密級： 論文 編 號： 中國農(nóng)業(yè) 科 學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 木霉菌 產(chǎn) 生厚垣孢子相關(guān)基因的篩 選 與克隆 of of I 摘 要 木霉菌是一種具有重要經(jīng)濟價值的絲狀真菌 ，是一類分 布廣泛的土壤習(xí)居菌，被認為是最有希望的生防因子。據(jù)統(tǒng)計， 在全世界 25 個國家和美國 43 個州的生物防治課題中，大約 34是有關(guān)木霉的研究，可見木霉菌在生物防治上具有 獨特優(yōu)勢和研究價值。它的特點是對于生長環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性，可利用各種簡單或復(fù)雜的碳源和氮源，木霉可產(chǎn)生多樣的拮抗作用，產(chǎn)生抗生物質(zhì)和溶菌酶類。目前利用木霉作為植物病害的生防真菌已有很多的報道， 但將木霉作為生物農(nóng)藥直接用于生產(chǎn) ， 菌劑的保質(zhì)期還存在一定的問題。生物制劑要求有一定的保質(zhì)期，而影響菌劑保質(zhì)期的主要因素是菌體類型。木霉制劑有兩種類型，一種利用分生孢子另一種利用厚垣孢子。分生孢子產(chǎn)量大， 但存活期短，而 厚垣孢子 存活時間 長 ，保質(zhì)期長，因此厚垣孢子制劑有其獨特的優(yōu)勢。 目前對于厚垣孢子的研究多在于孢子的培養(yǎng)條件，對于厚垣孢子形成 的分子機制還知之甚少。為了研究這一問題，我們利用 紋技術(shù) 析了綠色木霉在特異產(chǎn)厚垣孢子的培養(yǎng)基中產(chǎn)生厚垣孢子和不產(chǎn)生厚垣孢子時基因表達的差異。采用了 96 對引物組合，分離到 48 個有差異的 段。通過 一步篩選出了五個陽性克隆。 果顯示，其中五個片段（ 、 、 、 ） 都呈陽性反應(yīng)， 和 在不產(chǎn)生厚垣孢子的時候表達量很少，但在產(chǎn)生厚垣孢子時表達量明顯增加。 、 和 在不產(chǎn)生厚垣孢子時沒有表達，而在產(chǎn)生厚垣孢子的時候有明顯表達， 證明這五個片段與產(chǎn)生厚垣孢子有關(guān)。為進一步弄清這五條片段的結(jié)構(gòu)，我們對它們進行了克隆和測序分析， 與哈氏木霉 60S 核糖體（ 因具有較高的同源性，與玉蜀黍赤霉 染色體 2 假定蛋白基因具有較高同源性， 的預(yù) 測產(chǎn)物與堿性 有較高同源性， 和 與已知基因同源性很低，可能代表新基因。 關(guān)鍵詞 : 木霉菌 ， 異顯示 ， 克隆 is an in of is in to of in of be as a of So or a a on on of is of In to it we to of in by 、 、 、 ) to of In to of we we is 0S to of is to to be 錄 摘 要 . I . 文縮略表 . V 第一章 緒 論 . 1 霉菌研究進展 . 1 木霉菌在生防中的作用 . 1 木霉菌分子生物學(xué)研究進展 . 2 研究厚垣孢子萌發(fā)相關(guān)基因的方法 . 5 異顯示技術(shù) （ . 5 抑制性消減雜 交（ . 6 表性差異分析 . 7 基因表達系列分析技術(shù) （ of . 7 轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù) . 8 增片段長度多態(tài)性技術(shù)（ . 8 術(shù)簡介 . 8 術(shù) 的基本原理和方法 . 9 術(shù)的特點 . 9 術(shù) 的應(yīng)用及發(fā) 展前景 . 10 生物 信息學(xué)的應(yīng)用 . 11 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫 . 12 生物信息學(xué)在基因研究中的 應(yīng)用 . 13 研究目的和意義 . 14 第二章 利用 術(shù)分析產(chǎn)生厚垣孢子相關(guān)基因 . 