密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 博萊霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 I 摘 要 博萊霉素是一族具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和作用的廣譜抗菌抗腫瘤抗生素 ,由 5個(gè)氨基酸、 2個(gè)六碳糖和 1個(gè)胺基側(cè)鏈構(gòu)成 ,各組分分子結(jié)構(gòu)間差異僅在于胺基取代側(cè)鏈的不同。博萊霉素對(duì)頭頸部鱗癌、惡性淋巴瘤有效 ,且 不引起白細(xì)胞減少 ,不抑制機(jī)體免疫功能 ,也不損害造血系統(tǒng)。博萊霉素殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制是在體內(nèi)與鐵、氧結(jié)合生成復(fù)合物 ,與染色體作用后進(jìn)攻 引發(fā) 從而抑制腫瘤細(xì)胞 目前博萊霉素的效價(jià)很低，而本實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株 5 g/了提高效價(jià)，實(shí)驗(yàn)通過五種方法分別對(duì)博萊霉素出發(fā)菌株 后通過 N+離子注入選育出高產(chǎn)菌株 對(duì)原始發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化及前體加入濃度和加入時(shí)間進(jìn)行了選擇，使博萊霉素的效價(jià)顯著提高。研究結(jié)果如下： 波、 亞硝基胍、電子束、離子注入五種方法分別對(duì)效價(jià)為 25 g/外線、微波、亞硝基胍、電子束初篩的高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩時(shí)效價(jià)都有不同程度的降低，傳代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)驗(yàn)時(shí)高產(chǎn)菌株都不穩(wěn)定，退化現(xiàn)象明顯，效價(jià)降低幅度很大，基本沒有利用價(jià)值。而 最后 通過 N+離子注入選育的高產(chǎn)菌株 g/出發(fā)菌株的 ，而且該菌株的效價(jià)非常 穩(wěn)定，傳代 5 g/ 高菌株 發(fā)酵效價(jià) 。并通過對(duì)無機(jī)鹽、碳源、氮源的正交設(shè)計(jì)選擇各組分在發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適濃度，選擇出不同于原始發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，此時(shí)博萊霉素的效價(jià)可以提高到 g/后通過對(duì)加入前體的濃度和加入時(shí)間的選擇進(jìn)一步提高博萊霉素在發(fā)酵液中的含量。結(jié)果表明 36h 加入濃度為 前體精胺可以使博萊霉素的效價(jià)進(jìn)一步由 g/高到 g/ 關(guān)鍵詞 ：博萊霉素，菌株選育， 正交設(shè)計(jì)，培養(yǎng)基優(yōu)化，前體 is a of of 2 of of of is in is in of of LM is NA by LM At LM is as of is 5g/to 5 to At by + he of LM 1. of by V, + of of to in by In of of by + as as of is 2. In to of In to an of by of mL In in to LM in is LM be mL mL of ml 6h. 錄 摘 要 . I . 一章 引言 . 1 萊霉素的研究進(jìn)展 . 1 . 1 . 1 . 3 . 3 生素產(chǎn)生菌的菌種選育 . 4 . 5 . 7 . 15 酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 . 18 第二章 博萊霉素高產(chǎn)菌株選育 . 20 料和方法 . 20 驗(yàn)材料 . 20 驗(yàn)方法 . 21 果與分析 . 25 萊霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 . 25 物量、 價(jià)的變化曲 線繪制 . 25 外線對(duì) 孢子誘變 . 26 波輻射對(duì)出發(fā)菌株的誘變 . 29 . 31 子束輻射 . 33 子注入誘變 . 35 論 . 37 第三章 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 . 39 葡萄糖變成淀粉 . 39 肉膏添加實(shí)驗(yàn) . 