密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 羊痘病毒 因的克隆、表達(dá)及多重 32 of 32 of I 摘 要 羊痘（ 由羊痘病毒（ 起的綿羊和山羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（ 為 A 類傳染病，在我國被列為一類動物疫病。羊痘病毒屬痘病毒科（ 脊椎動物痘病毒亞科（ 羊痘病毒屬（ 成員。羊痘病毒 白是位于羊痘病毒膜表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有中和抗原表位，是目前世界各地分離、鑒定的所有羊痘病毒毒株所共有的且特異性很強(qiáng)的羊痘病毒結(jié)構(gòu)蛋白。 針對羊痘病毒 反向末端重復(fù)序列結(jié)構(gòu)中的一段基因和 白基因 分別設(shè)計一對引物，進(jìn)行增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為 289969過對實驗條件的優(yōu)化，建立了診斷羊痘病毒的多重法。 經(jīng)試驗證實該法具有良好的特異性和敏感性， 可用于對羊痘病毒進(jìn)行快速診斷。 本研究應(yīng)用 術(shù)擴(kuò)增了 羊痘病毒 白基因 ，連接于 體， 再將目的基因插入到表達(dá)載體 ，經(jīng) 切及測序 鑒定 ，成功構(gòu)建了重組表達(dá) 質(zhì)粒 導(dǎo)，目的基因在大腸桿菌中以包涵體形式得到表達(dá)，目的 蛋白的分子量為 58能夠與羊痘血清反應(yīng) 。利用電洗脫方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化， 法檢測純化重組表達(dá)蛋白的活性，證明 純化后的 表達(dá)蛋白 依然保持了與羊痘標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的良好 反應(yīng) 原 性。 關(guān)鍵詞： 羊痘病毒； 因；表達(dá)；多重 a in is as is of of of on It is of is in in to of of 289bp 69bp by In to a of of By to PV 0-7 32 of CR to 32 NA of 832 be by It 32 be of by of 錄 第一章 前 言 . 3 第二章 文獻(xiàn)綜述 . 5 原 . 5 痘病毒基因組 . 5 痘 的發(fā)病機(jī)理和臨床癥狀 . 8 理變 化 .斷方 法 . 6 疫苗及免疫 .三章 羊痘病毒 測方法的建立 .料 . 13 法 . 14 果 .論 . 19 第四章 羊痘病毒 因的克隆及 其 在大腸 桿菌中的表達(dá) .料 .法 . 25 果 .論 .五章 結(jié)論 .考文獻(xiàn) . 46 致謝 . 51 作者簡歷 . 52 1 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 芐青霉素 基對 血清蛋白 胞病變 ,3,3氧膽酸 磷酸脫氧核苷 氧核糖核酸 化乙錠 二胺四乙酸 聯(lián)免疫吸附試驗 腸 埃希氏桿菌 胱苷肽 h 時 丙基硫代 千個堿基 B 培養(yǎng)基 克隆抗體 鐘 NC 酸纖維素膜 密度 放閱讀框 苯二氨 際動物 衛(wèi)生組織 el 丙烯酰胺凝膠電泳 酸鹽緩沖液 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 糖核酸酶 2 r/速每分鐘 s 二烷基磺酸鈉 二烷基肌氨酸鈉 羥甲基胺基甲烷 甲基乙二醇 向末端重復(fù)序列 43 g 克 L 升 mL 升 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 前言 3 第一章 前言 羊痘（ 稱“羊天花”，包括山羊痘和綿羊痘，是由羊痘病毒屬的山羊痘病毒或綿羊痘病毒引起的山羊或綿羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。