ZJNSF 浙江省自然科學(xué)基金申請書( 2006版) 第3頁同行評議組別藥物化學(xué)與生化藥學(xué)項(xiàng)目編號(hào)Z206510浙江省自然科學(xué)基金申 請 書申報(bào)類別:重點(diǎn)、重大項(xiàng)目項(xiàng)目名稱:天然來源新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別研究申 請 者:潘遠(yuǎn)江電 話托單位:浙江大學(xué)/理學(xué)院通信地址:浙江大學(xué)化學(xué)系郵政編碼:310027E-mail :申報(bào)日期:2006-5-25浙江省自然科學(xué)基金委員會(huì)二OO六年制基本信息申請者信息姓 名潘遠(yuǎn)江性別男出生日期1966年09月19日最終學(xué)位博士獲學(xué)位年份1994職稱教授主要研究領(lǐng)域天然藥物化學(xué)與有機(jī)波譜學(xué)E-電 人網(wǎng)頁/bnpc依托單位浙江大學(xué)/理學(xué)院證件類型身份證證件號(hào)碼620102660919533申請者是否近三年調(diào)入在浙單位工作否調(diào)入時(shí)間 申請者曾主持的浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目編號(hào):298017,R00042申請者正在主持的國家和省部資助經(jīng)費(fèi)在20萬元及以上的研究項(xiàng)目名稱、來源和研究期限:抗氧化植物多酚的新型逆流色譜分離方法研究 國家自然科學(xué)基金 23 2005.12007.12 質(zhì)譜在天然來源抗腫瘤活性成分靶向篩選中應(yīng)用 國家自然科學(xué)基金 23 2005.12006.12 項(xiàng)目基本信息項(xiàng)目名稱天然來源新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別研究申報(bào)類別重點(diǎn)、重大項(xiàng)目研究屬性前瞻性應(yīng)用基礎(chǔ)研究同行評議組別醫(yī)藥科學(xué)/藥物化學(xué)與生化藥學(xué)依托基地名稱 預(yù)計(jì)研究年限2007年01月2009年12月總經(jīng)費(fèi)預(yù)算20.0萬元申請經(jīng)費(fèi)20.0萬元項(xiàng)目研究目標(biāo)、內(nèi)容和意義簡介(限400字)選擇浙江產(chǎn)幾種抗腫瘤藥用植物-蘭科植物石豆蘭屬和石斛屬植物廣東石豆蘭（Bulbophyllum kwangtungense Schlecht）與細(xì)莖石斛（Dendrobium.moniliforme）為研究對象，對其中的抗腫瘤生物活性成分進(jìn)行研究,重點(diǎn)關(guān)注這些植物中含量低微，結(jié)構(gòu)新穎的有效成分的研究。本項(xiàng)目擬以基因工程獲得的具有激酶活性的病毒癌基因表達(dá)蛋白v-Src作為蛋白質(zhì)靶標(biāo)分子, 在分子水平上對來自藥用植物中的若干含量低微的新的抗腫瘤活性分子進(jìn)行靶向篩選, 通過高分辨質(zhì)譜以及液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析手段進(jìn)行這些成分的分析確定，發(fā)展并建立微量水平上的天然來源新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別新途徑，并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合其他波譜手段結(jié)合體外藥理驗(yàn)證，獲得一系列具有新穎結(jié)構(gòu)與良好抗腫瘤活性、具有應(yīng)用前景的新型藥物先導(dǎo),為創(chuàng)制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥的研究提供科學(xué)依據(jù).關(guān)鍵詞（不超過4個(gè)）v-Src;抗腫瘤藥物先導(dǎo)；快速識(shí)別；質(zhì)譜分析同行評議分組說明天然藥物化學(xué) 重點(diǎn)資助方向創(chuàng)新藥物的基礎(chǔ)與藥物資源學(xué)研究申請書版本號(hào)：23310772 項(xiàng)目組主要成員編號(hào)姓名出生日期性別職稱學(xué)位單位名稱電話項(xiàng)目分工每年工作時(shí)間（月）（(月)1潘遠(yuǎn)江1966年09月19日男教授博士浙江大學(xué)/理學(xué)責(zé)人82吳曉丹1971.07.16女高級(jí)工程師碩士浙江大驗(yàn)研究93王丹華1966.05.31男博士后博士浙江大驗(yàn)研究84何山1982.01.12男博士生學(xué)士浙江大驗(yàn)研究95胡楠1982.10.10女博士生學(xué)士浙江大驗(yàn)研究96萬結(jié)平1982.01.17男碩士生學(xué)士浙江大驗(yàn)研究97 總?cè)藬?shù)高級(jí)中級(jí)初級(jí)博士后博士生碩士生參加單位數(shù)62001211說明：1.個(gè)人介紹部分申請者必須填寫，其他人員可以不填寫；2.高級(jí)、中級(jí)、初級(jí)、博士后、博士生、碩士生及參加單位數(shù)由申請者負(fù)責(zé)填報(bào)，總?cè)藬?shù)自動(dòng)生成；3.第一人必須是申請者，信息從前面自動(dòng)讀入，但每年工作時(shí)間必須手工錄入。