39 機(jī)鹽對(duì)效價(jià)影響 . 39 源的選擇 . 41 源的選擇 . 43 體對(duì)博萊霉素效價(jià)的影響 . 45 . 45 . 45 論 . 46 四章 結(jié)論和討論 . 47 參考文獻(xiàn) . 50 致 謝 . 59 作 者 簡 歷 . 60 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 萊霉素的研究進(jìn)展 博萊霉素 (一組含肽的抗生素 ，分子量約 1500。 1966年日本的 酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)。它是一個(gè)由 10 余種組分組成的混合物 ,通過紙層析和柱層析可以得到 族成分 5、 天然產(chǎn)生的輪枝鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中分離得到的博萊霉素是含銅的復(fù)合物 ， 而臨床應(yīng)用的則是去金屬化合物 ,這樣可以降低注射部位的疼痛感。目前國內(nèi)外使用的博萊霉素主要成分為博萊霉素 這兩種成分對(duì)人毒性小，抗癌作用強(qiáng) ，在博萊霉素混合物中 分別占 55%70%和 25% 32%， 已廣泛用于臨床。博萊霉素 毒、肺毒性低的抗癌抗生素組分。博萊霉素 、腎無害，不損傷人體自身的免疫功能和骨髓造血功能。 博萊霉素 進(jìn)入人體后很快集聚于皮下、肺部、睪丸等處，對(duì)淋巴瘤、鱗狀細(xì) 胞癌、肺癌和睪丸癌等具有很好的療效。博萊霉素 抗腫瘤的主要機(jī)制是直接作用于 單鏈斷裂。 博萊霉素 上的糖鏈對(duì)癌細(xì)胞有一定的識(shí)別作用，從而使它能較專一地進(jìn)入癌細(xì)胞破壞 1993 年 報(bào)道博萊霉素 對(duì) 有一定的降解作用，但作用效率比對(duì) 得多，其作用位點(diǎn)與其在 要作用于 。目前對(duì) 博萊霉素 的研究重點(diǎn)主要在兩個(gè)方面，其一是研究 博萊霉素 切割 二是根據(jù)已得的信息，人工合成新的低毒高效抗腫瘤藥物。 萊霉素的藥理和毒副作 用 博萊霉素是一族具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和獨(dú)特作用的廣譜抗腫瘤抗生素。研究證明它能有效地抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌，對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、枯草桿菌等具有較強(qiáng)的抗菌作用。對(duì)頭頸部鱗癌、惡性淋巴癌等有療效。另外博萊霉素與亞德里亞霉素和長春新堿連用進(jìn)行化療，可以治療與愛滋病相關(guān)的 肉瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，并取得了肯定的療效 (992)。而利用博萊霉素破壞 特性，與其他抗病毒藥物聯(lián)用可提高對(duì)愛滋病的療效。 博萊霉素最常見的毒副作用是發(fā)熱、黏膜炎、脫發(fā)、 厭食、惡心、嘔吐和色素沉淀；大劑量給藥時(shí)對(duì)腎功能有一定的影響；最嚴(yán)重的毒副反應(yīng)為肺炎樣癥狀，可引起不可逆的肺纖維化。臨床病例表明，患者肺炎樣癥狀出現(xiàn)率大于 10%，而由不可逆肺纖維化導(dǎo)致患者死亡率約為 1%。 萊霉素體內(nèi)作用機(jī)理和分子結(jié)構(gòu) 當(dāng)博萊霉素被注射到體內(nèi)時(shí)，首先與血液中的銅離子結(jié)合形成絡(luò)合物，一旦進(jìn)入肝臟，被肝臟酶還原脫去銅離子生成博萊霉素單體，再與鐵離子結(jié)合進(jìn)而與 合形成絡(luò)合物。絡(luò)合物與螺旋結(jié)構(gòu)的小溝經(jīng)過特異性核酸序列的識(shí)別而鍵合。而博萊霉素的雙噻唑基團(tuán)具有共平面性和芳香性，與 核酸堿基以部分插入的方式結(jié)合。通過形成的色散力使超螺旋的 弛，然中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 2 后釋放自由基，引起 解反應(yīng)，干擾 制（ 1998 ）。 (1997)曾報(bào)道改變末端胺基而使博萊霉素肺毒性降低。楊銘等（ 1995， 1997）通過光譜分析、黏度測(cè)定及 1究了博萊霉素 互作用的分子機(jī)制，探討了博萊霉素 同系物對(duì)小鼠肺毒性的差異與不同尾鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)系。他們還應(yīng)用快速酶聯(lián)免疫法 ( 及 跡雜交法研究了博萊霉素同系物誘導(dǎo)癌基因表達(dá)的作用。博 萊霉素的活性不僅限于鐵 破壞作用，高濃度的博萊霉素還能夠切斷 許多位點(diǎn)，釋放出尿嘧啶和腺嘧啶。