16 實驗材料 . 16 實驗方法 . 16 總 提取和 制備 . 17 析 . 18 聚丙烯酸胺凝膠中差異片段的回收 . 20 二 次 增 . 20 物 的純 化 . 21 反向 交 . 21 交 . 22 特異片段的 連接、轉(zhuǎn)化 . 24 陽性克隆的鑒定 菌液 測 . 25 序列測定 . 25 第三章 結(jié)果與分析 . 26 木霉菌絲的培養(yǎng) . 26 木霉菌 絲總 提 取 . 26 雙 鏈 合成 . 27 切 片段的預(yù)擴增 . 27 選擇性擴增 . 27 差異條帶回收 . 29 二 次 增 . 29 反 向 交 . 29 差異片段的克隆 . 30 組質(zhì)粒 的 定 . 30 異片段的序列分析與比較 . 31 交 . 32 第四章 討 論 . 33 木霉菌菌絲 總 提取方法 . 33 木霉菌 術(shù)中預(yù)擴增及選擇性擴增條件的篩選 . 33 二次擴增結(jié)果 . 33 交 . 34 木霉菌厚垣孢子生成相關(guān)特 異 段序列分析 . 34 展望 . 35 第五章 全文結(jié)論 . 36 參考文獻 . 37 致 謝 . 43 作者簡歷 . 44 附錄：主要試劑配方 . 45 V 英文縮略表 英文全稱 中文名稱 脂糖 芐青霉素 菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 菌培養(yǎng)用酵母提取物 沖液 互補 受態(tài)細胞 脫氧核苷三磷酸 二硫蘇糖醇 焦炭酸二乙 酯 EB(溴化乙錠 表達序列標簽 醛 油 異丙基硫代 養(yǎng)基 接酶 熔點瓊脂糖 -(3-（ 磺酸 聚丙烯 酰胺凝膠電泳 聚合酶鏈式反應(yīng) W=6000) 聚乙醇，分子量為 6000 粒 針 十二烷基硫酸鈉 體 菌培養(yǎng)基 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 霉菌研究進展 木霉菌屬半知菌亞門、 絲孢綱、絲孢目，常見于土壤中，是具有重要經(jīng)濟價值的一類真菌。早在 30 年代，人們就已經(jīng)認 識到木霉菌對植物病原菌的拮抗作用。多年來，對于木霉菌的拮抗作用 做 了深入研究，并取得了令人鼓舞的成果。在發(fā)展持續(xù)農(nóng)業(yè) 呼聲 越來越高的今天，它作為一類資源豐富的拮抗微生物，在植物病害的生物防治中具有越來越重要的作用。 目前生產(chǎn)上常用的木霉菌劑多為孢子制劑，將木霉發(fā)酵制成的孢子制劑進行種子包衣或土壤處理，可以有效地防治苗期病害。以色列的 司開發(fā)的以哈茨木霉 株為發(fā)酵液的生防制劑（ 為 25可濕性粉劑，可以用于防治灰霉病、苗枯病、霜霉病和白粉病等葉部病害及果實在儲存期的腐爛。由于木霉的孢子制劑多為活菌制劑，因此其田間應(yīng)用常常受溫度、濕度、雨水及化學(xué)農(nóng)藥等多種因素的干擾，田間實驗性狀表現(xiàn)極不穩(wěn)定，這也是所有生防拮抗菌應(yīng)用上的主要問題。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平上對木霉菌的生物防治機制進行研究和利用，必將有利于這一有益真菌的更好利用。 霉菌在生防中的作用 木霉菌對植物病原真菌的拮抗作用包含多種機制，一般認為有競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗 性、及協(xié)同拮抗作用。 1）競爭作用 木霉菌的競爭作用主要表現(xiàn)為對生存空間和營養(yǎng)的競爭。木霉菌的生命力強、生長快，能迅速占領(lǐng)空間，吸收營養(yǎng)。競爭是生物防治的重要方面。當兩個或更多的微生物對同一資源有更多的要求時就會發(fā)生競爭作用。在生防因子之間的競爭中，如果拮抗物的生長導(dǎo)致了病菌種群或侵染源數(shù)量的減少，那么競爭將產(chǎn)生對病害的控制。另一方面，引入的生物因子和土著微生物區(qū)系的競爭將引入微生物的長期定殖困難。 