密級(jí) 論文編號(hào) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 亞洲玉米螟性遺傳規(guī)律研究 碩士研究生：李光濤 指導(dǎo)教師：何康來(lái) 副研究員 申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士 專 業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治 研究方向：轉(zhuǎn)基因作物與害蟲治理 培養(yǎng)單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所 提交日期 2004年6月 A to in of i 2004 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確地說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 （保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議） 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 要 亞洲玉米螟我國(guó)轉(zhuǎn)面積種植轉(zhuǎn)單一基因的有實(shí)施合理的抗性治理對(duì)策，才能使這一現(xiàn)代化技術(shù)成果得以持久的利用。深入研究抗性種群的生物學(xué)和遺傳規(guī)律，是制定抗性治理計(jì)劃、實(shí)施合理的抗性治理措施的基礎(chǔ)。本論文從生物學(xué)和遺傳學(xué)的角度，首次就亞洲玉米螟對(duì)要結(jié)果如下： 通過飼料混合法以敏感種群相比，抗性種群的幼蟲發(fā)育歷期明顯延長(zhǎng)，平均蛹重明顯下降。用表達(dá)洲玉米螟初孵幼蟲不能在是能夠在花絲上完成幼蟲期并化蛹和繁殖后代，首次用轉(zhuǎn)基因作物離體生測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)了室內(nèi)汰選的亞洲玉米螟抗性種群可以在羽化期相同的條件下，抗、感種群雄蛾間交尾競(jìng)爭(zhēng)力沒有顯著差異，抗、感雌蛾對(duì)敏感雄蛾的競(jìng)爭(zhēng)力差異不顯著，但對(duì)抗性雄蛾的競(jìng)爭(zhēng)力，抗性雌蛾顯著強(qiáng)于敏感雌蛾。當(dāng)環(huán)境中抗性雄蛾的種群密度相對(duì)高時(shí)，發(fā)生抗性種群內(nèi)交尾的概率要高，將增加亞洲玉米螟對(duì)、感種群的交尾日活動(dòng)節(jié)律一致?？?、感種群非滯育老熟幼蟲的過冷卻點(diǎn)沒有顯著差異；而抗性種群滯育幼蟲的過冷卻點(diǎn)顯著高于敏感種群及。 用飼料混合法測(cè)定了亞洲玉米螟感種群及其正反交時(shí)測(cè)定了性基因顯性水平）表明目前亞洲玉米螟對(duì)殺蟲蛋白抗性種群和對(duì)照種群及其果表明其有效顯性為完全隱性遺傳（）。合高劑量加庇護(hù)所的要求。比較不同種群對(duì)說明亞洲玉米螟對(duì)普通飼料上連續(xù)飼養(yǎng)3代后，幼蟲發(fā)育歷期開始下降，6代以后基本上與敏感種群一致，而且蛹重也有不斷增加的趨勢(shì)。洲玉米螟對(duì)去選擇壓后，其抗性會(huì)迅速丟失。 關(guān)鍵詞：亞洲玉米螟，轉(zhuǎn)性，遺傳規(guī)律，生物學(xué) ( is by t Bt be CB t CB t is to of t of on of of We of a CB of of on t 10% of 0% on 00ng/g of 5 of to in a CB it by of on t on t it of t of on t in g (to of S/S/RR 3in RR, S/S/S, no in S/R, to In of be of if of 1no in of of 1of no 1of of to by 1in g, 06 of RSS 1Sof 8 on 1SRR of R S, to 1In of by on t t is ). on t 1be a to CB to t if by g g, 4.0 0.4 is a on t CB on of . of Bt 要 第一章 引言1 1. 