分類號 密級 U D C 編號 中 南 大 學(xué) 士 學(xué) 位 論 文 論文題目 1、 肝癌相關(guān)性的體外研究 學(xué)科專業(yè) 藥 理 學(xué)（臨床藥理學(xué)） 研究生姓 王亦男 指導(dǎo)教師 周宏灝 教授 分類號 密級 碩士學(xué)位論文 1、 肝癌相關(guān)性的體外研究 1, in 者姓名： 王亦男 學(xué)科專業(yè)： 臨床藥理學(xué) 學(xué)院 （系、 所） ： 臨床藥理研究所 指導(dǎo)教師： 周宏灝 教授 論文答辯日期 答辯委員會主席 中 南 大 學(xué) 2008 年 5月 摘 要 背景： 450家族中的重要成員，約有 3%的藥物以及外源性物質(zhì)經(jīng)過其代謝，同時它的活性能 夠被許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)誘導(dǎo)。 1作為核不均一核糖核蛋白家族的重要成員之一，對于部分 。目前有研究報道 1蛋白能夠與 而影響 一步的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中， 1以及 目的 : 本研究的目的在于探尋 1, 且比較 在肝癌組織與正常肝臟組織中1和 后驗證 1蛋白對 方法： 在本研究中，我們收集了 22例肝臟組織，其中包括 11例肝癌組織和 11例正常對照組織標(biāo)本。采用 過 1基因， 再分別測定 1及 結(jié)果 : 通過比較癌癥組與對照組之間 1以及 現(xiàn)在癌癥組中兩者的表達都明顯增高，其中 1的表達P=蛋白表達水平上也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象， 兩種蛋白的表達在癌癥組織中也同樣增高 （ 1的表達 P=。 相關(guān)性分析顯示， 在肝癌組中， 1與 P=及蛋白水平（ P=存在顯著的潛在相關(guān)性，并且 1蛋白的表達以及 1基因被沉默后， 結(jié)論： 與對照組相比， 1與 且在肝癌組 中，兩者之間存在顯著的潛在相關(guān)性，而在正常對照組中這種相關(guān)性并 不明顯。進一步的實驗證實在 1蛋白對于 關(guān)鍵詞： 1； 癌； 外 is an be by 1 an in of 1 of In of 1 of to 1 be in In of 1 in be we if of to 1 to of 1 in to if 1 be a to 22 11 1 by by We to 1 of 1 p= in p= We 1 no in in in p=in p=in 1 in p=in p=in of 1 p= in no of 1 in in in no 1 in in 1 A6 1 a to in 1; in 符號說明 50 : 540 目 錄 第一章 前 言 .二章 實驗材料、方法與步驟 .標(biāo)本和肝臟標(biāo)本來源： .材料和儀器： .臟組織總 提取、逆轉(zhuǎn)錄： . 相關(guān)試劑的配制： . 肝臟組織總 提取： . 逆轉(zhuǎn)錄： . 凝膠純化： .操作和數(shù)據(jù)提?。?.組織總蛋白的提?。?. 相關(guān)試劑的配制： . 蛋白提取： . 蛋白濃度測定： . 驟： .2瓊脂糖凝膠的制備： .胞培養(yǎng)： .瞬時 擾： .數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析： .三章 實驗結(jié)果 .類肝臟組織中 1 及 達量存在差異 .類肝臟組織中 1 以及 白表達量存在差異 .類肝癌標(biāo)本中 1 與 表達的相關(guān)性 .擾對 1 及 白表達水平的影響 .四章 討 論 .五章 結(jié) 論 .考文獻 . 述 . 謝 .讀學(xué)位期間主要的研究成果 .碩士學(xué)位論文 前言 1第一章 前 言 9號染色體長臂 1區(qū) 2亞帶， 包含有 9個外顯子， 是細胞色素酶 成整個 %。