ZJNSF 浙江省自然科學(xué)基金申請書（2006版） 第17頁個(gè)人介紹：潘遠(yuǎn)江：學(xué) 歷： 1984.91988.6 蘭州大學(xué)化學(xué)系 理學(xué)學(xué)士 1988.91991.6 蘭州大學(xué)化學(xué)系 理學(xué)碩士 西北產(chǎn)藏藥翠雀花中二萜生物堿研究 導(dǎo)師：陳耀租 院士 1991.91994.6 蘭州大學(xué)化學(xué)系 理學(xué)博士 生物活性分子的質(zhì)譜研究 導(dǎo)師：陳耀租 院士工作經(jīng)歷：1994.91996.5 浙江大學(xué)化學(xué)系 博士后1996.71997.10 瑞士伯爾尼大學(xué)化學(xué)與生物化學(xué)系 博士后1995年11月 浙江大學(xué)化學(xué)系有機(jī)與藥物化學(xué)研究所 副教授1999年11月 浙江大學(xué)化學(xué)系有機(jī)與藥物化學(xué)研究所 教 授 兼任浙江大學(xué)藥學(xué)院 教 授2000.11 浙江大學(xué)化學(xué)系 教授, 博導(dǎo)主要學(xué)術(shù)兼職： 中國化學(xué)會(huì)有機(jī)分析與生物分析專業(yè)委員會(huì)副主任 中國化學(xué)會(huì)有機(jī)化學(xué),Journal of Zhejiang University Science編委, 中國藥學(xué)會(huì)高級(jí)會(huì)員 杭州師范學(xué)院兼職教授主持的主要研究項(xiàng)目有：1）質(zhì)譜在天然來源抗腫瘤活性成分快速篩選中的分析研究 11.5 萬元 2000-2002，負(fù)責(zé)人 已完成2）冠心II號(hào)組成原理基礎(chǔ)研究 38 萬元 2001-2003，化學(xué)負(fù)責(zé)，已完成3）質(zhì)譜在天然抗腫瘤活性成分靶向篩選與分析中的應(yīng)用 23 萬元 2003-2005，負(fù)責(zé)人，在研4）生物活性植物多酚的逆流色譜分離新方法研究 23 萬元 2003-2005，負(fù)責(zé)人，在研5）中藥活性成分快速篩選的現(xiàn)代組合化學(xué)研究-省自然科學(xué)基金委人才基金 30萬元，2001-2003，負(fù)責(zé)人，已完成6）浙江傳統(tǒng)中藥抗癌生物活性成分快速篩選與結(jié)構(gòu)測定-省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 4萬元，1999-2001，負(fù)責(zé)人， 已完成。已發(fā)表學(xué)術(shù)論文120多篇，被SCI收錄100余篇，作為通訊作者的代表性SCI論文有：1. Lu, Xingguo Gong, Yuwen Lu, Jianjun Guo, Chenhui Wang, And Yuanjiang PanMolecular Cloning And Functional Characterization Of A Cell-Permeable Superoxide Dismutase Targeted To Lung Adenocarcinoma Cells: J. Biol. Chem., May 2006; 281: 13620 136272.Cao Xj, Tal Yp, Li Xy, Pan YJ Screening For Pregnane Glycosides With Immunological Activities From The Stems Of Stephanotis Mucronata By High-Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry Rapid Communications In Mass Spectrometry 2006, 20 (3): 403-411 3.Wang Kw, Sun Cr, Wu Xd,Pan YJ Novel Bioactive Dammarane Caffeoyl Esters From Celastrus Rosthornianus Planta Medica 2006,72 (4): 370-372 4. Huang SL, Pan YJ, Zhu WL, Wu AX A Novel Three-Component One-Pot Reaction Involving Alkynes, Urea Or Thiourea, And Aldehydes Orgnaic Letters 2005,7 (17):3797-3799 5. Lu YB, Sun CR, Wang Y, Pan YJ.Preparative Isolation And Purification Of Two Phenylbutenoids From The Rhizomes Of Zingiber Cassumunar By Upright Counter-Current Chromatography Journal Of Chromatography A 2005,1089 (1-2): 258-262 6. Wu SH, Sun CR, Pan YJ Preparative Counter-Current Chromatography Purification Of Valrubicin (AD-32) From Crude Synthetic Drug Using Upright Coil Planet Centrifuge With Four