粒子重量的 25 34 ， 分子量為 06 06，沉淀系數為 23 S 27 S。在 度梯度離心沉淀時，大部分感染性病毒粒子存在于 g/度節(jié)，小部分感染性病毒粒子存在于 g/衣殼和含有不完整 因組的病毒粒子分別存在于 g/g/殷震，1997） 。 外界各種理化因素有較強抵抗力。 耐受 65 30不喪失感染性，低溫長期存放對其感染性無明顯影響，室溫下可存活 90 天，在糞便中可存活數月和數年。對乙醚、醇類、氯仿、去氧膽酸鹽有抵抗力，而福爾馬林， 氯酸鈉、氨水、氧化劑和紫外線能使其滅活。 凝特性 凝特性較強，在 4 或 25 條件下不僅能凝集豬的紅細胞，而且能凝集恒河猴的紅細胞，這一特性可作為病毒鑒定的 參考指標（ 殷震， 1997） 。經福爾馬林滅火后，多學者研究證實， 間有共同的抗原組成，能發(fā)生血清學交叉反應，但又有各自的抗原成分。 據報道，在同樣的條件 (紅細胞、溫度、下， 血凝 (度至少比 8 倍。 間也有某些共同的抗原組成， 兩者之間能出現免疫熒光和血凝抑制交叉現象 。 能凝集馬、中國農業(yè)科學院碩士論文 前 言 2 貓和倉鼠的紅細胞 (徐漢坤 ， 1983； ， 1988) (， 1988)報道，應用硼酸緩沖鹽溶液和病毒調節(jié)稀釋劑 (凝集犬和綿羊的紅細胞，但不能凝集牛、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、地鼠、雞、鵝和人的 O 型紅細胞。 養(yǎng)特性 細小病毒的 制發(fā)生在細胞核內，其復制過程出現于細胞周期的 S 期。這是因為細小病毒 制完全依賴于宿主 合酶及其復制體系。利用 合酶抑制劑處理宿主細胞，發(fā)現細小病毒 宿主細胞內不能進行復制，現在已經證實細小病毒 制既可利用宿主 合酶，也可使用宿主 宿主 合酶的作用下，病毒 滾發(fā)夾模式進行復制，它通過自身 端回文序列所形成的反轉回折 3 端作為引物，起始 成。 在多種不同類型的細胞內增殖，近年常用 傳代細胞分離培養(yǎng)病毒。犬細小病毒的基因組是在感染細胞的染色體復制開始以后才在細胞核內合成的，說明犬細小病毒的復制能力有缺陷 (殷震， 1997)， 當體外進行病毒培養(yǎng)傳代時，不能象一般常規(guī)那樣，等到細胞形成單層后才接種病毒，而必須在細胞培養(yǎng)的同 時或最遲在 24 樣才能達到使病毒增殖的目的。 殖后可引起 胞脫落、崩解和破碎等明顯的細胞病變，病毒雖能在 胞內良好增殖，但無明顯細胞病變，有時出現細胞圓縮，并常形成核內包涵體。 基因組結構 一種自主復制的細小病毒，基因組是負股、單鏈、線形 因組含有 5 323個核苷酸 (2000)，是 毒中最小的。基因組含有兩個開放閱讀框架 ( 第一個 基因組左半部分 5 42成， 編碼非結 構蛋白 第二個 于基因組的右半部分，即 45 90編碼結構蛋白 個 別有自己的啟動子，非結構蛋白和結構蛋白的 止于共同的 ) 末端，且可通過 可變剪接形成不同的翻譯模板。 顯著的特點是基因組結構末端有發(fā)夾結構，該結構對病毒復制十分有效。位于 3 端的回文序列大約 115種 段自身能夠反折以形成一種發(fā)夾結構，這種結構較自身互補鏈間的氫鍵穩(wěn)定； 5 端也是回文結構，并且能形成發(fā)夾 (2000)，這一結構對 復制是十分重要的，由于病毒復制能力有缺陷，其基因組需在感染細胞的染色體復制開始后在細胞核內合成。 