其特征是體溫升高，精神不振，食欲廢絕，全身性丘疹或結(jié)節(jié)、水皰，口唇、舌面、鼻鏡、乳房、會陰及尾根處可見大小不等的痘疹。羊痘在非洲中北部、亞洲中部和西南部以及印度大部分地區(qū)呈地方性流行，我國及與我國接壤的一些周邊國家均有本病的發(fā)生。近年來，羊痘在我國南北省份均有流行，如黑龍江 (張前群 ,馬承俊 ,2004)、吉林 （ 鄧?yán)^軍 ,周霞 ,2004） 、河北 (林敏 ,倪鳳娥 ,2003)、福建 (廖振續(xù) ,1997)、甘肅 (王殿軍 ,1995)、貴州 (王開功 ,2003)、江西 (王效田 ,2001)、青海 (才旦 ,2004)、內(nèi)蒙古 (敖特根夫 ,2002)等省。該病發(fā)病率高， 傳播迅速， 可導(dǎo)致妊娠母羊流產(chǎn)，羔羊死亡，一旦暴發(fā)即造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。我國是畜牧業(yè)大國，也是養(yǎng)羊大國，預(yù)防和控制羊痘的發(fā)生與流行，對我國的經(jīng)濟(jì)和社會有著重要的意義。 羊痘病毒在分類上屬于痘病毒科（ 索動物痘病毒亞科（ 的羊痘病毒屬（ (et 1996)。羊痘病毒屬包括綿羊痘病毒（ 山羊痘病毒（ 疙瘩皮膚病病毒（ 羊痘病毒是雙股 毒，在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制 。電鏡下觀察 呈橢圓形，大小為 167292愛珍 ,2001)。 病毒中央由 蛋白質(zhì)組成的核心，核心凹陷，兩個側(cè)體分別位于凹陷內(nèi)。一層?xùn)艡跔畹暮诵哪ぞo貼于核心周圍。核心和側(cè)體一起，由脂蛋白性表面膜包圍，其間充填著可溶 性蛋白。羊痘病毒有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的囊膜，囊膜內(nèi)含有病毒特異的蛋白質(zhì)。 羊痘病毒為線形 雙股 毒，其基因組大約為 150大約有 75%A T， 共有 147 個開放閱讀框（ 和其他痘病毒一樣，羊痘病毒基因 組 包括中間編碼區(qū)和兩端相同的反向末端重復(fù)序列（ 基因組的中間區(qū)域（ 與其它病毒同源的保守序列， 所編碼的蛋白參與病毒復(fù)制，包括病毒的轉(zhuǎn)錄、 飾、 胞外被蛋 白膜包裹成成熟的病毒粒子等過程 (et 001)。與在疙瘩皮膚病 病毒 基因組上發(fā)現(xiàn)的相似基因一樣，羊痘病毒基因組兩端的基因序列（ 是與病毒毒力和宿主范圍相關(guān)的基因 (et 2001)。這些基因序列包括一個基因家族（ 5 個與 復(fù)基因和 3 個 復(fù)基因）及其它與病毒修飾或逃避宿主細(xì)胞免疫識別和反應(yīng)的相關(guān)基因和 負(fù)責(zé)編碼胞質(zhì)分裂絲蛋白、白細(xì)胞介素及痘病毒所特有的致病蛋白、宿主范圍 蛋白 的 基因 等 (et 2002)。 山羊痘病毒和綿羊痘病毒基因組的同源性非常相近，高達(dá) 96%。有研究表明，兩種病毒基因在自然條件下可能發(fā)生重組 (et 1998)。山羊痘病毒和綿羊痘病毒的氨基酸以及 氨基酸序列上山羊痘和綿羊痘之間差異較大的基因都在基因組的末端。 羊痘病毒的 白 由痘苗病毒 源的基因所 編碼 ，是羊痘病毒基因組的 段的一部分 (et 1999)。 段含有 5 個 痘苗病毒的因同源 (et 1986)。 白是位于羊痘病毒 囊 膜表面的一中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 前言 4 種主要結(jié)構(gòu)蛋白 (et 1994)，分子量為 32是羊痘病毒屬特有的蛋白，含有主要的抗原表位，在病毒感染早期產(chǎn)生抗體。針對該蛋白的單一血清可以中和羊痘病毒，這表明 可強(qiáng)烈的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫 (et 1993)。羊痘病毒的附著蛋白基因具有羊痘病毒屬的特異性，可作為 斷的 目的基因 ( 7 個縱向串聯(lián)的重復(fù)序列，是病毒增殖的非必需基因，在羊痘病毒基因組的末端形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的保守性 (et 1989)。羊口瘡與羊痘在臨床上最容易混淆，因此以 目的基因做 測可以區(qū)分這兩種病毒。 根據(jù) 發(fā)病動物臨床癥狀和流行病學(xué)特征 可對羊痘 做出初步診斷 。綿羊和山羊的臨床癥狀 相似，很難區(qū)別。要確診須進(jìn)行病原檢測、病毒中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗。目前國內(nèi)的一些方法如病原分離、電鏡觀察等較為耗時、費(fèi)力，有的還無法確診。羊痘病毒的分離是一個比較長的過 程，因為病毒在細(xì)胞上生長緩慢，一般 10 天后才出現(xiàn)比較理想的 了適應(yīng)診斷需求，我們需要建立一種快速、簡便并且準(zhǔn)確的診斷方法。 羊痘病毒 白是目前世界各地分離、鑒定的所有羊痘病毒毒株所共有且特異性很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白 (林敏 ,2002)。在國外， 白已經(jīng)用于羊痘病毒抗體的檢測，以重組 白作為抗原的間接 測感染后的羊痘病毒抗體要比中和試驗結(jié)果得到的早。澳大利亞動物衛(wèi)生實驗室的研究人員 H. G. (et 1999)在大腸桿菌中克隆并表達(dá)了 構(gòu)蛋白，研 究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)的全長 原和不同片段表達(dá)水平及表達(dá) 產(chǎn) 物的可溶性不同。經(jīng)切割的因片段雖然表達(dá)量比全長 因要高，但是其在 的反應(yīng)性較差。全長的 因表達(dá)的多聚組氨酸融合蛋白最適于作為 應(yīng)中的抗原。純化的蛋白活性保持不變，而且和綿羊痘病毒感染的血清反應(yīng)性很強(qiáng)。將 白用于 法進(jìn)行對羊痘的診斷，其敏感性和特異性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法，并且可以進(jìn)行批量樣品的檢測。 在國外，已成功利用多重 法從活體組織、組織培養(yǎng)物中檢測出羊痘病毒 (et 1998)。因為羊痘病毒屬于雙股 毒 ,故更適于 測。根據(jù) 人的研究，在羊痘基因組末端有一個末端反向重復(fù)序列（ 具有較強(qiáng)的保守性 (et 2000)。用一對以上的直接針對基因組不同區(qū)域的引物能夠 極大的提高檢測方法 的敏感性和特異性。 本試驗根據(jù)羊痘基因組末端反向重復(fù)序列 和 白基因分別 設(shè)計兩對特異性引物， 擴(kuò)增片段大小分別為 289 969初步建立了檢測羊痘病毒的多重 法。同時，對羊痘病毒 達(dá)，獲得了 重組抗原， 為 建立檢測羊痘抗體的 斷方法 奠定了基礎(chǔ) 。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 5 第二章 文獻(xiàn)綜述 羊痘（ 由羊痘病毒（ 起的一種可以感染山羊、綿羊的急性、熱性、接觸性傳染病。特征是發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和皰疹，內(nèi)臟病變（特別是肺），乃至死亡。根據(jù)不同毒株的毒力差異，易感羊群的致死率可達(dá) 10% 75%等，羔羊致死率高達(dá) 100%，妊娠母羊極易流產(chǎn)，受感染的羊群生產(chǎn)力也大大下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 該病的流行已 有很長的歷史，現(xiàn)主要分布在北非和 中非、印度次大陸 。 是危害養(yǎng)羊業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。