密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 型禽流感病毒血凝素蛋白抗原性差異的研究 of 5 of 5 I 摘 要 高致病力 型禽流感的暴發(fā)不僅給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大打擊，而且給人類健康帶來嚴重威脅，對于該病的防制具有重要的公共衛(wèi)生學意義。疫苗免疫接種是防制高致病性 型禽流感的重要手段，但禽流感病毒像所有的 毒一樣在傳播過程中非常容易發(fā)生變異，使疫苗株與感染的病毒之間抗原差 異較大 而 不能有效保護家禽 。 已知 禽流感病毒的毒力和抗原性與其 白有密切關系，因此要控制禽流感首先要 對 毒株之間 原性的差異 進行研究 。 為此 ， 本研究選用了 4 個不同年代、不同分離地點的毒株 （ 株 是 04 年分離于廣東地區(qū)、株 是 96 年分離于廣東地區(qū)、 株 是 04 年分離于東北地區(qū)、 株 是 05 年分離于東北地區(qū)） ， 首先經(jīng) 增了 4 株 型禽流感病毒的血凝素基因（ 將其克隆到 狀病毒轉(zhuǎn)座載體上，經(jīng)酶切鑒定及測序篩選出陽性重組載體，將其轉(zhuǎn)化受態(tài)細 胞與桿狀病毒穿梭載體（ 行轉(zhuǎn)座，通過藍白斑篩選和 定獲得重組桿狀病毒穿梭載體（ 脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染 蟲細胞。通過蛋白質(zhì)電泳、 免疫印跡法 、血凝試驗和血凝抑制試驗分析表明：分子量約 63組血凝素蛋白在 蟲細胞中實現(xiàn)了高效表達，具有良好的血凝活性；而且其血凝活性能夠被 流感病毒高免血清所抑制，說明表達的重組蛋白具有與天然蛋白相似的生物活性 。 然后將 所表達 4 種 白定量 ，用佐劑乳化后制成禽流感基因工程亞單位疫苗 分別免疫 1組 3 周齡 。并在免疫后 1和攻毒后 3 周分別翅靜脈采血 并 分離血清，將采集的血清分別用 型禽流感病毒的 不同毒株 作為抗原進行交叉血凝抑制反應（ 中和試驗 ， 來檢測抗體與不同毒株之間的交叉血凝抑制價和中和病毒的能力 ， 并用 A/4 毒株 作攻毒保護試驗以 對這 4 株 禽流感病毒的 白 進行比較，從免疫水平上了解血凝素基因的差異；實驗結(jié)果顯示各組 對強毒株的攻毒保護、排毒情況及對不同 分離株的 血凝抑制價有顯著差別， 白免疫組對 4 個毒株的血凝抑制價最低 普遍在臨界保護值以下 ， 并且 對 株的攻擊不能 100%保護并有嚴重的排毒現(xiàn)象。 白免疫組對 株的攻擊能夠全保護，但也有一定量的排毒。 只有 白免疫組對同源病毒的攻擊產(chǎn)生非常好的保護力也沒有排毒現(xiàn)象 ， 而且對 4 種不同抗原都有較高的血凝抑制效價； 從 結(jié)果中 可以看出 96 年分離的 株與 04/05 年分離的幾個毒株抗原性差異很大。 株的抗原性與 株也不相同，雖然能夠有效保護但也會排毒。 關鍵詞 : 禽流感，血凝素基因，桿狀病毒表達， 抗原性， 5N1 of in to in 5N1 a to to be a IV as a is to It is IV is to So we of in to I. In we .7 kb 5N1 by . by CR of NA in of 2h A be 5N1 On of in 5N1 we A It PF we to do t ; we A of l PF GD I t be CC C be A t I A of 64/05 t be by D FY C、 YC FY is FY 略 語 全 稱 對 照 解 釋 AI 流感 流感病毒 芐青霉素抗性 補 二胺四乙酸 HA 凝素 HI 凝抑制 致病性禽流感病毒 丙基 道爾頓 LB 致病性禽流感病毒 OD 密度 丙烯酰胺凝膠電泳 酸鹽緩沖液 合酶鏈式反應 pH of 堿值 糖核酸酶 二烷基磺酸鈉 特定病原 （羥甲基）氨基甲烷 43 錄 第一章 緒 論 . 