作為土壤腐生菌，木霉菌在生物學(xué)上既可以定殖營養(yǎng)基質(zhì)又可以在營養(yǎng)缺乏時產(chǎn)生厚垣孢子等休眠結(jié)構(gòu)。木霉菌在營養(yǎng)存在 條件下開始生長，能快速定殖于基質(zhì)或者利用抗生素或直接的重寄生作用與其他微生物競爭。木霉的快速生長、較高的產(chǎn)孢和利用營養(yǎng)基質(zhì)的能力， 使其成為高效生防因子。木霉菌與病菌之間的競爭包括對壞死組織的競爭，對根際、葉際分泌物的競爭和對傷口的競爭。 2）寄生作用 木霉菌的寄生作用表現(xiàn)為重寄生現(xiàn)象，是木霉菌對病原菌的主要拮抗機制之一。它是通過木霉菌對病原菌的識別、接觸、纏繞、穿透和寄生一系列連續(xù)的復(fù)雜過程。在木霉菌與病原菌互作的過程中，寄主菌絲分泌一些物質(zhì)使木霉菌趨向寄主真菌生長，而一旦寄主被木霉菌寄生物所識別，就會建立 寄生關(guān)系，木霉菌絲沿寄主菌絲平行生長或螺旋狀纏繞生長，并產(chǎn)生附著孢狀分枝吸附于寄主菌絲上，通過分泌胞外酶溶解寄主細胞壁，穿透寄主菌絲，使病原菌菌絲的細胞質(zhì)變稀薄、溶解或菌絲斷裂，從而使病菌菌絲停止生長，吸收營養(yǎng)。有研究證明寄生現(xiàn)象的發(fā)生與寄中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 主真菌表面的特定外源凝結(jié)素的識別有關(guān)。胞外裂解酶類，如幾丁質(zhì)酶，在不同情況下的差異表達可以影響木霉菌對特定寄主所具有的拮抗能力，因此決定它的寄主范圍。 3）抗生作用 木霉菌在代謝過程中產(chǎn)生拮抗性化學(xué)物質(zhì)來毒害病原菌，這些物質(zhì)包括抗生素和相關(guān)酶類，如：木霉菌素（ 綠膠霉素（ 綠木霉菌素（ 抗菌肽（ (徐同， 1996)。木霉菌產(chǎn)生揮發(fā)性乙醛對病原真菌具有抗性，哈茨木霉對立枯絲核菌防治機制之一是產(chǎn)生揮發(fā)性抗生素，主要成分為六戊烷基吡喃和戊烯基吡喃，具有椰子香味；從哈茨木霉和長枝木霉菌中分離純化的抗菌肽分別為 些次生代謝產(chǎn)物為農(nóng)用抗生素開發(fā)和利用提供了條件，但有些代謝產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，在一定條件下會轉(zhuǎn)化為不具抗菌活性的化合物，如膠霉素在 某些酶作用下可轉(zhuǎn)化為二甲基膠霉素而喪失活性。 4）誘導(dǎo)抗性 木霉菌的誘導(dǎo)抗性表現(xiàn)為能夠誘導(dǎo)寄主植物的各部分組織對病原菌產(chǎn)生抗性。木霉菌的誘導(dǎo)抗性機制與寄生作用、抗生作用無直接關(guān)系。即使寄生作用和抗生作用兩種機制缺陷的菌株仍可對寄主植株產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。 已有研究表明，把哈茨木霉接種到黃瓜的根部，可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的抗病相關(guān)蛋白，包括許多水解酶，其結(jié)果類似于用化學(xué)誘變劑（ 2， 6理使植物產(chǎn)生抗性。木霉對棉花立枯絲核菌的生防活性與其誘導(dǎo)棉花植株合成棉酚的含量有關(guān)。 1989 年發(fā)現(xiàn)，綠色木霉在以 聚糖或者天然植物細胞壁制備物為原始碳源的培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生木聚糖酶；植物在木聚糖酶作用下，具有明顯的防御反應(yīng)， K+、 H+、 子通道打開，合成乙烯以及積累 5）協(xié)同拮抗作用 木霉菌的拮抗作用可能有二種或者三種生防機制同時或者按順序起作用。 在 1988 年曾提出膠霉素和細胞降解酶協(xié)同作用模型，認為細胞壁降解酶的作用在于使毒素快速傳遞并且作用于原生質(zhì)膜的特異位點，起到增效作用。 