該病已被世界動物衛(wèi)生組織（ 為 A 類重大傳染病，我國也將其列為一類動物疾病。 病原 羊痘病毒屬于痘病毒科（ 脊椎 動物痘病毒亞科（ 的羊痘病毒屬（ (et 1996)，可引起山羊痘（ 綿羊痘（ 牛的疙瘩皮膚?。?(et 2002)。羊痘病毒是一種親 上皮性的病毒，是唯一在細(xì)胞漿中復(fù)制的有囊膜的雙股 毒，呈橢圓形，大小為 167292病毒大量存在于病羊皮膚和粘膜的膿 皰 及痂皮中，適合在 綿羊的睪丸、腎、肺和甲狀腺單層細(xì)胞上培養(yǎng)繁殖，能使細(xì)胞產(chǎn)生病變（ 在發(fā)育的雞胚絨毛尿囊膜上亦可繁殖。其抵抗力表現(xiàn) 為 對熱敏感， 50以上很快使其失去感染力，在 3%的石炭酸、 5%的甲醛、 2%硫酸、 10%的高錳酸鉀中幾分鐘即被 殺死。本病毒對 10%漂白粉、 2%的硫酸鋅溶液有一定的抵抗力 (孟日 ,2005)。 羊痘病毒基因組 羊痘病毒屬包括綿 羊痘病毒（ 山羊痘病毒（ 疙瘩皮膚病毒（ 分別引起綿羊痘、山羊痘和牛的疙瘩皮膚病。三者之間關(guān)系緊密，同源性高。 因組 通過對多株 因組測序表明綿羊痘和山羊痘的基因 組 大約在 150間，大約含有 75%的 A T(et 1998)。像其它痘病毒一樣， 因組含有一個中央編碼區(qū)，在其兩端各有一個同源的末端倒置重復(fù)區(qū)（ 大約含有 2000 個核苷酸，不同的毒株有的堿基數(shù)目不同。根據(jù) 已知的基因組末端區(qū)域的數(shù)據(jù)表明痘病毒的串聯(lián)重復(fù)序列在性質(zhì)和大小上是有差異的。值得注意的是，所有的 株在靠近末端開放閱讀框的串聯(lián)重復(fù)區(qū)里含有 46堿基，而 雖然已經(jīng)將 全測序，但是沒有發(fā)現(xiàn)末端串聯(lián)重復(fù)區(qū) (et 1989)。對比實驗和發(fā)表的限制性片段數(shù)據(jù)分析表明在所有的基因組中都有不少于 200額外末端重復(fù)序列和發(fā)卡環(huán)狀序列。 山羊痘病毒（ 綿羊痘病毒（ 線形、雙股 毒， 二者 同源性非常相近，高達(dá) 96%?；蚪M共有 147 個開放閱讀框（ 編碼密度為 93%，所編碼的蛋白為 3氨中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 6 基酸不等?；蚪M中間的區(qū)域（ 24與其它病毒同源的保守序列，其所編碼的蛋白參與病毒復(fù)制，包括病毒的轉(zhuǎn)錄、 飾、病毒 復(fù)制以及在胞內(nèi)組裝成熟、在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子等過程。與在疙瘩皮膚病上發(fā)現(xiàn)的相似基因一樣，羊痘病毒兩端的基因序列（ 01 是與病毒毒力和宿主范圍相關(guān)的基因。這些基因序列包括一個基因家族（ 5 個與 復(fù)基因和 3 個 復(fù)基因）及其 它與病毒修飾或逃避宿主細(xì)胞 免疫識別和反應(yīng)相關(guān)的基因和 負(fù)責(zé)編碼胞質(zhì)分裂絲蛋白、白細(xì)胞介素 及痘病毒所特有的致病相關(guān)蛋白和宿主范圍相關(guān) 蛋白 基因 等 (et 2002)。 因組比較 基因組水平上高度相近，但是系統(tǒng)發(fā)生樹仍然不同。從一個給定的物種特異的宿主范圍，痘病毒系統(tǒng)分組可以發(fā)現(xiàn)痘病毒物種特異宿主范圍的遺傳背景，山羊痘病毒和綿羊痘病毒的起源可以經(jīng)過染色體限制片段模式分析來區(qū)分 (et 2002)。 外分離株證實平均氨基酸差別為 4%。 26 個 于在 或者在起始密碼子和終止密碼子內(nèi)插入或刪除氨基酸而大小 不同 （ 1氨基酸）。 有一個90 個氨基酸的 它和 羧基末端是同源的。這個 沒有。 7 個相似性少的 有三個和黏液瘤病毒（ 21）、痘苗病毒（ （ 1力因子（ 似，其它 4 個在大小方面有差別（ 4 到 14 個氨基酸），而且包括一個痘病毒特異的 和后轉(zhuǎn)錄因子 4（ 130R（ 一個像免疫球蛋白的 域蛋白（ 源 (et 2002)。 