碼的蛋白及功能 因組主要編碼四種蛋白， 由早期轉錄物翻譯的非結構蛋白 期轉錄物翻譯的結構蛋白 病毒粒子中含有 3 種多肽 3 7和 5在空衣殼蛋白中只含有 種蛋白質。 子表面由 60 個中國農業(yè)科學院碩士論文 前 言 3 結構亞單位裝配而成， 90 ，而 占 10 ，因此 構成衣殼蛋白的主要成分。 存在于完整的病毒粒子衣殼蛋白中，是 基端水解掉 15 20 個氨基酸形成的，它只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后出現，其相對量隨著感染進程和發(fā)展而增加。 初合成的病毒蛋白是非結構蛋白，這是因為非結構蛋白的轉錄本要比結構蛋白的轉錄本出現的早，而且一個或兩個非結構蛋白負責對細小病毒的基因表達行使調控作用。有一些研究表明，細小病毒基因組編碼合成的 病毒基因表達具有反式激活功能（徐耀先， 2001）。 翻譯合成后，均產生磷酸化，而衣殼蛋白則在 N 端形成乙?；?翻譯后還可進行磷酸化，當這些衣殼蛋白在昆蟲細胞中合成時，它們能夠自我組裝形成病毒粒子。 高分辨率的 射線分析 衣殼，由 8 組反向平行的 折疊和 4 個鑲嵌于 折疊的大環(huán)組成。環(huán) 3 和環(huán) 4 通常組成長的 ，環(huán) 1、 3、 4 來自三個不同 子彼此緊密靠近、延長、相互作用于三倍體亞單位。這些亞單位高度纏繞在三倍體軸處形成一個 的突起，在這些突起上含有大部分與病毒的抗原物質相關 的殘基（ 994）。四個環(huán)構成病毒衣殼表面的大部分，并且包括從 構的 547 個殘基裂解下來的 364 個殘基。相反， 端的 37 個殘基很少見到，推測可能是由于 規(guī)則的自然結構。有結論報道，氨基端大部分離開五倍體軸而位于衣殼外表面，另一個重要的抗原位點已證明位于這些氨基端（ 1995； 1994； 1993； 1991）。 環(huán)的結構決定了病毒的許多性質，從抗原角度來看，兩個重要的 中和位點由這些環(huán)決定（ A， 1991） 。位點 A 來自同一 環(huán) 1 和環(huán) 2 以及三倍體分子環(huán) 4。環(huán) 2 在形成這個抗原位點時的作用表現在 222、 224 位點變異的結果。位點 A 涉及的抗原漂移還通過環(huán) 4 上的 426 殘基，使 成 2a 型和 2b 型。位點 B 位于環(huán) 3 的延長部分三倍體突起的肩部，包括 299、 300、 302 殘基。實際上， 300 位點殘基是最易突變的殘基。單克隆抗體識別這兩個決定簇影響血凝抑制（ 1994）。然而，這些改變不影響體內交叉保護。 白在病毒感染過程中起著極為重要的作用。缺失 白的突變體均喪失了對宿主細胞的再感染性。對 構蛋白的分析及編碼基因突變的研究發(fā)現， 殼蛋白某些區(qū)域，甚至幾個殘基對 染細胞有重要影響，如蛋白 93 位殘基以及鄰近 300 位區(qū)域對 應細胞有重要影響。 病機理 犬數種淋巴組織和腸粘膜細胞中復制，病毒引入途徑和起始復制位點在鼻口咽部位，包括扁桃體和其它淋巴組織（ 1987） 。動物可經非腸道的實驗方式感染，然而口腔是最主要的自然感染方式。病毒以病毒血癥的方式擴散， 1 3 天后可出現在扁桃體、咽淋巴結、胸腺和胸淋巴結。感染 3 天后。腸相關淋巴結組織也有病毒出現。因為病毒于腸粘膜上皮細胞的吸收作用無關，且腸粘膜上皮細胞感染發(fā)生在病毒血癥后，這中國農業(yè)科學院碩士論文 前 言 4 時才意識到病毒感染的重要性。