博萊霉素還可以與其他離子作用，包括 V 也可以使 效果不如鐵明顯，且除需要需要其他條件如光照、 990）。 博萊霉素由 5個(gè)氨基酸、 2個(gè)六碳糖和 1個(gè)胺基側(cè)鏈構(gòu)成 ,各組分分子結(jié)構(gòu)間差異僅在于胺基取代側(cè)鏈的不同，見圖 1所示。博萊霉素發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入天然或非天然博萊霉素的末端胺，可以抑制其他天然博萊霉素的生成，并 生成包含該種末端胺的新的博萊霉素產(chǎn)物，這種現(xiàn)象叫前體效應(yīng)。在搖瓶培養(yǎng)的初始階段加入末端胺前體，這種現(xiàn)象就開始表現(xiàn)。 胺基烷基衍生物如胺、胍、锍等也可以結(jié)合至博萊霉素成為末端胺基團(tuán)， 這樣可以使用不同的末端胺對(duì)不同的博萊霉素進(jìn)行生物合成。 圖 1 博萊霉素分子結(jié)構(gòu) 2 嘧啶 ,3 纈氨酸 ,4 蘇氨酸 ,5 末端胺 , 6 7 聯(lián)噻唑 ,8 古洛糖 ,9 甘露糖 ,10 氨甲酰博萊霉素 R = R = ； 1: 4: 博萊霉酸 R = 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 3 萊霉素產(chǎn)生菌的基因工程改造 博萊霉素全合成、半合成和直接合成已經(jīng)產(chǎn)生了許多博萊霉素同系物。但全合成受費(fèi)用限制，半合成和直接合成只能變更某些官能團(tuán)。這樣隨著分子生物的發(fā)展使得對(duì)博萊霉素產(chǎn)生菌輪枝鏈霉菌在基因水平的研究和改造成為可能和必然。 973)等通過加入 14C 和 13C 標(biāo)記物的方法研究了博萊霉素的生物合成，表明博萊霉素糖苷配基是由一個(gè)絲氨酸、兩個(gè)天冬氨酸、一個(gè)丙氨酸、一個(gè)乙酸酯、一個(gè)蘇 氨酸、一個(gè) 萊霉素表現(xiàn)出肽（ 多聚乙酰（ 生物起源，被認(rèn)為是一種天然肽和多聚乙酰生物合成的異源代謝產(chǎn)物(1999)。 過非常相似的方式重復(fù)裝配延長的基團(tuán)，氨基酸通過非核糖體多肽合成酶（ 成長鏈。每個(gè)系統(tǒng)都包括一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模式的操作來確定裝配的數(shù)量、順序、末端結(jié)合單位特異性和使用同一個(gè) 4 博萊霉素合成酶應(yīng)該是由 成的一個(gè)功能體系，從而催化氨基酸和乙酸酯生成代謝產(chǎn)物。 克隆博萊霉素生物合成系統(tǒng)的基因的嘗試開始于 1994 年， (1994)由博萊霉素產(chǎn)生菌 克隆出兩個(gè)抗性基因 在大腸桿菌中得到超量表達(dá)，產(chǎn)生的蛋白也得到純化 。 由 點(diǎn)進(jìn)行染色體步移，以 探針， （ 1994）分離出來自 因庫包含抗性區(qū)域的 質(zhì)?？寺∑?。在 到確認(rèn)。 (1979)對(duì) 游區(qū)域進(jìn)行了步移測(cè)序，確認(rèn)了另外的七個(gè)開放性的閱讀框，但并沒有發(fā)現(xiàn) 1995)采用與 過染色體步移與 們?cè)诳寺×?33 個(gè)開放性閱讀框后發(fā)現(xiàn)了一個(gè) ，而在此 上游有五個(gè) 系，并推測(cè)其功能。另外 (1979， 2001)克隆并討論了博萊霉素生物合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的基因?？寺〔┤R霉素生物合成基因簇為通過多基因控制的博萊霉 素生物合成產(chǎn)生新的博萊霉素類似物奠定了基礎(chǔ)，而對(duì) 因所進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造能夠產(chǎn)生具有更好選擇性和抗腫瘤活性的新博萊霉素藥物。 萊霉素國內(nèi)外研究進(jìn)展 博萊霉素在國家“十五”攻關(guān)項(xiàng)目前三年的工作中，首先對(duì)已有的博萊霉素產(chǎn)生菌和生產(chǎn)工藝進(jìn)行了深入研究和優(yōu)化，在較短時(shí)間內(nèi)定向地獲得了高產(chǎn)菌種。通過改進(jìn)發(fā)酵條件特別是通過前體加入法使現(xiàn)有的發(fā)酵水平有了較大幅度的提高。并使博萊霉素 有效組份中的含量比從10%提高到 50%通過中試驗(yàn)證了前體物合成的制備路線并得到了足夠量的前體物，為發(fā)酵工藝產(chǎn)業(yè)化試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。通過小型自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵，為放大發(fā)酵提供了必要的參數(shù)和條件。