綿羊痘病毒、山羊痘病毒和疙瘩皮膚病病毒（ 較 將 9 個有可能和病毒毒力、宿主范圍功能有關(guān)的基因在 破壞，經(jīng)過插入、 刪除、替代的基因包括一個 異的基因（ 體（ 液瘤病毒）（ 痘病毒） 11L（ 和 7L（ 似的基因 (989)。在因中，這些受到影響的基因高度片段化，相對于 一個 4 到 23 個潛在的移碼核苷酸變化。在 9 個 因組區(qū)域中和 關(guān)的基因組變化的數(shù)目相對于整個基因組剩余部分（每 100 個堿基平均 核苷酸插入 /刪除位點(diǎn)）的變化要相對高（每 100 核苷酸插入 /刪除位點(diǎn)）。雖然 高度片段化，預(yù)測蛋白的三分之二在 對于 據(jù)幾個 因被破壞的始祖性質(zhì)的可能性，利用已有的數(shù)據(jù)表明，在 先適應(yīng)于綿羊和 /或山羊期間，發(fā)生了基因破裂和序列的分歧。 在 發(fā)生廣泛破裂的 9 個 可能導(dǎo)致功能性的失活。 在 9 個破壞的基因中，只有因（ 與已知功能的基因互為直向同源基因，包括 R 同源物，結(jié)合、滅活宿主 l 來影響病毒毒力的分泌蛋白， 有 3 個 域，有個 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 7 結(jié)合蛋白可能相似的功能。在 ， 破壞可能影響病毒調(diào)節(jié)宿主 導(dǎo)的反應(yīng)的能力。 2L 相似，一個 病毒對 以前描述過的痘病毒基因家族有著有限的相似性，包括 53R，一個和宿主細(xì)胞 體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號是敵手的基因家族 (et 2000)。 缺少這些基因，有可能影響 力和宿主范圍并且表明在牛宿主范圍中對毒力和宿主范圍有特異的作用。 構(gòu)蛋白基因 羊痘病毒的 白 由與痘苗病毒 源的基因所編碼 (993)，是羊痘病毒基因組的 ,段的一部分 (999)。 ,段含有 5 個 痘苗病毒的 因同源 (986)。 白是位于羊痘病毒膜表面的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白 (et 1994)，分子量為 32是羊痘病毒特有的蛋白，含有主要的抗原表位，在病毒感染早期產(chǎn)生抗體。針對該蛋白的單一血清可以中和羊痘病毒，這表明 白具有中和表位。它可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫 (et 1993)。 研究發(fā)現(xiàn)，利用 構(gòu)蛋白，可以區(qū)分綿羊痘病毒和山羊痘病毒。 構(gòu)蛋白和痘苗病毒 因編碼的 白是相似的。 白在裝配成熟病毒粒子、病毒毒力、 免疫原性等方面起主要作用 ( 測序表明， 32 的結(jié)構(gòu)基因全長 969碼 322 個氨基酸； 構(gòu)基因全長 972碼 323 個氨基酸。對比推導(dǎo)的氨基酸序列證實， 白具有高度保守性。用 消化 因， 生三個片段（ 300， 327， 400 生兩個片段（ 327， 697這樣 就可以用 鑒定山羊痘與綿羊痘病毒 (et 2004)。 構(gòu)基因序 列比較 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 8 通過對比現(xiàn)有的痘病毒序列資料，在所有的 株中， 163 位有一個特別的天門冬氨酸密碼子，然而其它痘病毒在相同的位置缺少此密碼子。相對于其它痘病毒，所有山羊痘病毒在 77位、 867 位、 964 位出現(xiàn) G 堿基的置換，在 275 位、 403 位、 552 位出現(xiàn) T 堿基的置換，這些特征可以看作是 信號。在 186 位、 654 位、 672 位出現(xiàn) A 堿基的置換，在 395 位、 664 位出現(xiàn) 657 位出現(xiàn) G 堿基的置換，在 401 位出現(xiàn) T 堿基的置換可以看作是 特征 。