在 1993 年從哈茨木霉和終極腐霉（ 相互作用的培 養(yǎng)液中提取出膠霉素，發(fā)現(xiàn)如果每升培養(yǎng)液中增加 75丁質(zhì)酶，可以減少 50%的膠霉素用量而起到同樣的效果； 2000 年研究表明，木霉菌對病原菌的作用包括產(chǎn)生抗生素和重寄生作用。 目前對木霉菌生防機理的研究還遠不夠深入和細致，還有很多方面有待進一步研究證實。對木霉菌作用機制的進一步研究，將為基于木霉菌的生物農(nóng)藥制劑的商品化生產(chǎn)提供理論上的依據(jù)和直接的指導(dǎo)作用。這些制劑的應(yīng)用極大地減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，在無公害糧食生產(chǎn)和改善生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮巨大作用。 霉菌分子生物學(xué)研究進展 八十年代以來， 木霉分子生物學(xué)研究取得重大進展。這不僅對木霉分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理生化及遺傳學(xué)是很大的促進，而且對木霉在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用更有著直接的影響。 1）木霉基因克隆 木霉基因克隆采用的方法主要有以下幾種。早期采用差異雜交法，分別用纖維素誘導(dǎo)條件下中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 和非誘導(dǎo) 條件下所提取的 備 針，與木霉基因文庫進行雜交，選擇那些與前者產(chǎn)生強烈雜交而與后者不雜交的菌落，從中篩選到纖維素酶基因。其他克隆基因的方法有：遺傳互補法，利用具有相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型遺傳背景的酵母菌作宿主篩選所需的酶基因；利用抗體的免疫篩選法；異源雜交 法，利用其他真核生物相關(guān)的基因片段為探針對木霉 庫進行原位雜交篩選；反求遺傳學(xué)法，由純化的酶蛋白得出部分氨基酸序列，由此設(shè)計并合成寡聚核苷酸混合物作為探針從 庫中篩選所需的酶基因。對于調(diào)控基因的分離，傳統(tǒng)的方法在對設(shè)想的調(diào)節(jié)蛋白沒有任何了解的情況下受限制很大。 1997 年 人發(fā)展了以酵母為基礎(chǔ)的雙載體克隆系統(tǒng)，以克隆木霉的纖維素調(diào)節(jié)基因，用此方法成功篩選到兩個活性蛋白基因，此方法的原理不僅適用于分離真菌水解酶調(diào)節(jié)基因，也可應(yīng)用于任何真核生物其他調(diào)節(jié)基因的分離。 在 木霉基因克隆中，對纖維素酶基因的研究比較充分。目前對于纖維素酶基因克隆的研究主要集中在真菌產(chǎn)生的酸性纖維素方面。由于木霉菌能產(chǎn)生大量的胞外纖維素酶，酶系較完全， 并且對結(jié)晶纖維素有較好的酶解活性，近十幾年來對真菌木霉屬纖維素酶基因做了大量的研究，并且都在 得 到了表達，并測定了這些基因的核苷酸序列。其中瑞氏木霉是研究最多 的木霉，已有八個纖維素酶基因得到克隆并測序，包括編碼纖維二糖水解酶的 編碼內(nèi)切葡聚糖酶的 以及編碼 酶的 它的類似物 目前已從絲狀真菌中分離到 230 多個基因，已克隆的主要基因包括在表 1 中。 表 1 木霉菌屬中已被克隆的相關(guān)基因 稱 拉丁文 克隆基因 參考文獻 哈茨木霉 T. et 002 哈茨木霉 T. et 996 哈茨木霉 T. 997 哈茨木霉 T et 000 哈茨木霉 T. et 000 康寧木霉 T. 令香等， 2001 里氏木霉 T. et 綠色木霉 T. et ）轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 目前木霉菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，多數(shù)是使用細菌質(zhì)粒構(gòu) 建的載體進行整合轉(zhuǎn)化，自主型復(fù)制質(zhì)粒應(yīng)用范圍較小。