Multilayer Coils Connected In Series Journal of Chromatography A 2005,1076 (1-2): 207-211 7. Zhu YL， Huang Sl, Wan JP, Yan L And Pan YJ Two Novel Diastereoselective Three-Component Reactions Of Alkenes Or 3,4-Dihydro-(2H)-Pyran With Urea/Thiourea - Aldehyde Mixtures: 4+2-Cycloaddition Vs Biginelli-Type Reaction Org. Lett., 2006, ASAS Article.8. Wu SH, Sun CR, Pei SF, Pan YJ Preparative Isolation And Purification Of Amides From The Fruits Of Piper Longum L. By Upright Counter-Current Chromatography And Reversed-Phase Liquid Chromatography Journal of Chromatography A 2004 1040 (2): 193-204 9. Wu SH, Sun CR, Wang KW, Pan YJ Preparative Isolation And Purification Of Celastrol From Celastrus Orbiculatus Thunb. By A New Counter-Current Chromatography Method With An Upright Coil Planet Centrifuge Journal of Chromatography A 2004,1028 (1): 171-174 10. Zhang H, Gu Q, Liang Xl, Pan YJ Screening For Topoisomerase I Binding Compounds By High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analytical Biochemistry 2004,329 (2): 173-179 申請經(jīng)費(fèi)預(yù)算 20.0 萬元 計(jì)劃開支項(xiàng)目名稱計(jì)算根據(jù)及理由金額（萬元）1信息費(fèi)10000 文獻(xiàn)調(diào)研,聯(lián)機(jī)檢索與查新等 1.02專題學(xué)術(shù)活動(dòng)費(fèi)15000 出席國內(nèi)外會(huì)議1.53儀器和設(shè)備購置費(fèi)15000 色譜柱與進(jìn)口滲析膜等1.54能源材料費(fèi)130000 藥材采集、藥品購置、正反相材料購置、玻璃易耗品、化學(xué)試劑與NMR、MS等測試費(fèi)13.05計(jì)劃管理費(fèi)10000 按規(guī)定，用于水電補(bǔ)貼1.06人員費(fèi)20000 碩、博士生勞務(wù)補(bǔ)貼，發(fā)表論文補(bǔ)貼2.0注：開支范圍和標(biāo)準(zhǔn)參見浙江省省級(jí)科技項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)管理暫行辦法（浙財(cái)教字200220號(hào)）。 申請者承諾：我保證： （1）申請書內(nèi)容是真實(shí)的；（2）恪守科學(xué)道德，倫理道德的基本原則；（3）項(xiàng)目組成員知曉申請書內(nèi)容，并自愿參與研究工作；（4）已如實(shí)填報(bào)申請者正在主持的國家和省部資助經(jīng)費(fèi)在20萬元及以上的研究項(xiàng)目名稱、來源和研究期限；（5）如果獲得資助，我將履行項(xiàng)目負(fù)責(zé)人職責(zé)，嚴(yán)格遵守浙江省自然科學(xué)基金委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，切實(shí)保證研究工作時(shí)間，認(rèn)真開展工作，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。若填報(bào)失實(shí)或違反規(guī)定，本人將承擔(dān)全部責(zé)任。 簽字： 日期：項(xiàng)目依托單位承諾:已按規(guī)定對申請人的資格和申請書內(nèi)容進(jìn)行了審核。申請項(xiàng)目如獲資助，我單位保證對計(jì)劃實(shí)施所需要的人力、物力和工作時(shí)間等條件給予保障，嚴(yán)格遵守浙江省自然科學(xué)基金委員會(huì)有關(guān)規(guī)定，督促項(xiàng)目組遵守科學(xué)道德和倫理道德的基本原則，督促項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和本單位項(xiàng)目管理部門按照規(guī)定及時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。依托單位公章 日期 .正文撰寫提綱1、項(xiàng)目名稱天然來源新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別研究2、研究工作對浙江經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和科技發(fā)展的意義中草藥（藥用植物）有效成分研究是發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)制新藥的一條重要途徑，一直令人關(guān)注。