第一章 前言 究背景 口腔是一個濕度和溫度以及營養(yǎng)狀況非常適宜微生物群落生長的環(huán)境，健康人的口腔可包含有超過 700種不同的細菌、病毒和真菌等微生物種群 1, 各種微生物群落間通過復雜的相互作用達到一種動態(tài)平衡。近年來隨著臨床廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等的廣泛使用，假絲酵母菌感染在局部及全身的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢。 有報道稱健康人口腔中假絲酵母菌的檢出率為 35等。 從口腔中分離出的主要真菌屬假絲酵母菌屬，有超過 350種假絲酵母菌，其中有 10余種與人類疾病相關，并可定植于人口腔當中 2。各種形式的口腔疾病中均可分離出假絲酵母菌，但其與疾病的關系尚無定論。從口腔中分離出的可致病的假絲酵母菌中，白假絲酵母菌最常見。 A 等的假絲酵母菌學研究表明，從各種形式的人類假絲酵母菌病中 80%可分離出白假絲酵母菌 3。白假絲酵母菌感染機體后可侵犯全身多個組織器官，引起全身系統(tǒng)性假絲酵母菌病。如能做到早診斷早治療即可降低其發(fā)病率和死亡率。 口腔假絲酵母菌病一般可分為：偽膜型假絲酵母菌病、急性紅斑型假絲酵母菌病、慢性紅斑型假絲酵母菌病、慢性增殖型假絲酵母菌病?？谇粌燃俳z酵母菌感染一般不出現 明顯臨床癥狀，僅表現為口腔局部疼痛，口干或燒灼感。多累及年齡較大的老年人，嬰幼兒及免疫功能較低及佩戴義齒者。白假絲酵母菌是主要致病菌，具有臨床分離率高，致病性強的特點。因此，尋找一種臨床可行的，簡便快捷的假絲酵母菌鑒定方法，對于假絲酵母菌病的診斷治療及流行病學分析都十分重要。目前，對于自然人群口腔假絲酵母菌的攜帶特征、種群分布及其耐藥情況等，相關研究資料匱乏?？谇患俳z酵母菌感染的診斷必須依靠形態(tài)學鑒定方法來證實。但這些方法耗時長、敏感度低、陰性結果不能完全排除、可能有創(chuàng)傷性、對實驗操作人員要求較高等，使得當 前實驗室檢測技術不能滿足目前的臨床診斷需要 4。而且口腔假絲酵母菌感染目前沒有一個準確的檢測和診斷標準。傳統(tǒng)的 易出現假陽性，實驗可復性低，過程易污染。實時熒光定量 感、快速、污染率低等特點。目前廣泛應用于農業(yè)科研、醫(yī)學病理、食品檢測和病原微生物檢測領域。利用實時熒光定量 內外文獻鮮見報道。 究目的與內容 究目的 本研究擬通過對蘭州市自然人群口腔濃縮漱口液樣本的檢測，了解蘭州市城鄉(xiāng)居民口腔假絲酵 母菌的分布， 攜帶特征 及其藥物敏感性，同時探討口腔假絲酵母菌的分布與性別、年齡、義齒、口腔衛(wèi)生狀況之間的關系，為臨床口腔假絲酵母菌病的預防以及早期診斷和治療提供一定的理論依據。 本研究將還將利用實時熒光定量 立有針對性的口腔白假絲酵母菌實時熒光定量 口腔白假絲酵母菌病的早期診斷提供依據。并為下一步研發(fā)口腔非白假絲酵母菌及其他口腔微生物實時熒光定量 究內容 本研究第一部分對蘭州市城鄉(xiāng)居民采用含漱法取唾液樣本，利用培養(yǎng)法和科瑪嘉顯色法分離 、鑒定口腔假絲酵母菌。按不同年齡、性別、口腔衛(wèi)生狀況、戴用義齒等分組，分析各組口腔假絲酵母菌的檢出及分布情況 , 并采用藥敏紙片法進行氟康唑、兩性霉素 B、制霉菌素、 5 本研究第二部分建立實時熒光定量 將其應用于 臨床檢測口腔白假絲酵母菌，為口腔假絲酵母菌早期感染的臨床診斷及合理使用抗真菌感染的藥物打下一定的基礎。 