密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 番茄青枯病拮抗菌的篩選 、 鑒定和應(yīng)用研究 摘 要 番茄青枯病是一類危害嚴(yán)重的 世界性 土傳細(xì) 菌 病害 ， 它的有效防治已經(jīng)成為番茄生產(chǎn)中亟待解決的難題。 本研究從生物防治的角度出發(fā)，分離篩選了對(duì)番茄青枯病有拮抗作用的菌株，通過溫室盆栽試驗(yàn)和田間小區(qū)試驗(yàn)進(jìn)行了防治效果和田間應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。旨在為高效芽孢桿菌 的研制和使用 提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 主要研究?jī)?nèi)容有以下幾個(gè)方面： 1. 從山東壽光和蒼山不同種植年限的蔬菜大棚中分離得到 的 45 株菌株以及中國(guó)農(nóng)業(yè)微生 物菌庫(kù)中 保存的 19 株菌株中， 利用點(diǎn)接法 篩選到 14 株對(duì)茄科勞爾氏菌 有拮抗作用的菌株，然后通過牛津杯法復(fù)篩得到 6 株抑菌效果較好的菌株。通過溫室盆栽試驗(yàn)表明拮抗菌 防治效果最好，液體菌劑防治效果達(dá)到了 ，固體菌劑防治效果達(dá)到了 。 2. 對(duì)番茄青枯病拮抗菌 行了形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征測(cè)定，結(jié)果表明它與側(cè)孢短 芽孢桿菌種的特征一致。測(cè)定了菌株的 16S 列并根據(jù)其構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中， 側(cè)孢短芽孢桿菌形成一個(gè)類群，序列同源性為 99 %。因此將 定為側(cè)孢短芽孢桿菌 （ 。 3. 從 側(cè)孢 短 芽孢桿菌 酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科勞爾氏菌生長(zhǎng)的效 果，該抗菌蛋白粗 提液具有良好的熱穩(wěn)定性，能耐 90 的高溫；用蛋白酶處理，其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶 K 的影響；對(duì)氯仿敏感；隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，活性受到影響；拮抗物質(zhì) 25 保存，活性 28 d 內(nèi)基本不變；作用活性 圍較寬， 這對(duì)于芽孢桿菌用于生物肥料的生產(chǎn)和保藏具有一定的理論指導(dǎo)作用。 4. 根據(jù)溫室盆栽試驗(yàn)的結(jié)果，制備側(cè)孢短芽孢桿菌 固體菌劑，在山東 萊陽趙旺莊鄉(xiāng) 露地蔬菜栽培區(qū)和山東 肥城科技示范園的蔬菜大棚里 進(jìn) 行了 小區(qū)試驗(yàn)，對(duì)田間應(yīng)用效果進(jìn)行了測(cè)定。 結(jié)果表明 固體菌劑的兩種接種量對(duì) 番茄青枯病的防治效果分別達(dá)到了 和 ， 固體菌劑 蔬菜大棚施用能夠促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)和增加產(chǎn)量 。 5. 提取了 側(cè)孢短 芽孢 桿菌 基因組 綠色熒光蛋白（ 為報(bào)告基因 ,以啟 動(dòng)子探針 載體 ,通過鳥槍法在 大腸桿菌 構(gòu)建了 啟動(dòng)子文庫(kù) 。 通過篩選獲得了 14 個(gè)陽性克隆 ,編號(hào)為 對(duì) 隆中的重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行了測(cè)序和在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè) 。 結(jié)果顯示插入片段 有典型 的原核啟動(dòng)子的特征，其它五個(gè)插 入片段則沒有典型的原核啟動(dòng)子特征。 將 入到穿梭載體 建了含側(cè)孢短芽孢桿菌 身啟動(dòng)子和 質(zhì)粒載體，為監(jiān)測(cè) 側(cè)孢短芽孢桿菌 番茄根際的定殖提供了有利的工具。 關(guān)鍵詞 ： 番茄青枯 ， 篩選 ， 鑒定 ， 側(cè)孢短芽孢桿菌 ， 拮抗物質(zhì) ， 啟動(dòng)子is a in It is a to on of on of by It of 1. in by a in 10 , 2. of 10 10 6S 10 10 in 9 %. So 10 . 3. 10 is 0 . is by . It is to of is 8 d 5 . pH of to is .0 4. to of we on of in In of in 5. NA 10 10 . as by 14 1 by in 2, 14 to 3 6 35t. P6 of a to 10 in of 錄 第一章 引言 . 1 茄 青枯病研究進(jìn)展 . 1 科勞爾氏菌的分類地位 . 1 科勞爾氏菌的存活、侵染和傳播 . 2 茄青枯 病的防治 . 2 孢桿菌在植物病害生物防治中的應(yīng)用 . 3 云金芽孢桿菌 （ . 3 草芽孢桿菌 （ . 3 狀芽孢桿菌 （ . 4 衣芽孢桿菌 （ . 4 小芽孢桿菌 （ . 4 動(dòng)子克隆的幾種方法 . 5 用啟動(dòng)子探針載體克隆啟動(dòng)子 . 5 用 術(shù)克隆啟動(dòng)子 . 5 研究的目的和意義 . 9 第二章 番茄青枯病拮抗細(xì)菌的分離和篩選 . 10 驗(yàn)材料 . 10 樣來源 . 10 試病原菌和供試植物 . 10 養(yǎng)基 . 11 驗(yàn)器材 . 11 驗(yàn)方法 . 11 病力茄科勞爾氏菌的篩選和保存 . 11 株的分離和純化 . 11 抗菌的初篩 . 11 抗菌的復(fù)篩 . 