已經(jīng)進(jìn)行的規(guī)模化放大發(fā)酵試驗(yàn)也取得了較好的結(jié)果。 國外的博萊霉素是日本 學(xué)者 60年代發(fā)現(xiàn) 的抗生素，由十余種活性組分組成，主要組份為 2。經(jīng)臨床應(yīng)用 30多年證明確實(shí)有效，且不損害免疫和骨髓，也不損害心、肝、腎。但缺點(diǎn)是抗瘤譜不夠廣，有較嚴(yán)重的肺毒性。肺炎樣癥狀發(fā)生率在 10%以上，有 1%以上的病人因產(chǎn)生不可逆的肺纖維化而死亡。因此尋找抗瘤譜廣、有特點(diǎn)，且肺毒性低的新品種乃是這類藥物開發(fā)研究的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 4 重要目標(biāo)。為此，國內(nèi)外均進(jìn)行了大量 的工作。成功的例子是七十年代中晚期，日本開發(fā)的末端胺為苯乙丙雙胺，該化合物的抗瘤譜比原來的博萊霉素廣 ,可用于扁平上皮癌、喉癌、陰莖癌 ,也可用于胃癌和前列腺癌等。不良反應(yīng)比博萊霉素輕，臨床出現(xiàn)肺毒性反應(yīng)的病例為 約有 病人發(fā)展為彌散性間質(zhì)性肺炎。 在國內(nèi)，六十年代末我國從土壤中分離出了博萊霉素產(chǎn)生菌，七十年代初，即研制成爭光霉素。開始是以混合物的形式制成制劑，用于臨床腫瘤化療。七十年代中期，發(fā)現(xiàn)我國爭光霉素復(fù)合物的組分與博萊霉素復(fù)合物相比差別很大。其中 分一般可達(dá) 50%尤其 分也可達(dá)10%以上。我國 對(duì)博萊霉素 成功開發(fā)，使得這個(gè)化合物于八十年代初，即以單組分被命名為平陽霉素，用于臨床腫瘤化療， 1982年獲國家二級(jí)發(fā)明獎(jiǎng)。平陽霉素的重要特點(diǎn)是抗瘤譜廣，其肺毒性與 致相當(dāng)，近二十年來發(fā)揮了良好的作用并于 1990年收入我國藥典。 依據(jù)日本七十年代早期的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在博萊霉素復(fù)合物中， 含量只有痕跡量。他們發(fā)現(xiàn)，對(duì)大多數(shù)博萊霉素組分來說，向培養(yǎng)基中加入特定組分的末端胺前體，發(fā)酵產(chǎn)物中的特定組分含量比會(huì)大幅度提升而其他組分的產(chǎn)生則不同 程度地被抑制，但博萊霉素 是個(gè)例外，向培養(yǎng)基中加入其末端胺前體 (精胺 )，發(fā)酵產(chǎn)物中的博萊霉素 仍只有痕跡量。所以國外對(duì) 今未進(jìn)行深入研究和開發(fā)。 博萊霉素族抗生素在臨床應(yīng)用的突出特點(diǎn)是在治療過程中沒有常用抗癌藥物所引起的白細(xì)胞減少 ,也不抑制機(jī)體的免疫功能 ,這對(duì)癌癥患者的治療是十分重要的。博萊霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞更容易吸收博萊霉素。當(dāng)通過與可視核磁共振或放射性金屬離子聯(lián)合使用時(shí) ,博萊霉素就可以作為腫瘤顯影試劑或放射性治療試劑使用（ 1996）。博萊霉素對(duì) 正常細(xì)胞也有毒性 ,皮膚和肺是特別敏感的組織 ,因?yàn)檫@些組織中博萊霉素水解酶含量相對(duì)較少。但是博萊霉素與單克隆抗體偶聯(lián) ,則能選擇性與腫瘤細(xì)胞結(jié)合 ,體內(nèi)外抗腫瘤作用更強(qiáng)（劉小云 ,2000）。博萊霉素特異性識(shí)別并切割 使其成為核酸研究的有效工具。研究博萊霉素識(shí)別及切割 將為人工設(shè)計(jì)新的抗癌藥物開辟一條途徑。另外 ,研究博萊霉素與酶概念的關(guān)系 ,在理論上也有重大意義。盡管國內(nèi)外的科研工作者為改進(jìn)博萊霉素的抗腫瘤作用 ,擴(kuò)大臨床使用范圍 ,降低肺毒性已進(jìn)行了不懈的努力 ,并取得了顯著的成效 ,但至今包括克服 耐藥性等問題仍是擺在博萊霉素族抗生素研究工作者面前的問題。 博萊霉素對(duì)癌癥患者來說是一個(gè)福音，但是目前博萊霉素的生產(chǎn)水平很低， 無法進(jìn)行大批量工業(yè)化生產(chǎn)， 因此如何提高其產(chǎn)量便成為一個(gè)很重要的問題。例如通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化提高博萊霉素的發(fā)酵水平，通過誘變育種或者基因工程的手段改變出發(fā)菌株的性能，從源頭上提高菌株的產(chǎn)素能力。 生素產(chǎn)生菌的菌種選育 抗生素的出現(xiàn)在醫(yī)學(xué)上開創(chuàng)了化學(xué)治療的新紀(jì)元，使很多傳染病得到了控制，在保障人類健康方面起到了極其重要的作用。