在聚乙二醇（ 氯化鈣作用下，把目的基因或 過再生和選擇獲得轉(zhuǎn)化子。 選用一個穩(wěn)定的選擇標記對建立木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是非常必要的，木霉轉(zhuǎn)化的選擇標記包括營養(yǎng)缺陷型標記和顯性標記兩類。前者常用的如 或 后者常用的有 養(yǎng)缺陷型標記包括一些碳源、氮源和硫源的代謝基因，它們能與相應(yīng) 的 營養(yǎng)缺陷型絲狀真菌受體菌遺傳互補，從而為轉(zhuǎn)化子提供一種正選擇方法。顯性標記中 木霉菌不能合成此酶，因此將木霉菌涂布在以乙酰胺為唯一碳源或氨源的培養(yǎng)基上即可方便的篩選攜帶 用來自原核生物中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 的抗性標記必須在原核基因前連接一個真菌啟動子序列。 營養(yǎng)缺陷型標記有可能引導(dǎo)載體治理整合染色體的同源部位，易于篩選，但作為受體的營養(yǎng)缺陷型的篩選比較困難，而抗性標記則避免了前者的缺點，但帶來的環(huán)境生物安全問題值得探討。 轉(zhuǎn)化 多拷貝的重復(fù)形式在木霉基因組中存在，盡管木霉菌轉(zhuǎn)化中有同源重組，但轉(zhuǎn)化 合并不需要序列同源性，這是木霉菌轉(zhuǎn)化不同于其他微生物轉(zhuǎn)化的特點。同源重組和非同源重組，兩者間的比例隨受體菌株和轉(zhuǎn)化載體而異。 源重組產(chǎn)生兩種類型轉(zhuǎn)化子，一種是在染色體基因組上帶有目的基因連鎖的重組，這是載體 同源重組常產(chǎn)生多位點、多拷貝的轉(zhuǎn)化子，即在轉(zhuǎn)化子 木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為人們從基因水平研究木霉菌的遺傳背景和進一步的菌株改造提供了條件，通過轉(zhuǎn)化把外源基因?qū)肽久咕毎没蚧パa、基因破壞和 基因替換等原理克隆或表達目的基因、分析基因的表達調(diào)控機理乃至改造工業(yè)生產(chǎn)菌株。此方面的例子很多， 等 (1998) 克隆了 碼驅(qū)動蛋白的基因 通過轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的同源重組造成 因的缺失，研究了驅(qū)動蛋白在細胞中的作用。 1990) 報道，通過基因定位置換整合使編碼瑞氏木霉 果 再產(chǎn)生 I，另外還有一些關(guān)于瑞氏木酶的一個或幾個纖維素酶基因經(jīng)基因定位置換整合而失活的報導(dǎo)。 高壓電泳沖 （ 在某些不適用 情況下木霉轉(zhuǎn)化的替代方法。 克隆基因在轉(zhuǎn)化子中的表達水平與多種因素如載體所用啟動子及其它序列，克隆基因本身，目的基因整合位置，整入的拷貝數(shù)及受體菌株有關(guān)。 3）外源基因的表達 木霉具有良好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，同時還具有真核的分泌機制以及可能具有與哺乳動物系統(tǒng)相似的蛋白修飾性能，如高甘露糖型和 菌的以上優(yōu)良性狀極大地促進了對木霉的遺傳改造，而構(gòu)建木霉外源基因強表達系統(tǒng)是進行木霉分子生物學(xué)研究和進行遺傳改 造的重要前提條件。哈茨木霉中表達的基因包括木質(zhì)素過氧化酶基因 丁質(zhì)酶基因，抗除草劑基因等。 1996）分離出哈茨木霉 用 主本身不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，在轉(zhuǎn)化子中，該酶表達比哈茨木霉提高了 20倍。根據(jù)這一結(jié)果，有可能將木霉菌不同胞壁降解酶基因在某種木霉菌株中均有高效表達，從而能夠構(gòu)建超級生防木霉菌。 4）重組蛋白的分泌 自然發(fā)生的菌株產(chǎn)生我們所需蛋白的水平很低，以至于不能在商業(yè)上加以利用。