密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 金絲桃素的提取 與 化學(xué)合成工藝的研究 on of on of of I 摘 要 金絲桃素 (貫葉連翹中最具有生物活性的物質(zhì)之一，研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的 抗抑郁、抑制中樞神經(jīng)、抗病毒活性和抗腫瘤的作用 。 其來(lái)源主要有兩方面 ,即 貫葉連翹植物的提取 和化學(xué)合成 ,目前國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道 ,但前者存在提取分離工藝煩瑣 ,后者存在產(chǎn)率低成本高等 問(wèn)題 ,而使金絲桃素的產(chǎn)業(yè)化受阻 。 為此，本實(shí)驗(yàn)研究綜合國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)資料， 對(duì)其 提取和 合成工藝 路線進(jìn)行優(yōu)化 改進(jìn)，具體設(shè)計(jì)如下： 金絲桃素的提取分離采取了兩步除雜的方式 ， 然后經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取 ,濃縮萃取液為浸膏 ,后分別用 40%和 80%的乙醇作為洗脫劑 ,利用大孔吸附樹(shù)脂柱層析進(jìn)行分離 ,收集紅色段液體 ,減壓濃縮得金絲桃素浸膏 蹤實(shí)驗(yàn) ,最后通過(guò) 定金絲桃素浸膏含量。 成 以丙酮和甲酸乙酯為起始原料 ,經(jīng)過(guò)縮合反應(yīng)甲基化反應(yīng)酰化反應(yīng)還原反應(yīng)等一系列化學(xué)反應(yīng)最終 合成目標(biāo)化合物金絲桃素 ， 期間我們對(duì)一些重要的中間體如 24 24 1,6,83黃素）以及 金絲桃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)了熔點(diǎn)的測(cè)定 ， 紅外光譜（ 質(zhì)譜（ 和核磁共振氫譜 （ 1波譜 的確證。 本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的反復(fù)摸索，確立了適合本實(shí)驗(yàn)研究的金絲桃素含量測(cè)定方法，并嚴(yán)格按照藥典（ 2005）規(guī)定對(duì)本實(shí)驗(yàn)提取的金絲桃素浸膏以及金絲桃素合成品進(jìn)行了含量測(cè)定。 取得的結(jié)果如下 : 1. 從貫葉連翹中提取分離的金絲桃素含量達(dá) 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)際市場(chǎng)上要求的 且提取率 (也超過(guò)了國(guó)內(nèi)所報(bào)道的數(shù)值 ， 其產(chǎn)品具有吸濕性低發(fā)粘性低的特點(diǎn)。 2 經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)合成的金絲桃素的產(chǎn)率為 31%， 含量達(dá)到85% 極大的降低了成本 ， 并同時(shí)得到了幾個(gè)重要的化學(xué)中間體。 綜上所述 ,本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的關(guān)于金絲桃素的全合成路線和提取路線均有較好的可行性 ,為金絲桃素的產(chǎn)業(yè)化提供了有利的依據(jù) ； 所建立的 測(cè)金絲桃素含量的方法，簡(jiǎn)便快速、靈敏準(zhǔn)確 ， 適用于金絲桃素的提取分離，以及化學(xué)合成的整個(gè)生產(chǎn) 過(guò)程中的質(zhì)量控制。 關(guān)鍵詞： 貫葉連翹 , 金絲桃素，提取，分離， 化學(xué)合成， 含量測(cè)定 is of of It of of is at of of it So in of to as 1. of to by to 0% 0% to In we 2. as a of as to To we of 2 S 3. to to to 005) We to by as as to a of its its 5% we . of . It of in to of to of of . ， 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 1 研究的目的和意義 . 