除了在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用之外，抗生素還在防 治動(dòng)植物病害、刺激動(dòng)植物生長、保藏食品以及工業(yè)等方面發(fā)揮著越來越重要的作用；同時(shí)，抗生素的發(fā)展對(duì)基礎(chǔ)科學(xué)如有機(jī)化學(xué)、藥物學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科提供了新的技術(shù)和內(nèi)容，特別是抗生素作為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 5 一個(gè)分子生物學(xué)研究的重要工具以及對(duì)其作用機(jī)制的深入研究更是推動(dòng)了分子生物學(xué)科的發(fā)展。 抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)為實(shí)現(xiàn)抗生素的巨大價(jià)值提供了有力的支持。然而，對(duì)于一種抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)，它的產(chǎn)生菌的菌種質(zhì)量是關(guān)鍵因素，因?yàn)檫@決定著該抗生素開發(fā)和發(fā)展的前途。如何改善抗生素產(chǎn)生菌的菌種質(zhì)量以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要是自從 1929年 現(xiàn)第一個(gè)抗生素青霉素以來，人們始終堅(jiān)持不懈進(jìn)行探索?？股禺a(chǎn)生菌的菌種選育技術(shù)是人們多年來圍繞這一問題不斷深入研究的結(jié)果。近年來，隨著人們對(duì)微生物遺傳學(xué)方面基礎(chǔ)理論研究的日益深入以及基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，抗生素產(chǎn)生菌的菌種選育技術(shù)可以說是發(fā)生了深刻的變化。 現(xiàn)代基因突變的研究開始于 1909 年，那時(shí)從紅色復(fù)眼的果蠅中間發(fā)現(xiàn)了一只白色復(fù)眼的果蠅，這一突變是自然發(fā)生的，稱之為自發(fā)突變。 1927 年，美國昆蟲學(xué)家 現(xiàn) 人為控制突變的開始。 1942 年， 發(fā)現(xiàn)氮 芥也能誘發(fā)果蠅突變，從此開創(chuàng)了人們利用理化因子來進(jìn)行工業(yè)微生物菌種 (特別是抗生素產(chǎn)生菌 )選育的主動(dòng)地位。微生物的誘變育種約始于 1939年 20 世紀(jì) 40年代初， 用 得了各種代謝障礙的突變株，并于 1941年提出“一個(gè)基因一種酶”的學(xué)說；闡述基因與酶功能的直接關(guān)系，使遺傳學(xué)從細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平，促進(jìn)了工業(yè)微生物育種技術(shù)的發(fā)展。隨后 系統(tǒng)地總結(jié)了在青霉素產(chǎn)生菌中的 種系譜，為世界許多國家提供了青霉素高產(chǎn)變種。 60年 代， 分別從各方面綜合了微生物育種經(jīng)驗(yàn)，并總結(jié)出了一些規(guī)律，但當(dāng)時(shí)仍在不斷實(shí)踐中。 60 年代末，國際糧農(nóng)組織和國際原子能機(jī)構(gòu)組織了利用各種理化因子來改善農(nóng)作物品系的培訓(xùn)班，并發(fā)表了突變育種手冊(cè)，為誘變育種奠定了理論基礎(chǔ)，從而完成了從初期基礎(chǔ)研究向?qū)嶋H應(yīng)用的轉(zhuǎn)折。 70， 80年代，在抗生素產(chǎn)生菌誘變育種中有關(guān)誘變的方法以及突變體的篩選方法等有了很大發(fā)展，同時(shí)分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用也為誘變育種注入了新的活力，特別是 90年代分子標(biāo) 記方法的運(yùn)用以及人們對(duì)誘變規(guī)律和微生物遺傳學(xué)知識(shí)的進(jìn)一步了解，使得定向誘變有了可能。 在我國，抗生素工業(yè)起步于 50 年代，抗生素產(chǎn)生菌的誘變育種也起始于那個(gè)時(shí)間。 80 年代以來才真正進(jìn)入加速發(fā)展階段，特別是在新誘變因子的開發(fā)上，我國的科研工作者作出了巨大貢獻(xiàn)。進(jìn)入 90年代，誘變機(jī)理研究進(jìn)一步深入，育成菌種的數(shù)量及質(zhì)量也大大提高，但和世界發(fā)達(dá)國家水平相比，我國的抗生素產(chǎn)生菌的誘變育種無論是在基礎(chǔ)理論研究上還是在生產(chǎn)實(shí)踐上都還有較大差距。 