1 感病毒的分子生物學 . 2 毒的結(jié)構(gòu)與編碼蛋白的功能 . 2 感病毒的復制 . 6 感病毒的遺傳與變異 . 7 致病性禽 流感的流行現(xiàn)狀、危害及其公共衛(wèi)生學意義 . 8 5 亞型高致病性禽流感的流行與危害 . 8 5 亞型高致病性禽流感病毒的公共衛(wèi)生學意義 . 9 流感疫苗研究進展 . 11 病毒滅活苗 . 11 因重組活載體疫苗 . 11 酸疫苗 . 12 單位疫苗 . 13 研究的目的和意義 . 13 第二章 材料與方法 . 15 驗材料 . 15 株和細胞 . 15 種和載體 . 15 驗動物 . 15 他材料 . 15 要試劑 . 15 要儀器 . 15 驗方法 . 16 個 因序列的測定及比較分析 . 16 A 基因克隆以及桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 . 17 組桿狀病毒穿梭載體的 篩選及鑒定 . 18 A 蛋白的表達 . 19 組蛋白的檢測 . 20 苗的制備 . 21 體效價（ 測及抗原相關性分析 . 22 毒中和試驗 . 23 苗的免疫保護試驗 . 23 第三章 結(jié)果 . 24 種 因 的序列測定及比較分析 . 24 A 基因的 增 . 24 基酸序列的比較分析 . 24 組轉(zhuǎn) 移載體的構(gòu)建及鑒定 . 25 組穿梭載體的構(gòu)建及鑒定 . 26 V 染后細胞的形態(tài)學變化 . 26 達蛋白的分析及 鑒定 . 27 達蛋白的 析 . 27 達蛋白的 測結(jié)果 . 27 達蛋白的血凝試驗檢測結(jié)果 . 28 達蛋白的血凝抑制試驗檢測結(jié)果 . 28 苗的制備 . 28 蛋白的濃度測定 . 28 的蛋白的定量 . 29 白的乳化 . 30 疫后抗體消長情況 . 30 毒中和試驗 . 31 毒滴定 . 31 和試驗 . 31 苗的免疫保護情況 . 32 毒保護試驗 . 32 毒情況 . 32 毒量的滴定 . 33 第四章 討論 . 34 第五章 結(jié)論 . 37 參考文獻 . 38 致 謝 . 43 作者簡歷 . 44 附錄 . 45 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 1 第一章 緒 論 流感病毒屬于正粘病毒科，流感病毒屬，是具有囊膜，多形態(tài)的 毒。根據(jù)其內(nèi)部核蛋白（ 基質(zhì)蛋白（ M）抗原性的不同，可分為 A、 B、 C 三型。其中以 A 型流感病毒感染的范圍最廣，危害最大，常以流行的形式出現(xiàn)，它可以感染人、豬、馬、海洋哺乳動物以及各種鳥類（ et 1992），是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。本文中提及的流感病毒主要為 A 型流感病毒。 禽流感（ 由 A 型流感病毒所引起的禽類的感染和 /或疾病綜合征（ 爾尼克等 , 1991; 甘孟侯等 , 1995）。 在 1878 年首次在意大利報道該病，當時稱之為雞瘟 （ 1955）首次證明該病病原是 A 型流感病毒。 后傳入其他歐洲國家、南美、東南亞、美國及前蘇聯(lián)等國家和地區(qū)，現(xiàn)已幾乎遍布世界各地。 感染譜很廣，可引起大多數(shù)家禽、野禽及水禽的感染，其中以雞和火雞最為易感，水禽則為流感病毒的自然宿主。由于禽流感病毒（ 型眾多，抗原變異頻繁，不同血清型毒株間缺乏交叉保護性，在 現(xiàn)的 100 多年來，世界各地都有特定毒株引起 發(fā)和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。 1997 年在香港人群中發(fā)現(xiàn)了感染 病例，有 18 人直接感染了該病毒，其中 6 人死亡，該事件為全球 越種間屏障直接感染人并致人死亡的首次報道（ et 1998）。