并為下一步研發(fā)口腔非白假絲酵母菌及其他口腔微生物實時熒光定量 第二章 蘭州市城鄉(xiāng)居民口腔假絲酵母菌分布 及 其耐藥性 料與方法 究對象 從 2009年 7月 0月 ,在蘭州大學口腔醫(yī)院、蘭州市中醫(yī)院、蘭州市榆中五中、蘭州市定遠鎮(zhèn)衛(wèi)生院隨機選取研究對象 942例，其中男 516例，女 426例。平均年齡 11。城鎮(zhèn)、農村分別為 456、 486例。按照不同年齡、性別、牙結石程度、是否戴義齒、城鄉(xiāng)等情況分組。 實驗對象納入標準：無全身系統(tǒng)性疾??；無口腔粘膜病；近 3個月無抗生素服用史；在蘭州市有一年以上居住史。所有取樣對象均做到知情同意。 驗用品 色鑒定培養(yǎng)基鑒定培養(yǎng)基 (法國科瑪嘉公司 ) 凈工作臺 (杭州匯爾儀器設備有限公司 ) 量移液槍 上海方瑞儀器廠專業(yè)生產 ) 氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 (上海立德泰勀科學儀器有限公司 ) 速冷凍離心機 (凱特試驗儀器公司 ) 動雙重純水蒸餾器 (江蘇省金壇市友聯儀器研究所 ) 力加熱攪拌器 (鄭州英峪領科儀器設備有限公司 ) 低溫冰箱 (日本三洋公司 ) 熱恒溫水浴鍋（ 上海比朗儀器有限公司 ） 床檢查 由兩名經過微生物培養(yǎng)系統(tǒng)性培訓的口腔臨床專業(yè)醫(yī)師詢問并記錄所有受檢者年齡、性別、職業(yè)，有無系統(tǒng)性疾病，檢查并記錄口腔是否有 粘膜病、戴義齒及牙結石情況，采集并處理口腔濃縮漱口液樣本。 腔濃縮含漱液樣本的采集與處理 采用口腔濃縮含漱液法采集樣本，受檢者空腹，采集時間為上午9:000，無菌 10 吐于無菌試管內 ,并于 2h 內將樣本送往實驗室處理。將樣本離心53000r/稀釋，振蕩，混勻。棄上清液 ,加入甘油進行封裝， 存，備用。 腔假絲酵母菌的培養(yǎng)、鑒定 將樣本接種于 定培養(yǎng)基，根據鑒定培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)和菌落顏色鑒定假絲酵母菌。根據白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌所含的物質與培養(yǎng)基底物發(fā)生作用后分別呈現綠色、紫色、深藍色和粉紅色的特性，達到鑒定假絲酵母菌的目的 6。 37孵育 48h，生長 1個或 1個以上假絲酵母菌菌落的樣本為假絲酵母菌檢出陽性。 物敏感性實驗 真菌紙片擴散法藥敏實驗的 抑菌圈直徑 判定對藥物的敏感性 7 (表 1) 表 1 真菌紙片擴散法判定標準表 （ 藥物 敏感 抑菌圈直徑 耐藥 抑菌圈直徑 氟康唑 19 14 兩性霉素 B 制霉菌素 15 15 10 10 5 19 14 準菌株 白假絲酵母菌 (0028)、熱帶假絲酵母菌（ 50 )、克柔假絲酵母菌 (258)、光滑假絲酵母菌 (2725)由赫爾辛基大學口腔醫(yī)學研究院惠贈。 計學分析 采用 計軟件進行單因素方差分析， P 80 19。口腔假絲酵母菌病一般為淺部黏膜 假絲酵母菌 感染， (1,3) 體液中的量不高 20，因此一般不用做口腔假絲 酵母菌感染的檢測和鑒定。 