盡管隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，將目的基因?qū)胨拗骶?，進(jìn)行克隆和表達(dá)，從而構(gòu)建基 因工程菌的報(bào)道已有不少，但基因工程菌用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的還為數(shù)不多，經(jīng)典的誘變育種仍是目前最重要的遺傳育種手段，特別是對(duì)遺傳背景不很清楚的對(duì)象，誘變育種更是必不可少。目前，國內(nèi)微生物育種界主要采用的仍是常規(guī)的理化因子等誘變方法。 生素產(chǎn)生菌菌種選育的應(yīng)用情況 隨著誘變育種理論知識(shí)的深入和生產(chǎn)實(shí)踐的提高 ,抗生素產(chǎn)生菌的菌種選育得到廣泛應(yīng)用，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： （ 1）提高生產(chǎn)能力。 從自然界分離到的抗生素產(chǎn)生菌的野生型菌株，生產(chǎn)能力通常很低，不能作為生產(chǎn)菌種，但野生型菌種經(jīng)過誘變選育后，生產(chǎn) 能力往往可提高幾十至幾百倍。例如 :中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 6 經(jīng)過一系列的物化誘變處理，同時(shí)結(jié)合培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在 40多年內(nèi)，青霉素產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力增加了 300 多倍，達(dá)到了目前的 60000 U/89000 U/時(shí)，在其他抗生素 (如鏈霉素、金霉素、地霉素等 )產(chǎn)生菌的選育中也取得了巨大成績。 （ 2）改善抗生素的品質(zhì)。 抗生素產(chǎn)生菌產(chǎn)生的抗生素，往往不是單一的，而是多組分的混合物。通過誘變育種可將其中有毒的或活性弱的組分除去，同時(shí)也可增加有效組分或添加新組分。柱晶白霉素產(chǎn)生菌的野生型菌株的菌絲有一定的毒性，四川抗菌素工業(yè)研究 所的孫益 (1994)等，利用常規(guī)理化因子對(duì)其進(jìn)行誘變處理。結(jié)果不但改造了菌株菌絲有毒性的不良性狀，而且還使得發(fā)酵產(chǎn)品中主組分 含量顯著提高。小諾霉素是一種抗菌作用強(qiáng)，毒性底的廣譜抗生素，但在剛投產(chǎn)時(shí)由于副組分含量較高，該抗生素的品質(zhì)受到了非常大的影響。后來經(jīng)過多年的誘變育種及發(fā)酵工藝調(diào)控，小諾霉素主組分的含量才逐步上升。 （ 3）合成新的抗生素產(chǎn)品。 誘變某些抗生素產(chǎn)生菌，去掉或改變抗生素母核上的某一功能團(tuán)，可以得到療效更好的新品種，稱之為突變生物合成 (如用亞 硝基胍誘變紅霉素產(chǎn)生菌波賽鏈霉菌 (獲得一青色突變株能產(chǎn)生新品種阿霉素。阿霉素是紅霉素母核上 14位置的 14霉素僅對(duì)白血病有效，而阿霉素對(duì)人類急性白血病及多種實(shí)體瘤均有療效。通過誘變篩選還可以得到原抗生素母核上較復(fù)雜基團(tuán)發(fā)生改變的新抗生素產(chǎn)生菌。目前，在氨基環(huán)醇類抗生素，如新霉素，慶大霉素和巴龍霉素生產(chǎn)菌的選育中，正試圖用所謂突變生物合成方法來達(dá)到這一目的。誘變篩選不能合成抗生素某一組分的突變株，這類突變株只有在添加了它不能合成 的組分時(shí)才能合成原抗生素。由于次生代謝產(chǎn)物生物合成過程中，某些酶專一性不強(qiáng)，所以若添加的不是合成原抗生素所需要的組分，而是其結(jié)構(gòu)類似物，那么就有可能得到組入原抗生素不同類似物的多種新抗生素。例如，誘變新霉素產(chǎn)生菌，得到一株不能合成新霉素的一個(gè)組分 2 一脫氧鏈霉胺的突變株，在它的培養(yǎng)液中加入不同的前體類似物，如鏈霉胺等，即可分別獲得含有這些前體類似物的新抗生素。 （ 4）改善抗生素產(chǎn)生菌的性狀。 通過誘變選育還可改善抗生素產(chǎn)生菌的某些特性，以適應(yīng)生產(chǎn)上的設(shè)備和條件，并可簡化工藝條件，縮短發(fā)酵周期，增加設(shè)備以及 原料的利用率。如土霉素生產(chǎn)中選得了減少泡沫的變異菌株，從而提高了發(fā)酵罐的利用率；又如青霉素發(fā)酵液中需要添加昂貴的苯乙酸或苯氧乙酸為前體，才能有效地合成青霉素 G，誘變篩選氧化苯乙酸能力低，結(jié)合前體進(jìn)入青霉素分子能力強(qiáng)的突變株，可大大提高前體的利用率。 （ 5）用于研究推測(cè)抗生素的生物合成途徑。 在研究抗生素生物合成過程和抗生素形成的遺傳機(jī)制方面，抗生素產(chǎn)生菌的誘變也是一種非常有效的手段。