許多外源性物質(zhì)包括藥物（例如香豆素、丙戊烷、氟烷等）、前致癌原（如亞硝胺、尼古丁、黃曲霉素及其他一些化學(xué)物質(zhì)都通過 時， 。眾所周知，尼古丁是一類嚴重危害人類健康的化學(xué)物質(zhì)，它能夠誘發(fā)心血管系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)疾病以及腫瘤疾病2， 3。此外，在體內(nèi)， 7080%的香豆素都是通過 羥香豆素，因此，香豆素也被作為時 。 由于 起了較為廣泛的關(guān)注。最初的研究著手于 如肺癌5， 6、結(jié)腸癌7、胰腺癌8、鼻咽癌9等等。而影響 齡、性別25、遺傳因素10, 藥物誘導(dǎo)作用11,12, 環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)13,14等等都能對 近的研究發(fā)現(xiàn)核不均一核糖核蛋白 1）在轉(zhuǎn)錄后水平對 核不均一核糖核蛋白（ 一個蛋白超家族，包含有 20多種蛋白，分別從 。 僅在脊髓動物各組織器官中表達豐富， 在其他的物種中例如植物、 酵母中也存在26。此外， 謝 旺盛的組織中表達相對較高，例如肺、腦等；即使同一組織器官，在不同的生命周期中 7。 核不均一核糖核蛋白 1，1）是核不均一核糖核蛋白家族的重要成員之一， 1基因位于第 12號染色體長臂 1區(qū) 3帶 1亞帶，編碼 371個氨基酸， 1蛋白分布極為廣泛，人體肺、腦、肝、腎等組織器官中均有分布。 1主要分布在細胞核區(qū)， 其結(jié)構(gòu)主要包含了 2個位于氨基端的 和 I）以及位于羧基端的一個富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)區(qū)域（見圖 。兩個與前體 非編碼區(qū)結(jié)合的重要部位；而富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)區(qū)域在功能上類似于核定位系統(tǒng)。 1能夠自由穿梭與細胞質(zhì)與細胞核之間，它能夠與多種基因的前體 助前體 且屏蔽細胞內(nèi) 細胞質(zhì)中， 1還能與其他蛋白如 剪切加工以及修飾，然后與之解理再返回到細胞核中準(zhǔn)備參與下一輪的轉(zhuǎn)運15。 目前多個研究表明 1蛋白與多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 前言 2研究發(fā)現(xiàn) 1在少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、 慢性髓細胞性白血病的表達是增高的17。1蛋白正常功能的改變導(dǎo)致了變異細胞集落的形成以及腫瘤的發(fā)生，另外一部分原因是 1蛋白促使了抗細胞凋亡因子 5。 2個肺癌患者活檢得到的 16種細胞株進行比較，發(fā)現(xiàn)在所有的細胞株中，包括小細胞癌和非小細胞癌， 1蛋白的表達均存在差異，小細胞癌株中1平均 中以 510細胞表達量最高。此外，一項對 30個結(jié)腸癌癌組織的研究發(fā)現(xiàn)， 1表達量比其自身正常結(jié)腸組織高 2倍以上的占 60%左右，同時其表達量也 與結(jié)腸癌的臨床病理分期密切相關(guān)， 1表達量增加的百分比分別為 78%、64%和 40%16。 1蛋白也是與伯基特淋巴瘤脫噬作用密切相關(guān)的 12種蛋白之一，所謂脫噬作用即細胞調(diào)亡，是控制淋巴細胞生長與分化的必要過程18。此外 1蛋白與慢性粒細胞白血病之間的相關(guān)性得倒了比較系統(tǒng)的研究。 1蛋白的穩(wěn)定性能夠被 且 1蛋白在慢性粒細胞白血病急性發(fā)作期的粒細胞中的表達水平比慢性期明顯增高15， 19。慢性粒細胞白血病急性發(fā)作時，其粒細胞中的而誘導(dǎo) 1蛋白的表達增高， 1蛋白通過與抗細胞凋亡因子 穩(wěn)定 而使從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中的 一步使 其中 活性，最終誘導(dǎo)細胞增殖，并抑制凋亡15， 19。