長期以來，該研究獲得了許多極具應(yīng)用價(jià)值的新型藥物如紫杉醇等或其他藥物先導(dǎo)化合物如鬼臼毒素等, 為人類健康做出了貢獻(xiàn)。數(shù)十年來，我國在中草藥有效成分的研究方面取得了長足的進(jìn)步，也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，為天然藥物的創(chuàng)新研究奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，由于中草藥化學(xué)成分一般都十分復(fù)雜，傳統(tǒng)的研究模式（科技條件限制）往往只關(guān)注含量較為豐富的主要化學(xué)成分，且其有效成分的分離提取與藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)往往是脫節(jié)的；這種方式經(jīng)常會(huì)形成費(fèi)時(shí)費(fèi)力的無效分離；既大大降低了從中草藥有效成分出發(fā)創(chuàng)制新藥的效率，又往往會(huì)忽略一些含量極其低微的新型有效成分；而這些新的微量有效成分很可能是新型藥物先導(dǎo)的重要源泉。因此，在中草藥有效成分的研究過程中，必須充分借用現(xiàn)代高新技術(shù)手段，發(fā)展與建立微量水平上的生物活性成分快速識(shí)別的新方法，才能突破傳統(tǒng)研究模式的制約，加大尋找與發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)的可能性。在藥物（西藥）的研究中，曾發(fā)展通過篩選化學(xué)庫（組合庫、化合物庫）來尋找及優(yōu)化藥物先導(dǎo)(西藥)的新技術(shù)1，這一研究途徑可改變傳統(tǒng)的逐一合成或分離提取、逐一純化及逐一識(shí)別的模式，從而加快了藥物先導(dǎo)化合物出現(xiàn)的速度，這一技術(shù)也為中草藥有效成分（天然的復(fù)雜的化合物庫中的某些特定化合物）的研究提供了新思路。在快速篩選化合物庫的新技術(shù)中，基于生物親合等分子間相互作用（力）分析的靶向篩選受到了廣泛的關(guān)注2，其中一些與生命活動(dòng)密切相關(guān)的酶或蛋白等常常作為靶標(biāo)分子而被研究；這種基于靶標(biāo)分子與藥物分子（配體或抑制劑）的相互作用的體外生物活性篩選，便形成一種十分靈敏的生物活性分子的快速發(fā)現(xiàn)的途徑，這一研究方法的成功應(yīng)用除一是要選擇合適靶標(biāo)分子，二是要尋求與之匹配的活性分子定性檢測的高靈敏度的分析方法，飛速發(fā)展的現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)如電噴霧電離結(jié)合高分辨技術(shù)質(zhì)譜（ESI-HRMS）等因其具有快速，靈敏度高以及易與分離手段（如HPLC）聯(lián)用等特點(diǎn)正成為現(xiàn)代藥物研究最重要的分析手段之一3-4?？鼓[瘤藥物的研究與創(chuàng)制是關(guān)系到人類健康的重大課題之一，而從中草藥出發(fā)尋求與發(fā)現(xiàn)高效低毒的新型抗腫瘤藥物一直是醫(yī)藥行業(yè)極為關(guān)注的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域；如前所述，在傳統(tǒng)的中草藥有效成分研究基礎(chǔ)上，盡快開展微量水平上的生物活性成分的研究，將大大豐富抗腫瘤藥物先導(dǎo)的新源泉，在我們前期的研究中，本課題組曾以拓?fù)洚悩?gòu)酶以及微管蛋白作為靶分子，結(jié)合質(zhì)譜分析對一些抗癌藥物分子進(jìn)行了成功的篩選與分析5-6，然而由于拓?fù)洚悩?gòu)酶，微管蛋白的活性保持較為困難，因此基于這些靶標(biāo)分子的活性成分篩選的應(yīng)用受到很大的限制，為了探討并建立更具應(yīng)用前景的微量新型天然來源抗腫瘤活性成分篩選與分析一體化的新途徑，合適靶標(biāo)分子的選擇與應(yīng)用一直是我們極為關(guān)注的問題。近年來癌基因蛋白產(chǎn)物Src的發(fā)現(xiàn)引起人們的廣泛興趣，由于Src蛋白含有兩種主要形式即病毒癌基因表達(dá)蛋白v-Src與細(xì)胞原癌基因表達(dá)蛋白c-Src，c-Src蛋白的表達(dá)和活性異常是某些腫瘤發(fā)生、發(fā)展的原因之一，而v-Src蛋白本身就能誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生；因而研究開發(fā)Src蛋白抑制劑作為強(qiáng)效腫瘤抑制劑已成為目前國際醫(yī)藥界廣為關(guān)注的亮點(diǎn)7-8。為此，本項(xiàng)目擬以基因工程獲得的具有激酶活性的病毒癌基因表達(dá)蛋白-v-Src作為蛋白質(zhì)靶標(biāo)分子, 在分子水平上對中草藥中的一些新的微量抗腫瘤活性分子進(jìn)行靶向篩選, 結(jié)合高分辨質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用分析手段，對這些活性分子進(jìn)行分析確定，從而發(fā)展并建立微量水平上的天然來源新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別新途徑。