1 2. 害蟲對(duì)2 抗性的生化機(jī)制2 抗性的遺傳基礎(chǔ)3 抗性的分子基礎(chǔ)4 3. 轉(zhuǎn)6 4. 害蟲對(duì)轉(zhuǎn)7 5. 害蟲對(duì)8 高劑量/避護(hù)所策略8 其他抗性治理策略10 6. 本項(xiàng)研究的意義10 第二章 抗性種群生物學(xué)研究12 1. 材料與方法13 實(shí)驗(yàn)材料13 實(shí)驗(yàn)方法13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析17 2. 結(jié)果與分析17 亞洲玉米螟17 20 抗性種群與敏感種群的交尾競(jìng)爭(zhēng)力23 抗性種群的抗寒能力24 3. 討論28 第三章 抗性遺傳規(guī)律研究31 材料與方法31 實(shí)驗(yàn)材料31 實(shí)驗(yàn)方法32 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析33 2. 結(jié)果與分析33 抗性水平及其遺傳方式33 38 抗性遺傳的穩(wěn)定性分析42 3. 討論42 第四章 結(jié)論45 參考文獻(xiàn) 47 致謝56 作者簡(jiǎn)歷57 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1第一章 引言 1. t (即蘇云金芽孢桿菌是一種好氧的，革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢土壤桿菌。1911年其生活史的生長(zhǎng)穩(wěn)定期能夠產(chǎn)生一種芽孢晶體，而這種芽孢晶體具有殺蟲活性（傳統(tǒng)上，種命名法的弊端在于其不能反映內(nèi)含蛋白的結(jié)構(gòu)與殺蟲活性專一的關(guān)系。依據(jù)其結(jié)構(gòu)、抗原特征、活性譜，將殺蟲蛋白及其基因分為四大類：翅目)，翅目及雙翅目)，翅目)，翅目）。每類中又進(jìn)一步分幾個(gè)型(自1983年第一次報(bào)道了一晶體蛋白基因的部分序列以來(lái)，已經(jīng)有100多種蛋白基因被測(cè)序。幾乎每一種殺蟲蛋白都有其專一的殺蟲活性譜，如)具有高毒性，棉鈴蟲(都高毒，毒等。殺蟲晶體蛋白殺蟲作用過程：當(dāng)殺蟲晶體蛋白被敏感昆蟲攝取以后，晶體就會(huì)溶解并釋放出原毒素，原毒素在中腸中蛋白酶的作用下變成了一種對(duì)蛋白酶有抗性的核心片段即毒性肽，毒性肽會(huì)穿過圍食膜并結(jié)合到中腸細(xì)胞的刷狀緣的特異結(jié)合位點(diǎn)上，然后插入到細(xì)胞膜，形成穿孔，細(xì)胞因失去滲透平衡死亡，最后導(dǎo)致昆蟲死亡( 自1959年以來(lái)000，993），主要用來(lái)控制如鱗翅目、雙翅目、鞘翅目的害蟲，最近也報(bào)道了一些對(duì)膜翅目、直翅目、食毛目昆蟲以及線蟲、螨、原生動(dòng)物有活性的對(duì)靶標(biāo)害蟲有效，對(duì)天敵等其他昆蟲無(wú)害；對(duì)人畜安全；環(huán)境中易降解，環(huán)境安全。而以上幾點(diǎn)都是化學(xué)殺蟲劑難以克服的。所以學(xué)殺蟲劑最有希望的取代者”，是目前世界上產(chǎn)量最大，應(yīng)用最廣的生物殺蟲劑。自1987年以來(lái)，以色列就用歐洲和北美，000），主要原因是間不穩(wěn)定，持效期短；對(duì)隱蔽害蟲效果不大；活性譜窄等。待于對(duì)上述一系列不利因素的解決。目前著劑、遮光劑、增效劑和誘食劑等。991）報(bào)道幾種可用于保護(hù)其在商業(yè)化的應(yīng)用有待于對(duì)環(huán)境安全和昆蟲取食行為的影響的評(píng)價(jià)。