這些研究都證實 1蛋白在多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用。 既然 1在多種相同的腫瘤疾病中都發(fā)揮了各自的作用， 那么這兩者之間是否存在某種關(guān)聯(lián)呢？首先 1蛋白的小鼠 后 果發(fā)現(xiàn)兩者的 31%，其中也存在 和 I（見圖 ，隨后通過紫外交聯(lián)等一系列實驗證實 4 1蛋白8。 1蛋白相結(jié)合的人類藥物代謝酶，然而 1蛋白作用于 前仍沒有確切的證據(jù)。 本試驗的目的在于研究 1以及 進一步尋求兩者之間的作用關(guān)系。 碩士學(xué)位論文 前言 3圖 1蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖 圖 人類 大鼠 因 3序列比對圖 (n NA C 碩士學(xué)位論文 材料和方法 4第二章 實驗材料、方法與步驟 標(biāo)本和肝臟標(biāo)本來源： 收集了 22 個肝臟組織標(biāo)本，分別來自肝癌切除的癌組織，癌旁正常組織，肝內(nèi)結(jié)石、膽管結(jié)石、肝血管瘤等手術(shù)中的正常組織。其中男性 15 名，女性 7 名，平均年齡 （均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差） ，肝癌組織標(biāo)本 11 個，肝內(nèi)結(jié)石、膽管結(jié)石、肝血管瘤標(biāo)本 24 個。 本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院倫理委 員會通過，所有受試者均簽署知情同意書。 材料和儀器： 試劑 養(yǎng)基及胎牛血清 美國 司 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 合酶及 生物工程（大連）有限公司 物 寶生物工程（大連）有限公司 1 一抗 美國 司 抗 英國 司 抗 博士德生物工程有限公司 抗及二抗 博士德生物工程有限公司 學(xué)發(fā)光底物 美國 司 白濃度測定試劑盒及細胞裂解液 碧云天生物工程有限公司 試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司 劑盒 美國 司 凝膠回收試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司 海吉凱基因公司 國 司 國 司 氯仿， 溴乙啶， ， 異丙醇，無水乙醇， 75乙醇， 檸檬酸鈉， 0過氧化氫等 上海生工分析純試劑 儀器設(shè)備 美國 司 倒置顯微鏡 日本尼康公司 碩士學(xué)位論文 材料和方法 5 美國 司 電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀 北京六一儀器廠 紫外光分析儀 日本島津公司 酶標(biāo)儀 上海天能公司 低溫冷凍離心機 美國 司 美國 司 臟組織總 提取、逆轉(zhuǎn)錄： 關(guān)試劑的配制： 1） ： 取 1入雙蒸水，終體積至 1000拌過夜。室溫密封保存。 2） 檬酸鈉 10乙醇液： 稱取 檬酸鈉溶解在 180蒸水中，再加入 20水乙醇，充分混勻。 3） 8液： 稱取 解于 1蒸水中，取 液，并加入雙蒸水，終體積至 504） 液： 稱取 入雙蒸水溶解，定容在 505） 液： 稱取 入 雙蒸水 20解后用濃鹽酸調(diào)節(jié) 后定容至 25總 取所用的乳缽， 鑷子等均在 190烤箱干燒 5 小時以上。 等都用 浸泡過夜， 然后高壓滅菌 30 分鐘，52烤箱中烘烤干備用。 臟組織總 提?。?1） 取約 10080保存的肝臟組織迅速放入液氮預(yù)冷并加入 乳缽中，研磨磨碎，加入 續(xù)研磨成粉紅色勻漿，轉(zhuǎn)移至新的 中。 2） 在每管中加入 氯仿，充分混勻，來回用手振搖 15 秒， 15 30放置 23 分鐘后， 12000g， 4離心 10 分鐘。 