浙江省藥用植物資源分布極其豐富，對這些藥物，除需要充分發(fā)揮傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物化學(xué)的研究方法優(yōu)勢外，還需盡快借鑒國際上先進(jìn)的研究方法，開辟新的研究思路， 將為我省研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥奠定扎實(shí)基礎(chǔ)并提供一條可行的捷徑。本項(xiàng)目研究將為尋找發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)提供新途徑，為促進(jìn)我省乃至我國醫(yī)藥事業(yè)的振興與發(fā)展做出貢獻(xiàn)，課題的實(shí)施既具有重要的學(xué)術(shù)理論價(jià)值又有廣闊的應(yīng)用前景。3、本項(xiàng)目研究目標(biāo)及與申請者研究工作長期目標(biāo)的關(guān)系；項(xiàng)目研究目標(biāo)：本項(xiàng)目擬以浙江民間抗癌藥用植物體為研究對象，以v-Src蛋白作為靶分子，對天然來源抗腫瘤活性分子進(jìn)行快速篩選，結(jié)合高分辨質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對這些分子進(jìn)行分析確定，以建立微量天然來源抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別新途徑，并應(yīng)用該途徑尋找發(fā)現(xiàn)一系列具有應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物先導(dǎo)。與申請者研究工作長期目標(biāo)的關(guān)系：申請者長期從事（天然）藥物化學(xué)研究，圍繞新的生物活性分子的尋找與發(fā)現(xiàn)這一研究方向，進(jìn)行了以下的研究工作：1）近幾年通過10余種藥用植物的植化研究，分離得到80多種新化合物，其中10余種是具有應(yīng)用前景的新的生物活性分子，在國際知名專業(yè)學(xué)術(shù)期刊Phytochemistry、Steroids、Journal of Natural Products，Tetrahedron letters (影響因子均大于2.0) 以及Planta Medica上發(fā)表了多篇論文；2）在天然來源生物活性成分分離與分析研究中進(jìn)行大量的積累：進(jìn)行了新的逆流色譜技術(shù)研究與開發(fā)并應(yīng)用于天然藥物有效成分的分離純化的研究中，其成果在Journal of Chromatography A (影響因子：IF為3.35)發(fā)表了論文6篇；負(fù)責(zé)承擔(dān)了一項(xiàng)國家自然科學(xué)基金 “抗氧化植物多酚的逆流色譜分離方法研究”（2005-2007）項(xiàng)目；應(yīng)用質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)開展了生物活性分子篩選與分析研究等一系列探索工作，分別在Analytica Chim.Acta, Rapid Communications in Mass Spectrometry 等雜志上發(fā)表論文多篇；3）發(fā)展與建立了生物活性分子在線分離分析的新途徑，進(jìn)行了抗癌藥物分子的靶向篩選與快速鑒定等研究探索，其研究成果已在Analytical Biochemistry, 科學(xué)通報(bào)，等雜志上發(fā)表，目前有一篇論文已遞交美國Analytical Chemistry(影響因子：IF為5.45); 負(fù)責(zé)承擔(dān)了兩項(xiàng)國家自然科學(xué)基金 “質(zhì)譜在天然抗腫瘤活性成分快速篩選與分析中的應(yīng)用”（1999-2001）與“天然來源抗腫瘤活性成分靶向篩選與質(zhì)譜分析”（2004-2006）項(xiàng)目。4）課題組通過綠色合成途徑開展了天然活性分子的合成與衍生以及目標(biāo)生物活性分子的藥物合成等研究工作，迄今已在Organic Letters(影響因子：IF為4.19)發(fā)表論文3篇；在Bioorganic and Medicinal chemistry Letters、Tetrahedron、European Journal of Organic Chemistry(影響因子均大于2.0)等其他雜志上發(fā)表論文多篇。5）基于靶向篩選必須擁有高效的新型蛋白靶標(biāo)的原則，近期與從事生命科學(xué)研究的相關(guān)課題組開展了合作研究，并于2006年在國際著名雜志Journal of Biological Chemistry(影響因子：IF為6.35)發(fā)表論文一篇?？傊?，尋找與發(fā)現(xiàn)新的藥物先導(dǎo)是我們研究的重要課題，為了順利實(shí)施該課題，發(fā)展與建立新的研究途徑與方法，歸納總結(jié)科學(xué)規(guī)律并促進(jìn)學(xué)科發(fā)展，一直是我們研究工作的長期目標(biāo)。