自 1997 年香港人感染禽流感事件以來，到目前為止（ 2007 年 5 月），據(jù)世界衛(wèi)生組織報道世界范圍內(nèi)共發(fā)生 307 例禽流感病毒直接感染人病例，其中 186 人死亡（ T et 2005）。 2004 年，泰國老虎、獵豹、貓也被首次證實感染 型禽流感病毒，越來越多的跡象表明禽流感病毒突破種間屏障感染哺乳動物的能力正在逐漸增強（ J et 2004; T et 2004）。因此 型禽流感病毒不僅可以對養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性的打擊，而且給人類健康帶來嚴重威脅。 由于 有重要的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生學意義，對該病的防治顯得尤為重要。目前，各國對禽流感的預防和控制采取了不同的措施，其中疫苗免疫是預防和控制 主要手段。但是流感 病毒像其它 毒一樣進化非常迅速，在流感病毒的 8 個基因片段中病毒囊膜表面的表面抗原血凝素（ 化最快； 宿主免疫系統(tǒng)主要的靶抗原，它能結(jié)合宿主唾液酸之類的細胞受體，使病毒附著于細胞上促進病毒核糖核蛋白復合體通過膜融合釋放出來并改變抗原性，以逃脫宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視激發(fā)病毒的感染（ E, et 1989），可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體起到免疫保護作用，因此目前存在的禽流感疫苗主要是針對 流感病毒抗原性的不穩(wěn)定性給該病的防制帶來了極大的困難，需要每年挑選出具有廣泛保護性的 毒株作為流感疫苗株。這就需要了解毒株之間抗原性的差異， 與其他表達系統(tǒng)相比桿狀病毒表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)能夠在外源基因表達后對其進行糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修飾，其表達產(chǎn)物的生物學特性與天然產(chǎn)物相似 (,et 1999)。因此 本實驗選用 4 個不同年代、不同分離地點的毒株用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達它們的 白來免疫 ，用其血清與 型的不同毒株做血凝抑制試驗。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 2 感病毒的分子生物學 毒的結(jié)構(gòu)與編碼蛋白的功能 流感病毒為多形性，有球形和長絲狀兩種形態(tài)。病毒粒 子一般呈球形，直徑為 80120均為 100 感病毒具有囊膜，在囊膜表面有許多放射狀排列的纖突，病毒粒子的中心有一直徑為 4060電子密度高的錐狀核心。 A 型流感病毒為單股、負鏈、分節(jié)段的 毒。流感病毒基因組共有 8 個節(jié)段，通過對某些 A 型流感病毒全基因組的序列測定和比較發(fā)現(xiàn)，在這些已測出的序列中可發(fā)現(xiàn)一些共同的特點： 8 個基因片段的 3末端和 5末端都有高度保守的相同核苷酸序列，所有片段 5末端的前 13個核苷酸都相同，序列為 3 ，所有片段的 3末端的 12 個核苷酸都相同，序列是 3在這些共有序列中，可反向互補，成一個鍋柄狀結(jié)構(gòu)。遺傳學和生化試驗證實 3和 5末端保守序列對于病毒轉(zhuǎn)錄和復制是至關重要的，鍋柄環(huán)狀結(jié)構(gòu)是病毒 合酶結(jié)合所必需的核苷酸識別位點（ u, et 1982）。 5和 3末端中除共同序列以外的其余序列對每個基因節(jié)段來說是特異的，但對于流感病毒的同一基因來說也是高度保守的。