將以淀粉包埋夠吸引害蟲攝取以顯著的增加其對(duì)歐洲玉米螟防治的效果（自二十世紀(jì)九十年代以來(lái)，隨著對(duì)過遺傳操縱的手段將兩種或多種而擴(kuò)大了得一種遺傳改良的000）。但田間持效期短仍然是影響一般的持效期為2到3天。防治鱗翅目害蟲的989, 對(duì)棉鈴蟲、玉米螟等鉆柱性害蟲以及地下害蟲等防治中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2效果比較差（993）。 2. 害蟲對(duì)蟲的抗藥性一直是農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲控制中的一個(gè)嚴(yán)重問題，據(jù)報(bào)道，已經(jīng)有500多種昆蟲和螨類對(duì)一種或多種殺蟲劑、殺螨劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。這在許多國(guó)家特別是發(fā)展中國(guó)家，對(duì)人類健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成了巨大的威脅。 起初人們認(rèn)為蘇云金芽孢桿菌是一種昆蟲病原菌與昆蟲共進(jìn)化，害蟲不會(huì)對(duì)多年的應(yīng)用中，雖然害蟲對(duì)在某些過度使用的地區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗性的產(chǎn)生（自1985年對(duì)續(xù)有了很多類似報(bào)道，至少有10種鱗翅目昆蟲、2種鞘翅目昆蟲和4種膜翅目昆蟲在室內(nèi)汰選的條件下對(duì)：煙芽夜蛾的印度谷螟的343對(duì)歐洲玉米螟對(duì)科羅拉多馬鈴薯甲蟲對(duì)但是至目前為止，僅有小菜蛾（對(duì)國(guó)夏威夷田間的小菜蛾對(duì)3倍的抗性。另外，小菜蛾的60倍的抗性( 害蟲對(duì)目前的研究來(lái)看，不同的昆蟲對(duì)不同的殺蟲蛋白有著不同的抗性機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)，即使同一種昆蟲的不同種群對(duì)同一種殺蟲蛋白也可能存在著不同的抗性機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)。 性的生化機(jī)制 目前研究報(bào)道的最主要的抗性機(jī)制是殺蟲蛋白與中腸靶標(biāo)位點(diǎn)（受體蛋白）結(jié)合的減少導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。這也是報(bào)道的產(chǎn)生田間抗性的一種主要的機(jī)制(1988年在著與究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)知的在昆蟲中與肽酶從幾種昆蟲中分離和鑒定出的數(shù)屬于氨肽酶在舞毒蛾（合合實(shí)驗(yàn)表明不同昆蟲的在著一種或多種結(jié)合蛋白，大小從63印度谷螟343行受體結(jié)合研究，表明其對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量并沒有改變(與343菜蛾的、個(gè)抗性種群對(duì)996，1994，這說明小菜蛾中腸中 第一章 引言 3菜蛾的997），但是這說明小菜蛾對(duì)存在著其他抗性機(jī)制。小菜蛾的此，減少原毒素向毒性肽的轉(zhuǎn)化也是其一個(gè)次要的抗性機(jī)制( 印度谷螟198且中腸有活性進(jìn)一步研究證明，其對(duì)而且這一種群對(duì)這說明中腸蛋白水解酶對(duì)抗性有一定的影響。 