天然來源抗腫瘤化合物是我們在長期的天然藥物研究中極為關(guān)注的一類活性成分，這不僅是因?yàn)榭鼓[瘤活性成分在天然藥用植物中分布較廣泛，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)多樣性，對其研究必將大大促進(jìn)天然藥物化學(xué)（有機(jī)結(jié)構(gòu)分析）研究技術(shù)與方法的發(fā)展與更新，既可豐富天然有機(jī)（藥物）化學(xué)理論內(nèi)容，更重要的是對這類活性成分的深入研究可大大豐富抗癌藥物先導(dǎo)的源泉（為藥物合成提供靶標(biāo)）從而為創(chuàng)制新藥奠定良好基礎(chǔ)，為我省、我國的醫(yī)藥事業(yè)做出貢獻(xiàn)。在我們近期的相關(guān)研究中，我們從一些藥用植物中得到的一系列具有抗腫瘤活性化合物，并申報(bào)了專利，這些化合物擁有多類結(jié)構(gòu)骨架如萜類、糖苷以及黃酮等，多數(shù)新結(jié)構(gòu)含量甚微，其分離分析頗為艱難，常規(guī)的正反相層析與高效液相制備要么效果不佳要么代價(jià)太大，因而發(fā)展微量水平上新的抗腫瘤活性成分分析的新途徑具有極其重要的意義。鑒于此，本項(xiàng)目擬以v-Src 蛋白作為靶標(biāo)分子，基于該靶分子與抗腫瘤活性分子的相互作用進(jìn)行中草藥中抗腫瘤活性成分的靶向篩選，結(jié)合高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對上述篩選出的成分進(jìn)行在線分離分析與鑒定，從而發(fā)展與建立關(guān)于天然來源抗腫瘤活性成分快速識(shí)別的新途徑。本項(xiàng)目的實(shí)施是我們長期研究目標(biāo)的最重要內(nèi)容之一。4、項(xiàng)目研究內(nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排研究內(nèi)容：浙江省原生的蘭科植物石豆蘭屬和石斛屬植物廣東石豆蘭（Bulbophyllum kwangtungense Schlecht）與細(xì)莖石斛（Dendrobium.moniliforme）等幾種植物根莖的乙醇提取物在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，對人卵巢癌HO-8910細(xì)胞，人宮頸癌細(xì)胞和人早幼粒白血病HL60等細(xì)胞株呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，在已展開的植物化學(xué)研究中，我們從幾種植物的富含成分中分離得到一系列9,10-二氫二苯并b,f氧雜卓類化合物與單體毛蘭素(Erianin)、毛蘭菲(Confusarin)等，這些化合物均顯示較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。 9,10-二氫二苯并b,f氧雜卓類 毛蘭素(Erianin) 毛蘭菲(Confusarin)本項(xiàng)目即以這幾種植物為研究對象，重點(diǎn)關(guān)注這些植物中含量低微，結(jié)構(gòu)新穎的有效成分的研究，擬以基因工程獲得的具有激酶活性的病毒癌基因表達(dá)蛋白v-Src作為蛋白質(zhì)靶標(biāo)分子, 在分子水平上對上述一系列新的微量抗腫瘤活性分子進(jìn)行靶向篩選, 通過高分辨質(zhì)譜分析及其聯(lián)用手段進(jìn)行分析確定，發(fā)展并建立微量水平上的天然來源新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)的快速識(shí)別新途徑，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)若干具有應(yīng)用前景的新型藥物先導(dǎo)，具體研究內(nèi)容如下：一： 植物中的富含有效成份的分離分析-常規(guī)研究途徑1）運(yùn)用傳統(tǒng)色譜方法得到富含成分有效部位分離提取，所獲得化合物多為已知結(jié)構(gòu)的化合物；對新結(jié)構(gòu)化合物，通過現(xiàn)代波譜技術(shù)（1D,2D-NMR等）確定結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行抗腫瘤活性驗(yàn)證。該過程可去除有效部位的富含成分，富集有效部位的微量成分。二：植物中的微量有效成份的分離分析發(fā)展新的研究途徑選擇病毒癌基因表達(dá)蛋白v-Src作為靶標(biāo)分子，自行組裝生物活性快速篩選裝置，見下圖所示：靶標(biāo)分子溶液與天然混合物溶液分 別置于由關(guān)鍵膜隔離的上下兩個(gè)篩選池中，由于靶標(biāo)具有親水膠體的性質(zhì)始終被截留在一個(gè)篩選池中，隔離膜對天然化合物小分子保持良好的通透性。當(dāng)液相多組分天然藥物化學(xué)成分通過膜在兩個(gè)篩選池運(yùn)動(dòng)時(shí)，基于生物親合作用，具有抗腫瘤活性的藥物分子（v-Src的抑制劑）與靶標(biāo)分子結(jié)合形成 圖一: 靶向篩選池復(fù)合物而被截留在裝有靶標(biāo)分子的篩選池中，其他未發(fā)生親合作用的化合物分子則呈游離狀態(tài)平衡分布在兩個(gè)篩選池中，隨后運(yùn)用HPLC-HRMS對要研究的化合物組分在實(shí)施篩選前后分別進(jìn)行分析，獲取化學(xué)成份指紋圖譜，通過比較這兩類指紋圖譜差異后，發(fā)現(xiàn)新的活性成份。由于該研究中所應(yīng)用的高分辨質(zhì)譜可給出有機(jī)分子的元素組成（分子式），而多極質(zhì)譜分析能給出豐富的結(jié)構(gòu)信息，因而我們可結(jié)合在線的SCI-finder直接獲得所篩選出的有效成分是否擁有新結(jié)構(gòu)，本項(xiàng)目重點(diǎn)關(guān)注新型活性成分研究。