1 2 貫葉連翹的研究進(jìn)展 . 2 3 金絲桃素的研究進(jìn)展 . 6 4 展望 . 14 第二章 貫葉連翹中金絲桃素提取方法的改進(jìn) . 15 1 材 料 . 15 2 工藝流程 . 15 3 實(shí)驗(yàn)部分 . 16 4 金絲桃素浸膏的檢測(cè) . 17 5 結(jié)果 . 19 6 討論 . 19 第三章 金絲桃素的化學(xué)合成 . 22 1 材料 . 22 2 合成路線設(shè)計(jì) . 22 3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 . 23 4 結(jié)果 . 30 5 討論 . 30 第四章 金絲桃素的含量測(cè)定 . 38 1 材料 . 38 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 . 38 3 結(jié)果 . 41 4 討論 . 43 第五章 結(jié) 論 . 44 1 金絲桃素化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)結(jié)論 . 44 2 貫葉連翹提取金絲桃素實(shí)驗(yàn)結(jié)論 . 44 3 金絲桃素含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)論 . 44 參考文獻(xiàn) . 45 致謝 . 50 作者簡(jiǎn)歷 . 51 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 研究的目的 和意義 貫葉連翹（ ）是藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，又稱貫葉金絲桃、千層塔、小過(guò)路黃、小對(duì)月草、上天梯等。原產(chǎn)于歐亞大陸，生于山坡、草叢、田埂、路邊。藥用已有 2400 余年的歷史。貫葉連翹味：苦、辛，性：平，全草入藥，作為傳統(tǒng)的中藥，它具有清熱解毒，收斂止血，利濕等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)其具有收縮血管、升高血壓、利膽、抗菌、驅(qū)蟲(chóng)等作用，常用于抗菌消炎，治療黃疸、尿路感染等，國(guó)外常用于多種疾病，如抑郁癥、刀傷、腫瘤等，我國(guó)民間常將其全草鮮品搗爛或干品研末敷患處。貫葉 連翹是美國(guó)草藥藥典（ 已收入的有限幾種草藥之一，它作為食品添加劑已被廣泛的使用，其提取物在美國(guó)市場(chǎng)份額的排名由 1996 年的 20 位之外到 1997 年的第 5、 1998 年的第 2；德國(guó)用它作抗抑郁癥藥已有 100多年的歷史，其浸膏制劑已占領(lǐng)德國(guó)抗中、輕度抑郁癥藥物市場(chǎng)的將近 50%。金絲桃素（ 為貫葉連翹中最具有生物活性的物質(zhì)，近年來(lái)的研究表明，金絲桃素具有抗抑郁、抗菌消炎、抗腫瘤、抗 毒等藥理活性。此外金絲桃素還是一種有效的光敏劑，在光動(dòng)力學(xué)治療中表現(xiàn)出強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活 性 (， 2002； M, 2000)。在德國(guó)，金絲桃素已與蛋白結(jié)合，用于治療艾滋病及甲乙型肝炎 (潘映紅等 ,1993) 。由于金絲桃素具有的多種藥理作用，使其成為當(dāng)前國(guó)際研究開(kāi)發(fā)繼人參、銀杏葉、紅豆杉之后的熱點(diǎn)之一，具有重大的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。 目前全世界需要金絲桃素提取物 5 萬(wàn)噸以上，而現(xiàn)在僅能提供 2 萬(wàn)噸，其中我國(guó)占 60%，我國(guó)雖盛產(chǎn)貫葉連翹，但資料顯示金絲桃素在貫葉連翹全草中的含量?jī)H有萬(wàn)分之幾，因此只有通過(guò)化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行提取和精制，才能達(dá)到國(guó)際市場(chǎng)對(duì)貫葉連翹提取物中金絲桃 要求。國(guó)內(nèi)有關(guān)金絲桃素的提取工藝研究進(jìn)行的較晚，直到上世紀(jì) 90 年代末才有報(bào)道。到目前為止，現(xiàn)行的生產(chǎn)工藝大部分還停留在金絲桃素的提取工藝上，對(duì)其分離、純化的方法研究的較少。