因此，為了得到所需的目的蛋白， 需要對出發(fā)菌株進行遺傳改造。瑞氏木霉所產(chǎn)生的一種主要的纖維素酶 纖維二糖水解酶 I() ， 由單拷貝基因編碼，其產(chǎn)量可達瑞氏木霉胞外分泌性蛋白總量的 50%。由此可見， 此在對瑞氏木霉的遺傳改造中，常利用 利用 在木霉中已發(fā)展出多種分子系統(tǒng)， 采用不同的策略用于同源和異源蛋白的生產(chǎn)。為了提高產(chǎn)量，使用強表達和有效分泌的纖維素酶 被證 明是一種有效的方法。雖然在基因組的其它區(qū)段也可獲得外源基因的有效表達，但 動子很強， 而且 點對于表中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 達似乎也是有益的。將外源蛋白融合到 連接區(qū)，能夠恢復(fù)對高水平表達起重要作用的區(qū)段，如：翻譯起始位點、信號肽序列及其作用位點。通過基因工程和發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)同源和異源蛋白，需要進一步地改進。對于不同的培養(yǎng)條件，包括含葡萄糖的培養(yǎng)基，應(yīng)該發(fā)展出不同的生產(chǎn)策略。 5）結(jié)語 近年來木霉菌分子生物學(xué)的研究取得重大進展，有越來越多的基因得到克隆和表達。真核表達系統(tǒng)是近年來新興的用于外源基因表 達的體系，它可以克服在原核表達系統(tǒng)中無法進行特定翻譯后修飾的缺陷，已成為生產(chǎn)具有生物活性的真核生物蛋白的重要途徑。雖然真核基因可以方便地克隆到原核系統(tǒng)中，但由于真核生物與原核生物之間存在差異，因此在原核生物中只能是 體外 研究。真核細胞具有很多原核細胞所沒有的功能，如線粒體合成 成組蛋白和核小體的功能，可以進行減數(shù)分裂，能夠分化等等。因此要想透徹地了解真核基因的功能就必須將其置于真核細胞的 體內(nèi) 環(huán)境下。 分子生物學(xué)技術(shù)在木霉菌中的應(yīng)用，使木霉菌的應(yīng)用更加廣泛，表明通過向分子水平的發(fā)展，將會加 快木霉菌廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的進程。 研究厚垣孢子萌發(fā)相關(guān)基因的方法 生物的生長發(fā)育，組織和細胞的分化調(diào)亡及變異都與基因的差異表達有關(guān)，基因在時間和空間上的有序貫穿和調(diào)控了個體的整個生命過程。由此，分離和克隆差異表達基因不僅有利于闡明生命的奧秘，而且還為生物的改良和基因診斷奠定基礎(chǔ)。過去 20 年，人們已經(jīng)分離到了相當數(shù)量的與發(fā)育相關(guān)的基因。這主要借助于蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離純化，然后根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)推算其相應(yīng)的核甘酸序列，并據(jù)此合成寡核甘酸探針，最終從 庫或基因組文庫中篩選出目的基因。而未知其編碼 產(chǎn)物的發(fā)育基因的分離克隆則是非常困難的工作，以前廣泛應(yīng)用的主要方法有 做圖克隆法（ 差別篩選法（ 扣除雜交法（ 這些方法雖然都取得了一定的成功，但由于各自的缺陷性，而限制了他們更加廣泛的應(yīng)用。近年來，分離差異表達基因的技術(shù)不斷發(fā)展與完善，出現(xiàn)了 增片段長度多態(tài)性技術(shù)（ 抑制性消減雜交（ 基因表達序列分析法（ 代表性序列差別分析技術(shù)（ 陣列等技術(shù)，目前這些方法已得到廣泛應(yīng)用，并已成功分離了許多差異表達的基因。 異顯示技術(shù)（ 異顯示技術(shù)（ 種將 轉(zhuǎn)錄技術(shù)與 術(shù)兩者結(jié)合起來的 紋圖譜技術(shù)。這種方法的基本原理是根據(jù)大多數(shù)真核細胞 3， 端具有多聚核甘酸尾 構(gòu)，因此可