對于上述途徑得到的一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的新成份，也可通過半微量制備型HPLC制備，經(jīng)多維高分辨NMR技術(shù)（微量探頭）進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定。研究方案1. 靶蛋白v-Src 蛋白的制備克隆v-src全基因，在pGEX-KT高效表達(dá)質(zhì)粒中誘導(dǎo)表達(dá)，得到GST-Src融合蛋白，用Glutaione Sepharose 4B親和層析柱進(jìn)行純化，并采用Western blot和以polyGlu:Try (4:1)為底物的ELISA法鑒定其免疫原性和酪氨酸激酶活性。（該實(shí)驗(yàn)程序已經(jīng)非常成熟，10天就可得到足量的GST-Src融合蛋白，且該融合蛋白具有較高的靶標(biāo)蛋白v-Src的免疫原性和酪氨酸激酶活性，可以直接作為靶標(biāo)蛋白）。2藥用植物化學(xué)研究。一：關(guān)于植物中富含活性成份的研究與微量成分的富集。 1）對廣東石豆蘭與細(xì)莖石斛等幾種植物根莖部分粉碎，用70% 酒精浸泡提取，通過不同極性化學(xué)溶劑進(jìn)行化學(xué)部位分段，體外抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)獲得若干有效部位。2）運(yùn)用逆流色譜技術(shù)，大孔吸附樹脂及正反相柱層析對有效部位進(jìn)行分段分離，得到一系列主要成分，運(yùn)用現(xiàn)代波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定，一般為已知化合物。3）對上述分離得到的未知結(jié)構(gòu)的單體成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定并進(jìn)行藥理驗(yàn)證。4）通過LH20凝膠柱層析對上述已經(jīng)分出主要成分的有效部位進(jìn)行微量成分的富集與分段，得到若干含有多組分（微量成分）部位，體外藥理跟蹤得到系列有效部位。二：關(guān)于植物中含量低微的活性成份的快速識(shí)別研究1）制備并組裝含靶標(biāo)分子的篩選池，探討快速篩選的最佳條件。 2）以抗腫瘤作用確定的天然化合物如紫杉醇、長春新堿等若干已知抗癌成分為對照，通過實(shí)驗(yàn)考察溫度、PH值、有機(jī)溶劑、化學(xué)計(jì)量比以及相互作用時(shí)間對靶向篩選的影響, 結(jié)合HPLC色譜定量分析，確定篩選的最佳實(shí)驗(yàn)條件。 3）在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對若干含多種微量成分的有效部位進(jìn)行快速識(shí)別研究，在靶向篩選平衡后，活性成分與靶標(biāo)結(jié)合形成復(fù)合物而被截留，未被篩選化合物分子游離分布在兩個(gè)篩選池中，應(yīng)用HRMS或HPLC/MS對篩選前后的天然混合物溶液制備指紋圖譜，從指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)差異，可獲得生物活性成分的信息。 4）鎖定篩選出的活性成分，通過高分辨質(zhì)譜可提供元素組成（分子式）的功能，結(jié)合聯(lián)機(jī)數(shù)據(jù)庫檢索，確定新成分；運(yùn)用多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，進(jìn)行新化合物的結(jié)構(gòu)信息提取，初步鑒定其結(jié)構(gòu)。 5）對在線分析并結(jié)合檢索確定結(jié)構(gòu)的復(fù)雜新結(jié)構(gòu)成分，通過多次富集并結(jié)合半微量制備，運(yùn)用微量探頭多維NMR測定其結(jié)構(gòu)。 6）運(yùn)用體外腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)等常規(guī)藥理方法對一些具有新穎結(jié)構(gòu)的成分進(jìn)行藥理驗(yàn)證。 圖二：快速篩選流程見下圖：圖三. 抗腫瘤活性成分靶向快速識(shí)別技術(shù)路線如下：靶向篩選前多組分MS或HPLC/MS指紋圖譜-I天然來源多組分混合庫物 HPLC/MS 或MS分析 蛋白 確定抗腫瘤活性成分 靶向 對 發(fā) 篩選 照 現(xiàn) 比 差篩選后多組分化合物庫靶向篩選后多組分MS或HPLC/MS指紋圖譜-II HPLC/MS 較 異 或MS分析 進(jìn)度安排本項(xiàng)目擬用三年時(shí)間完成各項(xiàng)研究任務(wù)，預(yù)期進(jìn)展情況如下：1） 2007.12007.12 完成具體實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，藥用植物的采集，有效部位的提取分段，微量有效成分部位的制備。2） 2008.12009.6 完成各種藥用植物中富含化學(xué)成份的分離提取與結(jié)構(gòu)確定，同時(shí)建立微量或超微量抗腫瘤有效成份的快速識(shí)別的試驗(yàn)方法；完成多種的微量抗腫瘤活性成份的快速實(shí)驗(yàn)。