病毒基因組末端的非編碼區(qū)序列（包括共同的序列和基因特異的序列）包含了病毒 毒復制和裝配 所有的必需信號。當這些非編碼區(qū)位于一個外源流感病毒基因的兩側(cè)時，這種基因也能被復制、轉(zhuǎn)錄并裝配到流感病毒粒子中。在每個基因節(jié)段靠近 5末端的 1521 個核苷酸處有一個保守區(qū)，序列為 U），它是在病毒合成 產(chǎn)生 A）的信號。 流感病毒的基因組 8 個基因片段共編碼 10 種蛋白，根據(jù)其表達和存在位置的不同可劃分為三個組分，即表面蛋白、內(nèi)部蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。血凝素（ 神經(jīng)氨酸酶（ 離子通道表面蛋白，內(nèi)部蛋白包括三種聚合酶蛋白 由 因編碼的、新發(fā)現(xiàn)的 及核蛋白（ 基質(zhì)蛋白 1（ 非結(jié)構(gòu)蛋白 2（ 非結(jié)構(gòu)蛋白 1（ 量產(chǎn)生于感染細胞中，是唯一不包裝到病毒顆粒的蛋白（圖 1 圖 1 型流 感病毒結(jié)構(gòu)模式圖 he of 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 3 其中血凝素（ 神經(jīng)氨酸酶（ 2 種主要的糖蛋白，也是病毒表面抗原，根據(jù) 的不同， A 型流感病毒又可區(qū)分為不同亞型，如 前已鑒定 16 種 et 2005）和 9 種 型。 1) 聚合酶蛋白（ 流感病毒的聚合酶由三種成分組成，它們是 三種蛋白質(zhì)是病毒粒子中分子量最大的蛋白質(zhì)。 片段 1 編碼，長度為 2341 2320大約 759 個氨基酸殘基，其功能是在病毒 錄的起始階段，識別宿主 端的 型帽子結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合，同時還具有限制性內(nèi)切酶活性，參與切割宿主 子結(jié)構(gòu)作為合成病毒 引物。片段 2 編碼，長度為 2341 2320堿基，共含 757 個氨基酸殘基，主要負責病毒 成的啟動并使之逐漸延長，同時負責 合成和延伸。 由 閱讀框編碼的 87 殘基蛋白，在細胞的線粒體中大量存在，與流感病毒介導的細胞凋亡有關（ W et 2001）。人工突變干擾 表達，人單核細胞凋亡的程度要比暴露于 測是由于 壞細胞內(nèi)部的能量加工廠 線粒體，殺死免疫細胞（單核細胞），從而使機體無法對流感病毒感染作出反應并抵抗病毒攻擊。 發(fā)現(xiàn)無疑又給流感病毒感染及不同亞型在不同宿主表現(xiàn)的毒力差異提供又一種解釋方式或研究思路。 片段 3編碼， 度為 2233 2211堿基，由 716 個氨基酸殘基組成，在 錄和復制過程中，與 起隨鏈的延長而移動，主要參與 復制，推測其可能在 解旋酶的角色（ M et 2000）。這三種蛋白質(zhì)在氨基酸序列上有一共同點，即都含有一特異的親核序列區(qū)，其作用是使這幾種蛋白質(zhì)在胞漿合后能順利進入細胞核。聚合酶復合體在病毒粒子中所處的位置目前已經(jīng)清楚，三種蛋白質(zhì)位于病毒 末端，外被核蛋白，形成病毒核糖核蛋白復合體（ K et 1997）。 2) 血凝素（ 血凝素是構(gòu)成流感病毒囊膜纖突的主要成分之一，由 段 4 編碼， 段 4 長度為 17421778碼 562566 個氨基酸殘基的多肽鏈，大小約為 75糖蛋白。 為319326 個殘基， 為 221222 個殘基。 典型的 I 型糖蛋白，即羧基端在囊膜內(nèi)，氨基端在囊膜外。它含有 4 個結(jié)構(gòu)域：信號肽（前導序列）、胞漿域、跨膜域和胞外域，是流感病毒所有蛋白中最重要的一個，具有凝集多種動物紅細胞的性質(zhì) 。 