子生物學方法 目前應用廣泛，可用于培養(yǎng)后 假絲酵母菌 菌種的鑒定和標本快速診斷。應用分子生物學方法檢測臨床標本中假絲酵母菌的 者 提高診斷靈敏度。自 1985年 技術已成為分子生物學研究中使用最多、應用最廣泛的手段之一。 板、酶、 子等。引物選擇必須滿足特異性和敏感性，和臨床應用的簡便性。假絲酵母菌 常用通用引物包括 18轉錄間隔區(qū) ( 28有檢測時間短、靈敏度高的特點，還可用于檢測檢測一些依靠培養(yǎng)法不能檢測的微生物種類 21。 等在 通過對 54項研究中的 4694名患者中使用 22。 近年來 ,以 但其針對臨床標本敏感 性卻不高 ,且不同實驗室的數據之間缺乏可比性 ,限制了其在臨床 假絲酵母菌 感染檢驗中的推廣應用 6。同時 已知 假絲酵母菌 菌的孢子可呈氣溶膠方式存在于自然環(huán)境中 ,他們對試劑和標本的污染會導致其檢測結果產生假陽性 23。 制性片段長度多態(tài)性串聯式 )法 用來鑒定血培養(yǎng)陽性的假絲酵母菌，可有高度特異度和靈敏度 ,檢測限 為每毫升血 10方法具有簡便、特異、價廉以及自動化等優(yōu)點，非常適合無分子生物學實驗經驗者操作。從 整個過程 4,結果穩(wěn)定可靠 24。 但是 法繁瑣難度大，檢測成本較高。 時 術（ 是一種可對病原微生物核酸進行量化檢測的分析技術，可實時檢測 熒光信號，通過分析軟件對起始模板進行定量及定性分析，與常規(guī) 具有特異性強、自動化程度高等優(yōu)點 。 P. 93例（患者樣本 145例，健康志愿者樣本 48例）濃縮漱液培養(yǎng)的假絲酵母菌，結果顯示 也蒙假絲酵母菌 ( 著明假絲酵母菌 （ 的十種常見致病口腔假絲酵母菌。培養(yǎng)法檢測出患者樣本中有 85例假絲酵母菌陽性樣本（ 59%），健康志愿者樣本中有 17例假絲酵母菌陽性樣本（ 38%）。 測出患者樣本中有 97例假絲酵母菌陽性樣本（ 67%），健康志愿者樣本中有 18例假絲酵母菌陽性樣本（ 40%）。同時證明培養(yǎng)法可以出現假陽性的結果。與以往血樣本相比，使用 濃縮漱液培養(yǎng)樣本檢測假絲酵母菌仍然是一個初步的，有待于進一步評估的方法 7。但由于推廣應用仍有一定的限制 25。 時熒光定量 目前已應用到農業(yè)科研，食品衛(wèi)生監(jiān)測，細菌、病毒等微生物檢測和研究。是一個循環(huán)擴增產物量的變化通過 26。該技術污染率低、 耗時短、精度高、 能實現多重反應、定量結果準等特點。目前該技術已經應用于食品檢測、腫瘤耐藥基因表達的研究、病毒感染的定量監(jiān)測，此外對各種病原體均可進行準確的定量檢測 27 假絲酵母菌胞外 究 侵襲性假絲酵母菌 病，證實該方法具 有高度特異性 和敏感性（ 10飛克 ） 29。國內文獻鮮見使用實時熒光定量 絲酵母 菌進行檢測的報道。 總之，采用傳統(tǒng)的口腔假絲酵母菌菌種鑒定費時、繁瑣、易出現假陽性。我們應該立足并不斷改良現有的口腔假絲酵母菌常規(guī)檢查法及分子生物學方法，快速、準確地鑒定口腔假絲酵母菌，為制定合理的臨床治療方案打下一定的基礎。使用新興的分子生物學技術，如實時熒光定量 時結合濃縮漱口液取樣法檢測口腔假絲酵母菌，患者可接受性強，操作簡便、敏感性高、特異性強，將助于臨床醫(yī)生對口腔假絲酵母菌病的早期診斷和治療。 參考 文獻 1. 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