在研究抗生素的生物合成途徑時(shí)，人們利用一些常規(guī)的人工誘變方法，使抗生素產(chǎn)生菌失去產(chǎn)抗生素或其中間體的能力，就可分離得到抗生 素生物合成的各種不同障礙型突變株。這些突變株能夠積累某種中間代謝產(chǎn)物或支路代謝產(chǎn)物，從分析產(chǎn)生菌和突變株的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，找出這些代謝產(chǎn)物在合成過程中的相互關(guān)系，即可推斷其生物合成的反應(yīng)步驟，再分離其反應(yīng)中的特殊酶類，可判斷其生化反應(yīng)的特性。在這些突變株中，抗生素阻斷型突變株 (亦被稱為抗生素零突變株 )便是常用的一種，它是指目標(biāo)抗生素分泌為零的突變株，歷來都是判明抗生素生物合成途徑有關(guān)基礎(chǔ)理論研究的好材料。例如頂頭孢霉 (頭孢菌素 C(物 合成途徑的闡述就是采用了若干這樣的突變株。同時(shí)，零突變株如發(fā)生回復(fù)突變往往能篩選到產(chǎn)抗生素能力大幅度提高的突變株，這種迂回躍進(jìn)戰(zhàn)略在抗生素高產(chǎn)菌株的選育方面也是非常有效的途徑。通過誘變育種中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 7 便能得到這種突變體。 976)等利用誘變獲得了一株不產(chǎn)慶大霉素的阻斷型突變體，利用它對(duì)慶大霉素的生物合成途徑進(jìn)行了論證和推理。廖愛芳 (1996)等對(duì)西索米星原生菌株 行紫外線誘變后獲得阻斷型綠色菌株 用 對(duì)西索米星的生物合成途徑進(jìn)行了合理的推測(cè)。 （ 6）與其他育種方法相結(jié)合。 誘 變育種與其他方法相結(jié)合起來，往往會(huì)使得育種效率大大提高。如 :雜交育種是將兩個(gè)親本的有利性狀組合在一起而獲得良種的育種方法。在雜交前先分別誘變兩個(gè)親本，獲得有利的突變型，然后再經(jīng)雜交將有利的基因組合起來，比起單純地將原始親本雜交更能得到理想的效果。 除此之外，誘變還可獲得各種類型的突變株，除了可直接提高產(chǎn)量外，有的是遺傳研究工作中不可缺少的標(biāo)記菌株，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、融合重組等；同時(shí)，這些突變菌株也拓寬了微生物的遺傳種質(zhì)資源，豐富了基因庫的內(nèi)容。 生素產(chǎn)生菌的菌種選育的方法 傳統(tǒng) 的菌種選育方法主要是自發(fā)突變和誘變育種，近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞技術(shù)和基因工程育種技術(shù)得到飛快發(fā)展。 然選育 自然選育是一種純種選育的方法，它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)變異的原理，通過分離，篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有水平的變株。因此，它能達(dá)到純化、復(fù)壯菌種、穩(wěn)定生產(chǎn)的目的。自然選育有時(shí)也可以來選育高產(chǎn)菌株，不過突變幾率很低，進(jìn)展很慢，基本不用這種最原始的方法。而高產(chǎn)菌株育種工作常采用誘變育種、基因重組。 變育種 誘變育種是指人工有意識(shí)地將生物體暴露于物理 的、化學(xué)的或生物等誘變因子下，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變株中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。由于它操作簡便 ,速度快、收效大而且誘變手段多樣 ,所以是實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)菌株育種的主要方式。當(dāng)前 ,在抗生素生產(chǎn)上常用的誘變劑主要包括以紫外線 ( )、射線 ( 、射線 ( 、快中子 ( )、5 2、烷化劑 (、等 )和吖啶類移碼突變劑為主的化學(xué)誘變劑。在實(shí)際生產(chǎn)中 ,無論化學(xué)誘變劑還是物理誘變劑 ,單獨(dú)使用很少能收到預(yù)期的效果。 所以生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復(fù)合處理、交叉使用的方法?；尹S霉素高產(chǎn)菌株的獲得就是一個(gè)很好的例子。另外在操作過程中 ,不同的菌株對(duì)誘變劑的種類、劑量乃至處理的先后順序要求是不盡相同的 ,朱昌雄 (1996)等曾對(duì)中生菌素高產(chǎn)菌株選育條件進(jìn)行研究 ,選出了原生質(zhì)體加紫外線處理的最佳方法。 