主要功能是結(jié)合宿主唾液酸之類的細胞受體，使病毒附著于細胞上，幫助病毒穿透宿主的細胞膜并改變抗原性，以逃脫宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視（ 1998），是流感病毒抗原變異和病毒致病力的主要決定因素。宿主免疫系統(tǒng)主要的靶抗原，可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體，進而起到免疫保護作用，抵抗感染和疾病。 翻譯后的加工處理主要有 3 個過程：裂解酶的裂解、糖基化和脂肪酸的乙酰化。首先合到宿主細胞膜上脫掉信號肽成為 由細胞內(nèi)類似胰酶的裂解酶裂解成 者由二硫鍵連 接在一起， 裂解是病毒感染的先決條件，對病毒的感染性和毒力都很重要；然后 運送到高爾基復合體中，完成糖基化；最后在胞漿中完成脂肪酸的乙?；\送到細胞膜，嵌入胞膜的脂質(zhì)雙層，在病毒出芽釋放時被帶到病毒囊膜上。目前已經(jīng)知道血凝素的三級結(jié)構(gòu)是由三個 子聚合在一起形成的三聚體的頭莖結(jié)構(gòu)。頭部由 單中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 4 位組成，為受體結(jié)合位點（ 抗原決定簇；莖部由 部分 羧基端主要由疏水氨基酸組成，可錨定在病毒囊膜脂質(zhì)雙層中；氨基端多由 親水性氨基酸殘基構(gòu)成，可伸出脂質(zhì)雙層進入病毒粒子。 迄今為止，己經(jīng)發(fā)現(xiàn) 16 個 型的流感病毒，雖然它們在血清學上存在著明顯的差異，然而序列比較表明，其半胱氨酸殘基在所有亞型的序列中都很保守，表明它們來白一個共同的祖先，并且具有相似的結(jié)構(gòu)。氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，相同亞型的不同毒株之間 列同源性在 90%以上，不同亞型毒株同源在 2580%之問，其中 型 的差異最大，僅有 25%的同源性， 型間的同源性較高為 80%。對于 體而言，除 的受體結(jié)合位點高度保守外， 有很高的變異率。 3) 核蛋白（ 由片段 5 編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為 60一種單體的磷酸化多肽。在流感病毒的8 個基因中， 因最為保守。 有型特異性，根據(jù)其抗原性的不同，可將流感病毒分為 A、B、 C 三個型。 兩種形式，一種是可以移入核內(nèi)的磷酸化形式（ 另一種是留在細胞質(zhì)內(nèi)的非磷酸化的形式（ 核蛋白是一種多功能的蛋白質(zhì)，除了參與形成 合體、保護 受 用外，病毒復制過程中，對病毒基因組 細胞核內(nèi)外的運輸和蛋白的定位有著重 要作用（ B et 2000）。 是細胞毒性 T 淋巴細胞識別的主要抗原，至少具有 3 個獨立的抗原位點，但是抗 抗體不能給宿主提供免疫保護。 4) 神經(jīng)氨酸酶（ 由 段 6 編碼的表面糖蛋白，分子量為 200 糖蛋白，即氨基端在囊膜內(nèi)，羧基端在囊膜外，是病毒粒子表面的另一種重要的抗原。 一種糖苷外切酶，可以從糖苷鍵上除去唾液酸（ N乙酰神經(jīng)氨酸），因此 從病毒和感染的細胞上除去唾液酸殘基。這一功能對病毒粒子的釋放以及防 止病毒粒子聚集是很重要的（ et 987; et 998）。 與病毒的宿主特異性及病毒的毒力有關。 活性可被抗體和特異抑制物阻斷，從而限制病毒的復制，主要表現(xiàn)為 有吸附、融合、復制、裝配和出芽功能。 病毒粒子表面并不是隨機分布，而是呈不連續(xù)的斑片狀。 因在翻譯后不需要切割，不需除去信號肽，起始密碼子翻譯的 直存在，羧基端也不經(jīng)過加工。 一級結(jié)構(gòu)包括 4 個結(jié)構(gòu)域：氨基端胞漿尾、非極性跨膜區(qū)、莖部、頭部。其中， 氨基端胞 漿尾包括6 個氨基酸殘基 常保守，在所有的