而且尚存在產(chǎn)品易發(fā)粘、易吸濕、含量較低等缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)現(xiàn)行金絲桃素的提取工藝進(jìn)行研究基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，探索出一條較為理想的的分離、純化工藝，為新藥研究、開(kāi)發(fā)指明了方向。 貫葉連翹的活性成分金絲桃素在花葉等器官中含量最高 ,因而多在花期大量采收 ,致使開(kāi)花結(jié)果中斷 ,個(gè)體繁殖受阻，種群數(shù)量劇減，導(dǎo)致資源嚴(yán)重枯竭。鑒于金絲 桃素類的重要藥用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景 ,憑借單一的提取、分離工藝遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，達(dá)到實(shí)現(xiàn)金絲桃素中試及產(chǎn)業(yè)化的目標(biāo)有一定的困難，因此在不提高生產(chǎn)成本的前提下，我們考慮從化學(xué)合成的角度來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的，對(duì)實(shí)現(xiàn)金絲桃素中試及產(chǎn)業(yè)化的目標(biāo)有一定的現(xiàn)實(shí)意義。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 2 貫葉連翹的研究進(jìn)展 葉連翹的形態(tài)和分布 貫葉連翹（ .）在西方國(guó)家又名圣約翰草（ s ,為滕黃科金絲桃屬 (.)植物貫葉連翹的全草（張群豪，等， 2002） , 這種野生 植物的全草或帶根全草有藥用價(jià)值。 貫葉連翹為多年生草本植物，株高 20 100直立 ,多分枝 ,莖或柄兩側(cè)有凸起縱脈一條 較密 ,無(wú)柄 ,橢圓形至條形 ,長(zhǎng) 1 2 部抱莖 ,全緣 ,葉面滿布透明腺點(diǎn)。花較大 ,黃色 ,成聚傘花序 ,萼片 5,分開(kāi) ,長(zhǎng) 圓形或披針形 ,邊緣疏布黑色腺點(diǎn) ,花瓣 5,分開(kāi) ,長(zhǎng) 花瓣較萼片長(zhǎng) ,花瓣邊緣及花藥上都有黑色腺點(diǎn)。雄蕊多數(shù) ,子房 1室 ,花柱三裂 長(zhǎng)約 5約 3子黑褐色 ,圓柱形，長(zhǎng)約 1縱 棱，表面有細(xì)蜂窩紋?；ㄆ?6 7月，果期 9 10月（沈兆邦，等， 2000） 。 商品干燥藥材主要是植物頂部開(kāi)花的部分，包括葉、未開(kāi)的芽以及花。葉為橢圓形至長(zhǎng)方形，小而對(duì)生，無(wú)葉柄，綠色至灰綠色，無(wú)毛，全緣?；ò隇辄S色至黃 棕色。干藥材中有完整的花序或碎片。在 10倍放大鏡下觀察，可見(jiàn)葉和花具有許多特征的腺孔，直徑 陽(yáng)光下，葉腺透明，花瓣邊緣的腺點(diǎn)為黑色。莖呈灰綠色，圓筒形，空心，有區(qū)別于本屬其他種的特征性的不明顯的長(zhǎng)而對(duì)生的脊。粉末呈綠色到黃棕色，若花和未開(kāi)的芽的量較多，則黃色更為明顯。氣味微 甜、有類似香脂的芳香氣味。味道微甜，類似樹(shù)脂且略帶澀味（劉一兵， 1998）。 該屬全世界約有 400余種，廣泛分布于歐洲 (冰島除外 )、小亞細(xì)亞、俄國(guó)、印度、北非、美洲、澳大利亞、北美（除在加拿大的最北端地區(qū)和美國(guó)的最南端地區(qū)無(wú)貫葉連翹生長(zhǎng)外 ,其他各地均有其生長(zhǎng)）。我國(guó)有 55種， 8個(gè)亞種，主要分布于四川、陜西、河北、山東、江西、江蘇、湖北等地。 葉連翹的栽培、采集、加工及貯存 葉連翹的栽培 由于貫葉連翹和金絲桃素的多種藥理作用，使其成為當(dāng)前國(guó)際研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。近年來(lái)，由于世界范圍內(nèi)對(duì)貫葉連翹大規(guī)模的開(kāi)發(fā)利用 ，使貫葉連翹野生資源幾近枯竭，傳統(tǒng)的栽培技術(shù)己中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 不能滿足市場(chǎng)需求，因此栽培技術(shù)的革新迫在眉睫。有關(guān)研究表明，貫葉連翹對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，喜溫暖氣候，以濕潤(rùn)肥沃的沙壤土或夾沙土為佳。