并 通過此種處理方法獲得了四株較原株效價(jià)高 50%90%的高產(chǎn)菌株。 另外隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，學(xué)科之間相互滲透相互作用 為抗生素產(chǎn)生菌誘變育種增添了活力。在傳統(tǒng)的育種技術(shù)的基礎(chǔ)上，激光輻照、離子束注入、微波誘變育種以及空間誘變育種等新技術(shù)新途徑發(fā)展迅速，成為極為活躍的研究領(lǐng)域，呈現(xiàn)出良好的開發(fā)應(yīng)用前景?，F(xiàn)就這幾種新技術(shù)在抗生素產(chǎn)生菌誘變育種中的應(yīng)用情況及其作用機(jī)理作一闡述和分析。 (1) 激光輻照誘變育種 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 8 激光技術(shù)問世于 60年代，人們?cè)谖⑸镞z傳育種的研究中，逐漸認(rèn)識(shí)到激光作為一種物理誘變劑具有顯著的成效，現(xiàn)在已經(jīng)形成一門獨(dú)立的技術(shù) 激光誘變微生物技術(shù)。與其他誘變方式相比，激光誘變具有操作簡單、安全、變異率高、輻射損傷輕等優(yōu)點(diǎn)。而激光與其它誘變劑的復(fù)合處理，也具有潛在的誘人的誘變效果。到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于激光誘變微生物已做了大量的研究 工作。概括起來，激光誘變微生物技術(shù)在兩方面取得了卓有成效的發(fā)展。一方面是基礎(chǔ)性的規(guī)律和機(jī)理的研究，為激光生物技術(shù)的應(yīng)用作理論探討。另一方面是應(yīng)用性研究，歸結(jié)為微生物的激光誘變育種，即激光輻照代替常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑或手段培育既高產(chǎn)又能穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良菌株。 對(duì)于激光誘變微生物技術(shù)的機(jī)理，國內(nèi)外普遍比較認(rèn)同的一種解釋是光照活化效應(yīng)。在激光輻照機(jī)體時(shí)產(chǎn)生光照活化效應(yīng)（陳云琳， 2003），使核仁器抑制解除而被活化，并使 糖體上蛋白質(zhì)合成作用的活性增強(qiáng)，使機(jī)體內(nèi)的生物合成增強(qiáng)，特別是二羧酸 酶和細(xì)胞色素氧化酶活性提高，從而提高細(xì)胞利用氧的能力并增強(qiáng)細(xì)胞合成 能力。此外， 激細(xì)胞內(nèi)外的生理再生過程和修復(fù)再生過程。一般認(rèn)為光被呼吸鏈 (或稱電子傳遞鏈 )的光受體吸收是光的生物反應(yīng)的第一步，呼吸鏈中光受體的名稱、構(gòu)成、特性等也逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，而光在細(xì)胞內(nèi)引起的一系列反應(yīng)的結(jié)果，可能是對(duì) 而刺激微生物新陳代謝加速和生成繁殖速度加快。這中間的一系列反應(yīng)和反應(yīng)的中間產(chǎn)物及作用尚待深入研究。向洋等 (1994)用 育 株，其發(fā)酵液中慶大霉素有效組分 此可見，激光在提高抗生素的產(chǎn)量及有效組分含量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。毛寧等 (1997)報(bào)道應(yīng)用于生物體研究的激光大約只有 15種，通過分析工業(yè)微生物激光育種研究，指出工業(yè)微生物育種的種類主要有三種 :紫外激光，波長 260280間，主要適用于提高霉菌代謝產(chǎn)物為目的的育種；可見激光，波長 440700間，多用于原核微生物和酵母菌的育種；紅外激光，波長9004500用于細(xì)菌的育種 。并指出 :激光對(duì)微生物的效應(yīng)都是低劑量可促進(jìn)生長或較高的正突變率，而高劑量致死率大，負(fù)突變率也大。采用營養(yǎng)體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行激光輻照，劑量不宜太高。而采用孢子進(jìn)行激光處理，則可相對(duì)提高劑量。此外激光誘變時(shí)菌懸液置磁力攪拌器上協(xié)同作用其效果與單純激光處理不同。使被輻照的菌體置于無菌水中還是液體培養(yǎng)基中或固體培養(yǎng)基表面，因?yàn)椴煌囵B(yǎng)基對(duì)激光的吸收不同，導(dǎo)致對(duì)菌體的誘變效果也不同。 激光和普通光相比，具有高方向性、高單色性和高亮度等基本特性。因此，一旦某種激光的頻率和生物體內(nèi)某種物質(zhì)分子振動(dòng)頻率相等 ，