12 苗土的制備 . 12 體菌劑的制備 . 12 體菌劑 吸附基質(zhì)的制備 . 12 體菌劑的制備 . 12 抗菌株的溫室盆栽試驗(yàn) . 12 驗(yàn)調(diào)查和數(shù)據(jù)的 統(tǒng)計(jì)分析 . 13 果與分析 . 13 離及篩選結(jié)果 . 13 抗菌液體菌劑的防治效果 . 14 抗菌固體菌劑的防治效果 . 15 論 . 15 第三章 番茄青枯病拮抗細(xì)菌 鑒定 . 16 驗(yàn)材料 . 16 種和培養(yǎng)基 . 16 劑和克隆載體 . 16 驗(yàn)方法 . 16 養(yǎng)特征和形態(tài)特征 . 16 理生化特征 . 17 菌 16S 定 . 19 果 . 21 養(yǎng)特征和形態(tài)特性 . 21 理生化特征 . 22 株的 16S 定 . 23 6S 列相似性分析 . 24 論 . 25 第四章 側(cè)孢短芽孢桿菌 抗物質(zhì)的提取和特性分析 . 26 驗(yàn)材料 . 26 試菌株 . 26 養(yǎng)基 . 26 驗(yàn)方法 . 26 體最適吸收波長(zhǎng)和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 . 26 抗物質(zhì)抑菌活性測(cè)定 . 26 菌濾液的制備 . 27 抗物質(zhì)的提取 . 27 抗物質(zhì)的穩(wěn)定性測(cè)定 . 27 驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 . 28 果與分析 . 28 體最適吸收波長(zhǎng)和生長(zhǎng)曲線 . 28 菌濾液對(duì)番茄青枯病原菌的拮抗作用 . 29 孢短芽孢桿菌 菌濾液鹽析得到物質(zhì)的拮抗作用 . 29 孢短芽孢桿菌 菌濾液乙醚萃取物的拮抗作用 . 29 抗物質(zhì)對(duì)熱的穩(wěn)定性 . 30 抗物質(zhì)對(duì)蛋白酶的 穩(wěn)定性 . 30 抗物質(zhì)對(duì)氯仿的穩(wěn)定性 . 31 抗物質(zhì)對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 . 31 抗物質(zhì)活性的有 效時(shí)間 . 31 菌濾液酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 . 32 論 . 32 第五章 側(cè)孢短芽孢桿菌 間應(yīng)用效果評(píng)價(jià) . 33 V 料 . 33 試菌株和培養(yǎng)基 . 33 間小區(qū)試驗(yàn)地點(diǎn)和番茄品種 . 33 體生防菌劑吸附基質(zhì) . 33 法 . 33 體菌劑的制備 . 33 東萊陽露地小區(qū)試驗(yàn) . 34 東肥城蔬菜大棚小區(qū)試驗(yàn) . 34 驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 . 34 果 . 35 東萊陽露地小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果 . 35 東肥城蔬菜大棚小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果 . 36 論 . 38 第六章 啟動(dòng)子的克隆和 記載體的構(gòu)建 . 39 驗(yàn)材料 . 39 株與質(zhì)粒 . 39 養(yǎng)基 . 40 生素及其工作濃度 . 40 和試劑 . 40 驗(yàn)方法 . 40 粒 大量提取 . 40 粒 小量提取 . 41 粒 切體系的建立 . 41 切片段的回收 . 41 動(dòng)子探針 I 酶切片段的 脫磷酸化 . 42 10 總 制備 . 42 10 總 酶切反應(yīng)體系的建立 . 43 10 總 酶切片斷與脫磷載體 粘端連接 . 43 腸桿菌 . 43 化 . 44 性克隆子的篩選 . 44 隆片段的序列測(cè)定 . 44 隆片斷的序列分析 . 44 記載體的構(gòu)建 . 44 光檢測(cè)與照相 . 44 果與分析 . 45 孢桿菌 提取和 A I 酶切 . 45 動(dòng)子文庫(kù)的構(gòu)建和陽性克隆子的篩選 . 45 動(dòng)子測(cè)序結(jié)果和分析 . 47 記載體的構(gòu)建 . 52 論 . 54 論 . 55 參考文獻(xiàn) . 56 致謝 . 62 作者簡(jiǎn)介 . 63 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 引言 茄青枯病研究進(jìn)展 番茄青枯病是由 茄科勞爾氏菌 （ 引起的一種毀滅性土傳 細(xì)菌 病害，廣泛分布于熱帶 、亞熱帶和溫帶地區(qū) （ 陳永芳等， 2003； 1991） 。 該病可造成植株大面積萎蔫死亡，一般田塊的發(fā)病率為 10 % 15 %，重病田的發(fā)病率高達(dá) 80 % ，導(dǎo)致番茄產(chǎn)量的嚴(yán)重下降， 造成 了 巨大的農(nóng)業(yè)損失（ 盧同 , 1998； et 2002）。 R. 有廣泛的寄主， 可以侵染 50 多個(gè)科的 200 多種植物， 其中 番茄、 馬鈴薯和煙草等茄科作物受害最為嚴(yán)重（ 1991）。 由它引起的 青枯病被稱為植物的“癌癥”， 是世界上分布最廣、危 害最嚴(yán)重且最難防治的重大細(xì)菌性病害。 近年來 由于“溫室效應(yīng)”所帶來的全球氣候變暖，該菌還表現(xiàn)出向高緯度冷涼地區(qū)蔓延的趨勢(shì)，給作物生產(chǎn)帶來極大的威脅 （李林章等， 2005），在我國(guó)該病已經(jīng)延伸到了內(nèi)蒙古和寧夏地區(qū)（何禮遠(yuǎn)等， 1995） 。 科勞爾氏菌的分類地位 青枯病從發(fā)現(xiàn)至今已有 140余年的歷史， 1896年美國(guó) 人 1992 年 根