為防止鉛和工業(yè)污物粉塵等，應(yīng)選擇遠(yuǎn)離公路及城市工業(yè)區(qū)的地塊。要按照中藥材生產(chǎn)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)栽培。要求在前一年秋深翻地，并結(jié)合地塊肥力拌入農(nóng)家肥，盡量少施化肥。在病蟲(chóng)草害防治上應(yīng)盡最大程度降低農(nóng)藥殘留和重金屬含量，以生物防治為主，結(jié)合化學(xué)防治，去除雜草和害蟲(chóng)，達(dá)到提高藥材品質(zhì)，滿足制藥企業(yè)及醫(yī)療保健事業(yè)的需求（劉繼永，等， 2001） 。 葉連翹的采集 貫葉連翹的主要有效成分金絲桃素的含量與其貫葉連翹品種、采收方式、濕度、緯度、以及植物的不同部位關(guān)系密切，如澳大利亞的某一窄葉品種葉中含金絲桃素為 而同一地區(qū)的寬葉品種葉中含金絲桃素僅為 0. 037% 0. 058%，相差 3 倍。同一品種不同部位金絲桃素含量差異也很大，如同一寬葉品種，不同部位金絲桃素的含量分別為主莖含 側(cè)枝含 底部葉含 頂部葉含 葉芽含 而花含 所以應(yīng)選擇金絲桃素含 量高的品種進(jìn)行栽培，在盛花期進(jìn)行采收，植物頂部開(kāi)花的部位收割包括花、上部莖、葉和側(cè)枝 (大約是頂部 10 30位 )。若連主莖及下部葉全部采集，則主成分相對(duì)含量將明顯下降，其提取物主成分含量則達(dá)不到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于其主成分光敏性強(qiáng)，能使眼瞼和前額發(fā)泡，所以采收時(shí)必須十分小心，最好戴手套，避免眼和外露的皮膚與植物接觸（ et 1991）。 葉連翹的加工貯存 由于貫葉連翹中主要有效成分萘駢二蒽酮和間苯三酚化合物對(duì)光和熱均不穩(wěn)定， 14天內(nèi)即降解。因此采收后應(yīng)盡量避光并力求迅速干 燥。干燥方法以微波干燥為好，能最大限度地保存金絲桃素和偽金絲桃素（ ,et 1994），先以液氮處理，然后再冷凍干燥，黃酮類化合物和原花青素的含量明顯提高。在 70下干燥 10h，也有利于各種成分保存 ;最好在開(kāi)花起始期(6月 8月 )采收，將植物打成捆， 然后干燥。在天氣溫和條件下，可將植物鋪在平板上干燥，在冷濕氣候，則可吹以 30 40熱風(fēng)，在通風(fēng)處盡快陰干也是可取的土辦法。切不可在陽(yáng)光下曝曬， 如在日曬下干燥將導(dǎo)致 80%的金絲桃素因氧化而損失。干燥的提取物在 20下可穩(wěn)定貯存 1年以上 ，如在 60貯存 6周，金絲桃素含量就要迅速下降。所以新鮮植物必須在采集之后立即加工，在運(yùn)輸中可加冷凍劑或置于冷凍箱中，必須包裝嚴(yán)實(shí)，使之保持干燥，防止光照和氧化，冷凍劑不能接觸藥材，以防藥材污染。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 葉連翹的化學(xué)成分 貫葉連翹含有許多有效成分，包括苯甲基二蒽酮（如金絲桃素 其衍生物、偽金絲桃素 間苯三酚衍生物（貫葉金絲桃 貫葉金絲桃花青素 鞣質(zhì) 及黃酮類如蘆丁、 橡黃素、槲皮苷、和雙芹菜甙元 ,此外，還含有一些揮發(fā)油、膽堿類、氨基酸和維生素等物質(zhì) (985； Ha et 1993； 1989)。一般認(rèn)為 s 貫葉金絲桃素（ 因此許多廠商均以此兩種成分為展品標(biāo)準(zhǔn)化的監(jiān)控指標(biāo)，進(jìn)行原料篩選和產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控。其中金絲桃素 (從貫葉連翹中提取的具最有生物活性的一種萘駢二蒽酮類化合物，首先作為抗菌活性物質(zhì)由俄國(guó) 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并命名，并在 1975年測(cè)定其化學(xué)結(jié)構(gòu)（白潔，等， 2004）。 葉連翹的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及管理情況 美國(guó)草藥藥典 (定 “ 貫葉連翹 ” 由新鮮或干燥的整株植物或植物的某一部位組成，含金絲桃素 (萘駢二蒽酮化合物按金絲桃素計(jì) ) 不低于 異物不高于 2%，總灰分 5%，酸不溶灰分不高于 水分不高于 12%，干燥失重不高于 10% (1000g 草藥于100 105 干燥 2h)，鮮花水分不高于 干花水分不高于 6%，貫葉連翹提取物中 金絲桃素含量 文獻(xiàn)（ 劉兵 .