3） 粉紅色勻漿分成上層無色含 水相和下層含 粉紅色苯酚 上層含 水相至新的 ，剩下的苯酚 碩士學(xué)位論文 材料和方法 64） 在每管中加入同體積的異丙醇，用手有力來回振蕩 30 秒， 15 30放置23 分鐘后， 12000g， 4離心 10 分鐘。 5） 可見管底有白色膠狀 淀，去上清，在每管中加入用 理水配制的 75乙醇，用以洗滌 淀，重懸沉淀。 15 30放置 1015 分鐘后， 7500g， 4離心 5 分鐘。 6） 可見管底有白色膠狀 淀，去上清，在每管中加入用 理水配制的 75乙醇，第二次洗滌 淀， 15 30放置 1015 分鐘后，7500g， 4離心 5 分鐘。 7） 去上清，室溫風(fēng)干 淀 5鐘，不可以用真空抽干，也不宜過度干燥。 在每管中加入 理水以溶解 淀， 約 30 分鐘。 溶解的 及逆轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄： 1） 10g； 8: 1L；加 入 理水使總體積至 12L，混合均勻，快速離心 3 5 秒， 70孵育 5 分鐘。 2）迅速放置在冰上約 30 秒，在冰浴過程中按順序加入以下試劑： 5 4L 1L 10mM 2L 混合均勻，快速離心 3 5 秒， 37孵育 5 分鐘。 3）冰浴，加入 轉(zhuǎn)錄酶： 1L，終體積達 20L?；旌暇鶆颍焖匐x心 3 5 秒， 42孵育 60 分鐘， 70孵育 10 分鐘以終止反應(yīng)。 膠純化： 1）選取任意 本進行 增，制備瓊脂糖凝膠。 2）紫外燈照射下選取熒光條帶切膠。 3）稱重，置于干凈的 1.5 心管中，每 加入 6水浴孵育 7 分鐘直至完全溶解，每 2 3 分鐘顛倒混勻數(shù)次， 10000g，離心 5 分鐘收集上清。 4）加入 700 L 上清液于純化柱中， 10000g，離心 1 分鐘，棄去液體。 5）加入 300 L 脫純化柱， 10000g，離心 1 分鐘，棄去液體。 6）加入 700 L 置 3 分鐘，離心 1 分鐘，棄去液體。該操作重復(fù)一遍。 7）空純化柱 10000g，離心 1 分鐘至干燥。 8） 將純化柱置于干凈 1.5 P 管中， 加入 50 L 無菌水靜置 5 分鐘， 10000g，離心 1 分鐘，收集液體。 碩士學(xué)位論文 材料和方法 操作和數(shù)據(jù)提取： 本研究定量檢測了肝臟標(biāo)本 1 表達水平。采用方法， 選用 為內(nèi)參照。 各對應(yīng)引物的序列、 退火溫度及 表 各對應(yīng)引物的序列及擴增片斷長度 1 0 940 950 186 1. 溶解試劑，上下顛倒混勻，確認溶液完全溶解。避免用振蕩器混勻，劇烈振蕩會降低制品性能。 （所有操作在冰上進行，長時間室溫放置會降低制品性能） 。按照說明書同時配制目的基因和內(nèi)參 應(yīng)用混合液， 分裝至 應(yīng)管中，添加 增用模板。 按照 司的 使用說明書要求進行實驗操作。 試劑 使用量（ l） 10m） 10m） 0.4 滅菌雙蒸水 5 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系的配置， 取凝膠回收后的 本用雙蒸水按照 10 的梯度，各取 2l 進行 應(yīng)。 碩士學(xué)位論文 材料和方法 83. 設(shè)置程序如下圖： 4. 放入標(biāo)本， 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測標(biāo)本。 A C E 排分別為 1 及 準(zhǔn)曲線， B D F 排均為樣品 1 碩士學(xué)位論文 材料和方法 95. 分析 增曲線和融解曲線 擴增曲線： 溶解曲線： 碩士學(xué)位論文 材料和方法 106. 制作標(biāo)準(zhǔn)定量曲線。反應(yīng)結(jié)束后，由各擴增曲線得到的 ，制作標(biāo)準(zhǔn)定量曲 線。 7. 實驗結(jié)果分析 從融解曲線分析中可知， 擴增產(chǎn)物非常單一，從標(biāo)準(zhǔn)定量曲線上可以看出，線性關(guān)系良好。因此我們可以得出結(jié)論，在實驗濃度范圍內(nèi)，可以得到非常正確的 量結(jié)果。 