相似的，在 147 位出現(xiàn) T 堿基的置換，在 910 位 出現(xiàn) G 的置換可以看作是 特征 。這些差別大多數(shù)出現(xiàn)在基因組的 5端。 另外，通過對比推導(dǎo)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)： 獨(dú)特的置換，即： 289I、 其它痘病毒卻沒有出現(xiàn)這種置換。同樣， 現(xiàn)了這種置換。在 也出現(xiàn)了一些獨(dú)特的置換，包括 般來說，這些變化主要出現(xiàn)在 N 末端區(qū)域。因為 C 末端有可能在接近病毒膜表面并有可能暴露 于 宿主免疫細(xì)胞。對比序列發(fā)現(xiàn)， 遺傳性上非常相近，可能和 所有的半胱氨酸胺殘基有關(guān) (et 2004)。 羊痘的發(fā)病機(jī)理和臨床癥狀 病毒對皮膚和黏膜上皮細(xì)胞具有特殊的親和力，無論通過哪種感染途徑侵入機(jī)體的病毒，都經(jīng)過血液到達(dá)皮膚和黏膜，在上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，引起一系列的炎癥過程而發(fā)生特異性的痘疹，即丘疹、水皰膿皰和結(jié)痂等病理過程 (丁打海 ,1997)。羊痘病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖，且大部分以裸露的形式留在細(xì)胞內(nèi)，病毒感染通過被感染的巨噬細(xì)胞和血液中的胞外衣殼病毒隨血液到達(dá)皮膚和黏膜。在此過程中，病毒可有效避免接種疫苗所 產(chǎn)生抗體的中和，抗體并不能阻止病毒在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。自然感染潛伏期一般為 6，長的達(dá) 16 天。病羊以體溫升高為特征（可達(dá) 41，精神不振，食欲廢絕，鼻黏膜和眼結(jié)膜潮紅，有漿液性 分泌物 ，后轉(zhuǎn)為黏液膿性鼻涕從鼻孔流出，呼吸、脈搏增速，寒顫。約 1開始發(fā)生痘疹，開始為紅斑， 1后形成丘疹，突出于皮膚表面，堅實而蒼白，隨后丘 疹逐漸擴(kuò)大， 變成灰白色或淡紅色、半球狀的隆起結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)在 2皰內(nèi)容物逐漸增多，中央凹陷，呈臍狀。 在此期間，羊體溫稍下降。不久水泡變?yōu)槟撔?，不透明，形成膿皰、?膿。如無繼 續(xù)感染，幾日內(nèi)膿皰干癟為褐色痂塊，脫落后遺留下灰褐色瘢痕而痊愈。 整個病程 14。該病會混合感染傳染性胸膜肺炎或化膿性乳房炎，使懷孕后期的母羊流產(chǎn) (俞乃勝 ,2000)。本病也有非典型經(jīng)過，良性經(jīng)過的稱頓挫型，有的形成“石痘”，有的形成所謂的“臭痘”和“壞疽痘”，又有的形成“出血痘或黑痘” (孫悅 ,2003)。 病理變化 體表病變 體表呈現(xiàn)典型的痘斑病變，口唇、舌面、鼻鏡、乳房、會陰及尾根無毛處可見大小不等的痘疹，較為嚴(yán)重的有潰瘍灶 (王開功 ,2003)。 檢變化 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 9 在前胃或皺胃的 黏膜 上往往有大小不等的圓形或半圓形堅實的結(jié)節(jié)，單個或融合存在，嚴(yán)重的引起前胃 黏膜 糜爛或潰瘍，咽和支氣管 黏膜 也常有痘疹，呼吸道黏膜有出血性炎癥，有時增生性病灶呈灰白色，圓形或橢圓形，直徑約 1氣管及支氣管內(nèi)充滿混有血液的濃稠黏液。肺部干酪樣結(jié)節(jié)和卡他性 炎區(qū)，淋巴結(jié)腫大，與腺瘤很相似，多發(fā)生在肺的表面，切面質(zhì)地均勻，但很堅硬，數(shù)量不定，性狀一致，特別是肺膈葉，有許多直徑長達(dá) 5硬塊，在這種病灶的周圍有時可見充血和水腫等。有繼發(fā)病癥時，肺有肝變區(qū)。腸道黏膜少有痘疹變化。此外常見細(xì)菌性敗血癥 變化，如肝脂肪變性、心肌變性、淋巴結(jié)急劇腫脹等。 