， 1998）報(bào)道德國(guó)：（德國(guó)藥物法規(guī)） 1986 年規(guī)定貫葉金絲桃（藥材）按金絲桃素 計(jì)算含金絲桃素類化合物不得少于 并規(guī)定適用于植物神經(jīng)紊亂、抑郁、 恐慌、神經(jīng)性焦慮、肌肉疼痛和級(jí)燒傷。 德國(guó)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)金絲桃浸膏制劑 (含總金絲桃素 )， 用于治輕、中度抑郁癥。 法國(guó) :批準(zhǔn)外用于蕁麻疹、皸裂、挫傷、凍傷、蟲(chóng)咬傷、口腔和咽喉疼痛。 英國(guó) :草藥藥典規(guī)定 (貫葉金絲桃 )作鎮(zhèn)靜和收斂用 ； 外用止痛、防腐抗菌 ； 適用于絕經(jīng)后神經(jīng)官能癥、興奮、神經(jīng)痛、纖維組織炎、坐骨神經(jīng)痛。 歐洲議會(huì) ：認(rèn)為 將貫葉金絲桃作為天然香料原料，規(guī)定在食品制品中金絲桃素含量不得超過(guò)0. 1mg/ 美國(guó) :將貫葉金絲桃作為食品補(bǔ)充劑管理， 1994 年美國(guó)聯(lián)邦注冊(cè)辦公室批準(zhǔn)其作為飲料中的天然芳香劑，但其中必須不含金絲桃素。貫葉金絲桃是美國(guó)藥典委員會(huì)推薦的 一種植物藥， 1998 年 中載有貫葉金絲桃原料的 別、包裝、貯存條件。說(shuō)明書(shū) (包括拉丁名 )微生物限制、總灰分、有機(jī)異物、水分、農(nóng)藥殘留量等的規(guī) 定。 加拿大 : 1996 年加拿大非處方藥管理局在 國(guó)家對(duì)活性組分的政策 中批準(zhǔn)貫葉金絲桃的傳統(tǒng)適應(yīng)癥為鎮(zhèn)靜，健神經(jīng)劑、利尿及胃腸不適時(shí)抗痙攣，外用作為治傷痛藥、皺縮以及緩解痔瘡。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 葉連翹的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀及前景 葉連翹的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀 我國(guó)貫葉連翹地理分布廣 ,資源豐富， 臨床應(yīng)用歷史悠久。但 目前在資源開(kāi)發(fā)利用以及藥材收購(gòu)、生藥使用等方面存在著許多的問(wèn)題。例如在采集、收購(gòu)、加工等過(guò)程中混入多種偽品，其中最常見(jiàn)的混偽品是同科同屬的趕山鞭 (在形態(tài)上與貫葉連翹極為相 似。此外貫葉連翹大都在花期進(jìn)行采收，由于采收的盲目性，造成了嚴(yán)重的資源枯竭等問(wèn)題， 極大地限制了我國(guó)貫葉連翹的開(kāi)發(fā)利用及其產(chǎn)品的臨床應(yīng)用。 葉連翹的發(fā)展前景 醫(yī)藥行業(yè)中的發(fā)展前景 隨著現(xiàn)代社會(huì)人們生活緊張，生活節(jié)奏加快，工作壓力加大，抑郁癥是三大精神病之一，且有上升趨勢(shì)，已成為現(xiàn)代社會(huì)的常見(jiàn)病，因此尋找適宜的治療藥物對(duì)改善生活質(zhì)量有著重要的意義。在中醫(yī)藥領(lǐng)域科技發(fā)展“十五”計(jì)劃中，“抑郁癥”的研究已作為重大科技問(wèn)題的內(nèi)容之一，要求“加強(qiáng)證侯演變規(guī)律的流行病學(xué)研究，尋找調(diào)節(jié)生理機(jī)能和心理狀態(tài)的有效方法和系列 藥物”。 貫葉連翹經(jīng)過(guò)幾個(gè)世紀(jì)的應(yīng)用和大量的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它的安全有效性，引起了醫(yī)藥界的重視，對(duì)它的需求量與日俱增。從歐洲應(yīng)用情況看，既有抗抑郁制劑又有外用制劑，用量都很大，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界患者達(dá) 藥量極大。由此可見(jiàn)，未開(kāi)發(fā)的國(guó)內(nèi)及全球市場(chǎng)潛力巨大，值得深入研究并推上市場(chǎng)。并且，艾滋病在世界泛濫，而治療方法和藥物卻不多，美國(guó)曾研制出少量藥物，卻又壟斷專利。