因此，中和抗體進入循環(huán)系統(tǒng)能減小感染的腸粘膜范圍，但抗體水平不是很高時不能阻止感染。這一現象與疫苗作用相關，滅火的疫苗可在數個月內阻止疾病發(fā)生，但不能抗拒嚴重感染。細胞 因子在 染中可能發(fā)揮重要作用，但目前沒有相關報道。 細小病毒病的 流行病學 起源和 進化 不斷出現的新病毒潛在致病性給人類和動物不斷的威脅。貓細小病毒（ 導致的疾病主要集中在貓和浣熊上。直到二十世紀四十年代中期，當一種小病毒在水貂上導致高致死率而被發(fā)現后，病毒的發(fā)現者，將其命名為水貂腸炎病毒（ 用 常規(guī)方法難以區(qū)分 克隆抗體將 成三種抗原類型， 1983； 1984）。在七十年代末，在犬中出現另一種病毒，這種新病毒叫犬細小病毒 （命名為 這種細小病毒在全世界范圍迅速傳播，并且引起成千上萬只犬的死亡 (1995)。 出現之后，通過單克隆抗體又鑒別到兩株新的變異株，命名為 兩種新型病毒不斷在世界范圍內出現，幾乎代替了 。 2000 年 報道在貓體內出現和流行一種 新的細小病毒抗原型 種變異已被證實能減少病毒感染犬細胞的能力，并且增加病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性。 盡管準確的進化機制不清楚，這些新出現的 原型，能夠歸因于是 抗原病毒在犬體的適應。有趣的是，每一個新的抗原型具有至少一個與以前血清型相同的中和表位（ 1994）。 進化過程成為病毒進化的典型模型。 初是在 1978 年分離到（ 1979）。 血清學回顧溯源試驗顯示， 1976 年收集的血清中存在有陽性樣品。綜合各種對 子進化 研究結果發(fā)現，病毒的出現至少要提前 10年（ 2005）。 認為是一種來源于 宿主變異病毒。人們提出了各種關于病毒來源的猜測， 最為接受的有兩種觀點一：認為 源于 變異株（ 1995， 1998； 1999， 2006） ；觀點二：認為是 經由非馴養(yǎng)的食肉目動物演變?yōu)檫m應新宿主犬，比如 貂 、狐貍。由于動物在田間被圈養(yǎng)在高密度下，大部分研究者更傾向于后者 （ ， 1998； ， 1998） 。 一些有趣的發(fā)現支持 后一觀點：通過分析 因序列， 緣關系較 （ ， 1998； ， 2000）。更重要的是， 1983 年從芬蘭北極狐貍分離出的病毒株藍狐細小病毒（ 表現出 間的特征。在 列中， 三個同義的核苷酸改變，這三個載 特殊的。并且依據抗原性，狐貍的細小病毒劃分為 。這些發(fā)現表明，在犬科動物的家族中，一些動物如貂和狐貍 ，易于感染 病毒的這些動物有可能作為 先的貯存體。最近， 道從德國紅狐貍體內分離到一類似 間體細小病毒的中國農業(yè)科學院碩士論文 前 言 5 序列，具有一個 殊的非同義置換。盡管這種紅狐貍細小病毒有可能來源于傳統(tǒng)的 一位點的天然突變，這表明德國的紅狐貍可能是 直接祖先。 緣關系很近，分別是各自宿主犬貓重要的病原。 染犬和犬科動物如狼、北美山狗、南美山狗、亞洲浣熊，但不感染貓。 病毒能感染各種貓以及水貂、浣熊 也可能感染狐貍，但不感染犬。然而僅能感染貓的病毒（ 僅感染犬的病毒（ 間的界限不能像原先的犬病毒那樣確定。 于急性型，在自然中被新抗原型的 代，感染或在犬貓中復制，或是在兩者間轉移。毒表面蛋白的氨基酸序列是決定細小病毒宿主范圍的基本因素 , 僅