顯微病理變化 皮膚、瘤胃的鱗狀上皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞明顯水腫，胞漿稀疏。線粒體腫脹變圓，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，可見小泡狀增生。高爾基復(fù)合體擴(kuò)張，甚至破裂解體。胞漿內(nèi)有大量散在的多為卵圓形的成熟病毒顆粒，有的細(xì)胞中可見到病毒包涵體形成；個別細(xì)胞胞漿內(nèi)可見角質(zhì)絲。皮下組織可見巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞浸潤。巨噬細(xì)胞的線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞漿內(nèi)可見數(shù)量不等的病毒顆粒。有時可見細(xì)胞的裂解和細(xì)菌的并發(fā)感染。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，亦有線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的現(xiàn)象，胞漿內(nèi)也可見 少量的病毒顆粒。有髓神經(jīng)纖維可見軸索變性呈空泡狀，神經(jīng)膜細(xì)胞腫脹，胞漿稀疏，線粒體腫脹，溶酶體增多，胞漿內(nèi)有少量病毒顆粒，也有一些成熟的病毒顆粒游離于神經(jīng)膜細(xì)胞外。神經(jīng)外膜和神經(jīng)內(nèi)膜之間有巨噬細(xì)胞浸潤，其內(nèi)有大量病毒顆粒散在 (許樂仁 ,2003)。 診斷方法 本病僅羊感染發(fā)病，故根據(jù)臨床癥狀、病理變化，并結(jié)合其流行情況，可做出初步的診斷。但對于隱性感染或是非典型病例不能確診，還需進(jìn)行相應(yīng)的實驗室診斷。 血清學(xué)診斷 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗（ 早在 1963年 et 1963)。 1997 年 用綿羊痘病毒的可沉淀抗原進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗提高了該試驗的有效性。另外， 1986 年 用 35 s 甲硫氨酸標(biāo)記沉淀抗原極大地提高了瓊擴(kuò)試驗在綿羊痘抗體檢測 中 的敏感性 (et 1986)。 對流免疫電泳（ 被用于各種病毒抗原和抗體的檢測，它比 快速、敏感。 1985 年 立了對流免疫電泳快速診斷綿羊痘的方法，該法不僅可檢測出感染后 45 d 的患畜血清中的抗體，而且還能檢測出患病綿羊的皮膚癡皮、肺臟病灶、肝臟病灶中的抗原 (et 1985)。 1999年 設(shè)計電泳時用巴比妥緩沖液代替普通的鹽溶液極大地提高了 敏感性 (et 1999)。由于 夠檢測出感染綿羊痘病毒的綿羊臟器中的病毒，因此也常被實驗室人員們中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 10 用做一種快速檢測綿羊痘的方法。 乳膠凝集試驗（ 在 ，乳膠顆粒作為抗原的載 體，抗原很容易吸附在乳膠顆粒上，且 有快速、簡便和不需要昂貴的設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。 因此， 在被廣泛的應(yīng)用于抗原一抗體的檢測試驗中。 1996年 應(yīng)用該方法對田間收集的山羊痘血清樣本進(jìn)行檢測，證明該方法比 感 (et 1996)、方便。 1997 年 人經(jīng)實驗證明該方法也可用于綿羊痘的檢測。 反向間接血凝試驗 ( 反向間接血凝試驗應(yīng)用致敏的綿羊紅細(xì)胞在實驗室診斷綿羊痘病很有效 。 1997 年 可 在綿羊痘的診斷中取得較好的效果(997)。 