我國(guó)研究者可在這一方面深入研究，利用金絲桃素可抑制人免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性的特性，開(kāi)發(fā)研制抗艾滋病新藥，為人類造福。 基于金絲桃素在 抗病毒、抗腫瘤、治療抑郁癥、增強(qiáng)免疫等功能，使貫葉連翹在藥用上具有非常廣闊的開(kāi)發(fā)前景。 畜牧行業(yè)中的發(fā)展前景 國(guó)外有報(bào)道金絲桃素作疫苗增強(qiáng)劑致免疫性 (注 :金絲桃素、原金絲桃素與病原體、微生物與之接觸而滅活，更為可貴的是逆轉(zhuǎn)錄病毒與之接觸而得以保護(hù)、增強(qiáng)其致免疫作用，在生產(chǎn)疫苗中有益 )（ et 1992 )。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，畜牧生產(chǎn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有很大的比重。因此，將金絲桃素的新制劑應(yīng)用在動(dòng)物病毒性疾病的防治方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景，亦能帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 6 3 金 絲桃素的研究進(jìn)展 金絲桃素是從貫葉連翹中提取的主要活性成份之一 ,它除臨床上用于抗抑郁、抑制中樞神經(jīng)外 ,還是一種有前途的內(nèi)源性光敏劑 ,可用于腫瘤的光化學(xué)診斷與治療 ,具有顯著的抗 此成為人們的研究熱點(diǎn)之一。 絲桃素的提取與分離 國(guó)外有關(guān)金絲桃素的提取方法的研究是在 80 年代開(kāi)始進(jìn)行的，國(guó)內(nèi)對(duì)貫葉連翹的研究主要集中在金絲桃素的藥理方面，而對(duì)金絲桃素提取分離方法的研究進(jìn)行的較晚，直到上世紀(jì) 90 年代末才有報(bào)道。目前，國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的方法大部分停留在金絲桃素的提取方法上，而對(duì)其分離、純化的方法研究的較 少。主要采取以下幾種方法： 提取法 在醇提法中，用乙醇作溶劑從貫葉連翹中提取金絲桃素是一種比較常用的方法。李俊等 （ 1998）等通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用乙醇法提取貫葉連翹中的金絲桃素時(shí)，提取溶劑濃度和提取溫度對(duì)貫葉連翹提取物的提取率和提取物中金絲桃素的含量影響顯著 。 結(jié)果表明， 溶劑以 80%乙醇、溫度以 80為宜，提取時(shí)間最佳為 2h，這樣的條件下提取率最高。該方法具有溶劑價(jià)格便宜，易于回收，工藝簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境造成的污染小的優(yōu)點(diǎn)，但是所得提取物具有易吸濕，易發(fā)粘和其中金絲桃素的含量常因原料貫葉連翹中金絲桃素的含量變 化而發(fā)生波動(dòng)的缺點(diǎn)。因此需要對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，溫普紅等對(duì)金絲桃素的醇法提取工藝進(jìn)行了研究和改進(jìn)。研制出了價(jià)廉、無(wú)毒、新型的除雜劑。由于該除雜劑的使用，使導(dǎo)致吸濕發(fā)粘的雜質(zhì)如糖類、葉綠素等較徹底地除去，使生產(chǎn)工序大為簡(jiǎn)化，只需經(jīng)過(guò)提取 、 除雜、調(diào) 可得到所需產(chǎn)品，且所得產(chǎn)品在空氣中長(zhǎng)期暴露仍保持粉末狀不會(huì)發(fā)粘結(jié)塊， 而且提高了金絲桃素的相對(duì)含量 (含量為 ，大大超過(guò)了國(guó)際市場(chǎng)對(duì)金絲桃素含量 要求，消除了原料中金絲桃素含量高低對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，但該實(shí)驗(yàn)中僅以金絲桃素含量為指標(biāo)，沒(méi)有 收率的相關(guān)指標(biāo)，并且尚未報(bào)道除雜劑的組成成分和比例。該實(shí)驗(yàn)在調(diào) 現(xiàn) (1) 越低，產(chǎn)品析出的速度越快，但產(chǎn)品中金絲桃素的含量相對(duì)降低。 (2)金絲桃素的析出酸度比黃酮類等其他物質(zhì)的析出酸度低，析出速度也比其它物質(zhì)快。因此，通過(guò)控制溶液的 以調(diào)節(jié)產(chǎn)品中金絲桃素的含量。但此方法析出金絲桃素時(shí)，在酸化的提取液中將會(huì)殘留一定量的金絲桃素，造成金絲桃素的析出不完全，由于金絲桃素在貫葉連翹中含量極低，提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)盡量減少提純過(guò)程中的流失。溫普紅等（ 2002）分別用甲醇乙醇作提取 劑，進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明 ： 用乙醇作提取劑時(shí)，所得產(chǎn)品中金絲桃素的含量較高 ;但提取溫度比甲醇時(shí)高，同時(shí)乙醇的價(jià)格也較甲醇貴。但綜合考慮到甲醇的毒性較強(qiáng)，選用乙醇作提取劑較為適宜。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 7 液提取法 堿液提取法是近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種提取方法，李俊等 (1999)通過(guò)多次實(shí)驗(yàn) ,確定最佳工藝為 :稱取一定量干燥粉碎的貫葉連翹全草 ,用 30 倍原料重的 1%液在 95 100沸騰狀態(tài)下浸提 12 ,提取 3次 ,集中濾液 ,用 ,真空濃縮干燥即得產(chǎn)品。此工藝的原料重量比、溫度、提取時(shí) 間、溶劑濃度是通過(guò)多次正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得出的 ,在此條件下 ,提取物中金絲桃素含量最高 ,為大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論依據(jù)， 談曾毅等 (2002)通過(guò)采用堿溶液對(duì)貫葉連翹藥材保溫發(fā)酵，然后用甲醇 丙酮提取，做出的干浸膏中金絲桃素的含量與浸膏對(duì)照品基本一致，含量約為 ，收率為 同時(shí)采用多種溶劑提取，或加水后潤(rùn)濕提取，或加堿液提取，均不能使金絲桃素的含量達(dá)到滿意的結(jié)果，只有加氫氧化納堿溶液保溫發(fā)酵后，方能達(dá)到最佳的效果。李翠芹等提取分離金絲桃素的方法是以金絲桃素含量和干品得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法研究了從貫葉連翹 中提取金絲桃素的工藝，經(jīng)過(guò)綜合考慮各種因素，結(jié)果表明較佳的提取工藝為 : 75%甲醇， 78 提取 5 次，每次 媒量 5 倍，濃縮和干燥溫度 78 。 絲桃素的含量測(cè)定方法 效液相色譜法（ 目前 高效液相色譜法（ 借其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用于含量測(cè)定，近幾年 測(cè)定貫葉連翹中金絲桃素的含量使用最多的是高效液相色譜法 (（李翠芹，等， 2001； 毛紅勝 ,等， 2001；王文輝， 1999,等等）。由于實(shí)驗(yàn)條件不同，各自采用的流動(dòng)相也不盡相同。通 過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn) ,貫葉連翹中花、葉內(nèi)金絲桃素含量大于根、莖中的含量 ,尤其花中金絲桃素含量最高，且不同地區(qū)的金絲桃素含量也不盡相同。 外可見(jiàn)光譜測(cè)試法 (該法是利 用波長(zhǎng) (波數(shù) )和吸光度描繪物質(zhì)在紫外或可見(jiàn)區(qū)域所得的吸收曲線。 通過(guò) 研究物質(zhì)分子對(duì)紫外和可見(jiàn)區(qū)波長(zhǎng) (200700光的相互作用，利用吸收譜帶的波長(zhǎng)位置的吸光度進(jìn)行試樣的定性、定量分析方法。 采用紫外可見(jiàn)光譜測(cè)試 ,金絲桃素在 589有最大吸收為其特征鋒 ,以濃度為橫坐標(biāo) ,吸光度 (A)為縱坐標(biāo) ,繪制金絲桃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為 Y=鍵，等，2000）。數(shù)據(jù)顯示該方法精密度較好 ,回收率高 ,供試品溶液較為穩(wěn)定 ,可作為金絲桃素的檢測(cè)方法之一。