實驗對象表達量目的基因拷貝數(shù) /管家基因拷貝數(shù) 組織總蛋白的提?。?關(guān)試劑的配制： 1） 10%分離膠溶液： 30%丙烯酰胺（含 2%甲叉） ： 5.0 H= 3.8 0%150L 5.9 6 L 碩士學(xué)位論文 材料和方法 1110%過硫酸銨： 150 L 2）濃縮膠： 30%丙烯酰胺（含 2%甲叉） ： 1.3 H= 1.0 0%80L 5.5 8 L 10%過硫酸銨： 80 L 3）電泳液配方： g， 100% 。 4） 20， ） ， 。 5）封閉液： 4脫脂奶粉和 1%。 6）抗體稀釋液： ） ， 20） ， ， 。 白提?。?1）取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 最終濃度為1 2）取約 10080保存的肝臟組織迅速放入液氮預(yù)冷并加入 1解液的乳缽中，研磨磨碎，成粉紅色勻漿，轉(zhuǎn)移至新的 中。 3）冰浴超聲 15 分鐘，充分裂解后， 10000g 離心 3 5 分鐘，取上清至干凈 中， 保存。 白濃度測定： 1）根據(jù)樣品數(shù)量，按 50 體積 劑 A 加 1 體積 劑 B（ 50:1）配制適量 作液，充分混勻。 2）完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取 10 微升稀釋至 100 微升 ，使終濃度為 標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 微升加到 96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補足到 20 微升。加適當(dāng)體積樣品到 96 孔板的樣品空中，加標(biāo)準(zhǔn)碩士學(xué)位論文 材料和方法 12品稀釋液到 20 微升。各孔加入 200 微升 作液， 37放置 30 分鐘。 3）測定 595長的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。 驟： 1）洗板：用洗潔精將油脂洗凈，分別用自來水和雙蒸水清洗，無水酒精搽洗，再用雙蒸水清洗，晾干備用。 2）配膠： (1) 按照配方把分離膠及濃縮膠配好 (2) 封膠：灌入 2/3 的分離膠后應(yīng)立即用水封膠，封膠后平放勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，用 洗干凈，用濾紙把水吸干。 灌入濃縮膠，插入梳子。待濃縮膠干后拔除梳子。預(yù)電泳 15即可上樣。 3）上樣，電泳： (1) 上樣前將膠板下的氣泡趕走。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加 98加熱 3上樣。 (2) 以 100V 的電壓電泳，當(dāng)條帶跑至分離膠和濃縮膠分界面時改為 150目的蛋白泳動至距膠下緣 1上結(jié)束。 4）轉(zhuǎn)膜： (1) 按目的蛋白大小，根據(jù) 指示的位置（ 56 kD，1 在 34 42 置）切膠，用轉(zhuǎn)膜緩沖液清洗。 (2) 剪六張與凝膠大小一致的 紙和一張硝酸纖維素膜（膜在使用之前用甲醇浸泡 15s） ，把膜以及濾紙泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用。 (3) 按順序把膜，凝膠，濾紙疊放在半干電轉(zhuǎn)儀中，以 時。 5）封閉及雜交： (1) 將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，用 加漂洗，浸沒于封閉液中， 4封閉過夜。 (2) 封閉后用 洗 5 10 分鐘，濾紙稍吸干。放入配好的一抗中，室溫下輕搖孵育一小時。 (3) 一抗孵育結(jié)束后，用 洗膜后再浸洗三次，每次 5 10 分鐘。 (4) 放入已配好的二抗溶液中，室溫輕搖一小時。 (5) 二抗孵育結(jié)束后，用 洗膜后再浸洗三次，每次 5 10分鐘。 6）發(fā)光鑒定：使用辣根過氧化物酶 光法顯色。 碩士學(xué)位論文 材料