2005 年，貴州大學(xué)的王開功等人以兔抗山羊痘病毒 敏綿羊紅細(xì)胞，采用反向間接血凝試驗檢測山羊痘病毒抗原，并通過對貴州省 8 個疫區(qū)現(xiàn)場采集山羊痘待檢抗原的檢測結(jié)果表明，該方法陽性檢出率達(dá) 7/8），與瓊脂擴(kuò)散試驗（ 性檢出率為 50%（ 4/8）相比較 感性比 ；同時通過對山羊痘野生強(qiáng)毒 H 細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，就可檢出 價，而 不能檢測 (王開功 ,2003)。一些凝集試驗如協(xié)同凝集試驗、 被動 血凝試驗和點(diǎn)凝集試驗也常有助于綿羊痘的快速診斷，協(xié)同凝集試驗以蛋白質(zhì) A 的一球蛋白的粘附力為基礎(chǔ)，蛋白質(zhì) A 是存在于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁上的一種不含糖的蛋白質(zhì)。 跡試驗 跡是以羊痘病毒感染的細(xì)胞溶解物檢查血清樣品中病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體 ,將細(xì)胞溶解物離心后，與蛋白樣品及標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白 時進(jìn)行 泳。再將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后染色觀察。該法具有較高的靈敏性和特異性，但該試驗價格昂貴、操作難度大 (et 1994)。 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ( 已被廣泛的應(yīng)用于各種抗原抗體的檢測試驗中，各種類型的 有助于綿羊痘的診斷。 1988 年 用綿羊痘痂皮制成粗制抗原利用間接 法進(jìn)行綿羊痘抗體的檢測獲得成功，但該試驗本底高易出現(xiàn)假陽性結(jié)果 1。 應(yīng)用純化的 具有較強(qiáng)抗原性 的 重組蛋白做抗原進(jìn)行 可提高其敏感性。 1999 年 羊痘病毒 抗原進(jìn)行 得成功。但是 ， 由于該方法抗原制備難度大，常常限制了 綿 羊痘診斷中的廣泛應(yīng)用 (et 1999)。 1997 年 人建立了免疫捕獲該方法以兔抗綿羊痘病毒的高 免血清為捕獲抗體，同時檢測到了綿羊痘和山羊痘痂皮中的痘病毒抗原。 人認(rèn)為免疫捕獲 以作為綿羊痘和山羊痘的共同的檢測方法，但該方法單獨(dú)使用時存在一定的限制，需要與 驗共同應(yīng)用才能確診 (許樂仁 ,2003)。近年來，方 法成為綿羊痘診斷的有益補(bǔ)充，而且該方法更簡便，眼觀即可判定結(jié)果。 1998 年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 11 經(jīng)成功的應(yīng)用 行山羊痘抗體的檢測并取得了滿意的結(jié)果， et 1998)。最近， 被用于綿羊痘抗體的檢測中，該方法運(yùn)用綿羊痘的可溶性抗原片斷，極大地減小了 本底反應(yīng)，并且可有效地應(yīng)用于綿羊痘免疫效果的評價和流行病學(xué)調(diào)查中。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 術(shù)是以特異性引物擴(kuò)增特定的 段。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。 特異性好，靈敏度高，簡便快速，對檢測樣品要求低。該技術(shù) 既可用于序列測定鑒定特異病毒，又可用于血清型鑒定和分子流行病學(xué)研究。 此外，它還可以檢測滅活的核酸片段， 2時內(nèi)便可得到檢測結(jié)果。 1999 年 O. 基于山羊痘病毒的基因組中末端反向重復(fù)序列設(shè)計引物鑒定 了 在細(xì)胞培養(yǎng)的 綿羊痘病毒 (999)。 定皮膚懸浮物中的病毒非常敏感，但與綿羊痘同屬的各病毒的鑒別診斷還不十分容易，各國學(xué)者們正嘗試著通過對 增產(chǎn)物進(jìn)行限制性分析，可能有助于山羊痘病毒屬的各病毒的鑒別診斷。 近