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 8 層色譜法 (薄層色譜法 (,et 000)測(cè)定貫葉連翹中金絲桃素的含量 ,用水、甲醇、乙醇作溶劑 ,檢測(cè)波長(zhǎng)為 254。由于 薄層色譜法易受試驗(yàn)環(huán)境等多種因素的影響，方法重現(xiàn)性差， 所以較少用。 示脈沖極譜法 (差示脈沖極譜法 ,溶劑選用磷酸鹽緩沖溶液 在 出現(xiàn)波峰（ et 000）。此法雖準(zhǔn)確、快捷，但儀器昂貴，所以使用較少。 波長(zhǎng)分光光度法 (以測(cè)定波長(zhǎng)為 589比波長(zhǎng)為 647行組合 ,甲醇為空白溶液。以金絲桃素對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo) , 47 589 為縱坐標(biāo)制得金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為 47589=r=利賓 ,等， 2001）。該方法簡(jiǎn)單易行 ,結(jié)果較為準(zhǔn)確 ,可排除大部分干擾測(cè)定 ,克服目前應(yīng)用單波 長(zhǎng)分光光度法抗干擾能力差的缺點(diǎn)。不足之處由于二階導(dǎo)數(shù)光譜處理后 ,所需信息量大大減少 ,使測(cè)定相對(duì)誤差增大。 效液相色譜 熒光檢測(cè)法 (色譜條件：色譜柱 : m， 200流動(dòng)相 :甲醇 55 45),流速： 溫： 30，熒光檢測(cè)波長(zhǎng)： 80 00方法的線性范圍為 102歸方程為 Y=1953X+俊 ,2001）。 方法快速 ,簡(jiǎn)單 ,靈敏度高。由于金絲桃素為強(qiáng)酸性。 熒光強(qiáng)度有較大影響 ,測(cè)定時(shí)宜選取 此時(shí)靈敏度高 ,峰型好。 王峰等（ 2000）報(bào)道了 貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素和金絲桃苦的含量。本方法有良好的重現(xiàn)性及 精密度。 以上方法不僅可以測(cè)定貫葉連翹植物中的金絲桃素含量 ,還可檢測(cè)貫葉連翹片劑中金絲桃素含量。 絲桃素的化學(xué)合成 絲桃素的理化性質(zhì) 1891 年 離到金絲桃素， 1911 年 名為“ 1951 年 確定其化中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 9 學(xué)式為 4， 4 ， 5， 5 ， 7， 7一六羥基 2， 2一二甲基一中位一萘駢二蒽酮， 分子式為 子量為 構(gòu)式如圖 1絲桃素是一種藍(lán)黑色針狀結(jié)晶體，易溶于吡啶、甲醇、乙醇、乙酸乙酯 等有機(jī)溶劑和堿水溶液中，加熱易分解，沒(méi)有固定的熔點(diǎn)，對(duì)光敏感，需避光保存。 圖 1of 化學(xué)合成 由于金絲桃素具有抗抑郁、抗菌消炎、抗 毒等藥理活性，因此對(duì)其的 需求量與日俱增。我國(guó)雖然盛產(chǎn)貫葉連翹，但是由于金絲桃素在貫葉連翹全草中的含量?jī)H有萬(wàn)分之幾，即使通過(guò)改善提取工藝，提取分離出來(lái)的金絲桃素產(chǎn)量仍然較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)對(duì)金絲桃素的需求，實(shí)現(xiàn)金絲桃素產(chǎn)業(yè)化的目標(biāo)有一定的困難，這樣極大地限制了金絲桃素產(chǎn)品的臨床應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)貫葉連翹資源的可持續(xù)發(fā)展，擴(kuò)大金絲桃素的藥物來(lái)源，以利于實(shí)現(xiàn)金絲桃素的產(chǎn)業(yè)化，因此，可通過(guò)化學(xué)合成的方法實(shí)現(xiàn)這一目的。目前，國(guó)外已有許多關(guān)于金絲桃素化學(xué)合成路線的報(bào)道，其一是以 3、 51957），整個(gè)合成路線需要十二步，而產(chǎn)率僅為 6 9；其二是以大黃素作為起始原料（ 1958），大黃素被直接轉(zhuǎn)化成原金絲桃素，然后在可見(jiàn)光的照射下，再轉(zhuǎn)化成金絲桃素，但第一次轉(zhuǎn)化存在大黃素產(chǎn)率較低等問(wèn)題。合成路線如下 : 上述合成路線均存在較大缺陷，因此迫切需要一條經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便、合理