3） 2009.62009.12 歸納，整理，分析總結(jié)并提交研究論文與總結(jié)報(bào)告。5、項(xiàng)目創(chuàng)新之處 關(guān)于天然來源的有效成分的研究, 國內(nèi)外研究人員通常還是采用常規(guī)的植物化學(xué)研究途徑結(jié)合離線的活性實(shí)驗(yàn)；今年來在分離材料、高靈敏度色譜制備手段上進(jìn)行大量的探索，對于一些微量成分的研究，目前尚無通用的方法，只有采用較為經(jīng)典的多次制備的途徑, 與活性銜接也是較難的, 因而本項(xiàng)目擬以v-Src 蛋白作為靶蛋白，基于該靶標(biāo)與抗腫瘤活性分子的相互作用進(jìn)行中草藥中抗腫瘤活性成分的靶向篩選，結(jié)合高分辨質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)對上述篩選出的成分進(jìn)行在線分離分析與鑒定，其創(chuàng)新之處在于：(1) 靶蛋白對藥物分子的靶向篩選以及高分辨質(zhì)譜分析均是極其靈敏的途徑，該方法適用于微量或超微量生物活性成分的分析研究，為從天然來源（藥用植物）中發(fā)現(xiàn)一些含量低微的抗腫瘤活性成分提供新手段，該研究未見文獻(xiàn)報(bào)道，豐富了有機(jī)與生物分析的理論內(nèi)容。（2）本項(xiàng)目關(guān)于生物活性成分的靶向篩選與分析鑒定可在線一體化實(shí)施，豐富了天然有機(jī)（藥物）化學(xué)研究方法，可大大提高了天然有機(jī)化學(xué)及藥物化學(xué)研究工作的效率。（3）靶標(biāo)與抗腫瘤活性分子的相互作用用于中草藥（藥用植物）中微量的抗腫瘤活性物質(zhì)的靶向篩選，可發(fā)展成為一種分子水平上的微量或超微量分離途徑，該研究無疑為分離科學(xué)增添了新的內(nèi)容。（4）本項(xiàng)目重點(diǎn)進(jìn)行多種藥用植物中微量成分的研究，以發(fā)現(xiàn)大量的擁有新結(jié)構(gòu)的生物活性成分，該研究可大大豐富抗癌藥物先導(dǎo)的源泉（為藥物合成提供靶標(biāo)）從而為創(chuàng)制新藥奠定良好基礎(chǔ)。（5）上述途徑也可適用于其他天然來源生物活性微量成分的快速識(shí)別.6、工作基礎(chǔ)與工作條件1）本項(xiàng)目申請人自1988年以來一直從事具有生物活性天然有機(jī)化合物的分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定研究，迄今已分離出80多個(gè)新化合物，在國際知名專業(yè)學(xué)術(shù)期刊等上發(fā)表了多篇論文，在探索與發(fā)展天然藥物有效成份分離新技術(shù)，進(jìn)行一系列研究工作，開展了新的逆流色譜儀技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用工作，申報(bào)專利兩項(xiàng)，在Journal of Chromatography A發(fā)表論文多篇，在發(fā)展生物活性分子質(zhì)譜分析研究領(lǐng)域，進(jìn)行了一系列的探索工作，分別在Analytica Chim.Acta等雜志上發(fā)表論文多篇；在發(fā)展與建立生物活性分子在線分離分析新途徑方面，在Analytical Biochemistry等雜志上發(fā)表論文多篇；同時(shí)課題組也開展藥物合成的一些研究工作，迄今已在Organic Letters發(fā)表論文3篇；在新的蛋白靶標(biāo)，與從事生命科學(xué)研究的相關(guān)課題組開展了合作研究，并于2006年在國際著名雜志Journal of Biological Chemistry發(fā)表論文一篇。總之，圍繞藥物化學(xué)研究，本課題組已發(fā)表學(xué)術(shù)論文120余篇，其中SCI收錄100余篇，申報(bào)專利6項(xiàng)，獲批2項(xiàng)，其研究成果共獲省部級(jí)及其他部門科技獎(jiǎng)三項(xiàng)。（2）課題申請者近幾年來負(fù)責(zé)承擔(dān)了的三項(xiàng)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，其中兩項(xiàng)課題“親合超濾-質(zhì)譜分析在天然來源抗腫瘤活性成分快速篩選中的應(yīng)用”與“質(zhì)譜在天然來源抗腫瘤活性成分靶向篩選中應(yīng)用”分別以拓?fù)洚悩?gòu)酶以及微管蛋白等作為靶標(biāo)分子，對一些抗腫瘤活性的物質(zhì)進(jìn)行了篩選分析研究，取得的結(jié)果可為本課題的實(shí)施提供有益的經(jīng)驗(yàn)，部分方法也可借用。由于酶與微管蛋白制備相對困難，活性保持也有一定的限制，本項(xiàng)目基因工程獲得的v-Src 蛋白作為靶分子, 對中草藥中的潛在的抗腫瘤活性分子進(jìn)行靶向篩選。該工作是本課題組前期工作延伸，已有較為扎實(shí)的基礎(chǔ)。（3）我們在近期的相關(guān)研究中，從一些藥用植物中分離得到的一系列具有抗腫瘤活性化合物，這些化合物擁有多類結(jié)構(gòu)骨架如萜類、糖苷以及黃酮等，多數(shù)新結(jié)構(gòu)含量甚微，其分離分析頗為艱難，常規(guī)的正反相層析與高效液相制備要么效果不佳要么代價(jià)太大，因而要獲得結(jié)構(gòu)骨架新穎的活性成分，發(fā)展微量水平上快速識(shí)別的新途徑非常必要。工作條件申請人所在研究所擁有Bruker 電噴