煙芽夜蛾的柱狀腸道細(xì)胞的組織病變與敏感幼蟲相似(同樣，煙芽夜蛾因此，也可能是高齡幼蟲比低齡幼蟲對(duì)另外，001)通過對(duì)線蟲提出受體蛋白的非糖基化是對(duì)對(duì)煙芽夜蛾的對(duì)是原毒素的活性降低，活性肽的降解加速，細(xì)胞的修復(fù)功能增強(qiáng)(999，對(duì)群表現(xiàn)為結(jié)合的輕微減少和非特異位點(diǎn)結(jié)合的增加(因此，一種或多種昆蟲對(duì)一種或多種殺蟲蛋白抗性的產(chǎn)生往往是多種抗性機(jī)制共同作用的結(jié)果，而這種抗性的產(chǎn)生可以發(fā)生在晶體溶解、蛋白水解過程、圍食膜的穿透、受體結(jié)合、膜插入、穿孔形成、及中腸細(xì)胞滲透失衡等。 性的遺傳基礎(chǔ) 通過對(duì)抗性種群、敏感種群及其正反交以獲得抗性基因的顯性水平和性別連鎖的信息。比較給定死亡水平下，雜合個(gè)體與兩純合種群死亡率曲線的相對(duì)位置(這是殺蟲劑抗性的顯性水平，以964)公式：D = (2(，其中，合，抗性個(gè)體的致死濃度，1表示完全隱性，1表示完全顯性）。一公式在殺蟲劑抗性顯性水平估測(cè)中應(yīng)用最廣泛。為了使其值在經(jīng)典的0提出了(，其中，D+1）/2。可以通過浸葉生測(cè)或人工飼料生測(cè)的方法檢測(cè)。所謂浸葉生測(cè)就是讓昆蟲在攝取昆蟲在攝取以較好的模擬了田間情況。在小菜蛾的不同抗性種群的研究中大多采中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4用了這種方法，。所謂人工飼料生測(cè)就是讓昆蟲取食含有以上的結(jié)果說明，害蟲對(duì)也有例外，用浸葉法測(cè)得馬鈴薯甲蟲對(duì)C)更接近顯性或共顯性遺傳。因?yàn)闅⑾x劑的不同濃度可以在浸葉和人工飼料生測(cè)中運(yùn)用，而基于單個(gè)毒素濃度變化的死亡率的顯性水平必須依據(jù)這一濃度測(cè)驗(yàn)。如果劑量一值將表示敏感純合體、抗性純合體和雜合體的常為間的關(guān)系，但是，通過這種方法獲得的顯性水平，對(duì)于抗性治理意義不大，因?yàn)檠泳徔剐缘年P(guān)鍵點(diǎn)在于決定找到一個(gè)能殺死雜合害蟲個(gè)體的劑量的技術(shù)可能性。 在對(duì)抗性種群和敏感種群及其得了初步的遺傳信息，然后，）或敏感（S）種群親本回交即標(biāo)準(zhǔn)回交測(cè)試（991）。通常情況下，果抗性為部分或完全隱性，）親本回交；如果抗性為部分或完全顯性，則回交類型為。標(biāo)準(zhǔn)回交方法中假設(shè)測(cè)試的是抗性受同一位點(diǎn)的一對(duì)等位基因（R，S）控制。如果抗性親本為100% 1代為100% 果假設(shè)為真，那么在一給定劑量S：)(=，其中設(shè)的設(shè)的可以通過概率回歸計(jì)得。實(shí)際值與測(cè)交值的適合性用卡平方測(cè)驗(yàn)分析/)(212=，其中1 =。從表3可以看出，在報(bào)道的小菜蛾的6個(gè)種群中有4個(gè)種群（、較好的符合單基因模式，而另外兩個(gè)種群（符合單基因模式（002）。歐洲玉米螟對(duì) 另外，多數(shù)研究表明對(duì)在夏威夷，采自未產(chǎn)生抗性的小菜蛾種群的三個(gè)實(shí)驗(yàn)室汰選種群(2800倍)，當(dāng)去掉選擇壓后，對(duì)性迅速下降，十三代后其如煙芽夜蛾后有保持穩(wěn)定的趨勢(shì)(歐洲玉米螟一室內(nèi)汰選種群對(duì)=但也有一些例外，選擇撤消后，抗性并不下降，如印度谷螟的343小菜蛾種群中也有三個(gè)例外的例子(在去掉選擇壓后仍然保持高而穩(wěn)定的抗性水平。 不同的昆蟲對(duì)不同的殺蟲晶體蛋白可能產(chǎn)生不同的交互抗性。用這一種群（高的交互抗性，而對(duì)與 第一章 引言 5選的另一煙芽夜蛾品系對(duì)對(duì)這一種群的抗性還擴(kuò)及到對(duì) 性的分子基礎(chǔ) 運(yùn)用同功酶多態(tài)性的經(jīng)典遺傳連鎖分析方法，在煙芽夜蛾的布在煙芽夜蛾31條染色體上的10條染色體上），揭示了一個(gè)主效基因位點(diǎn)即第九連鎖群，標(biāo)記位點(diǎn)是甘露糖制著對(duì)另外，連鎖群11（標(biāo)記位點(diǎn) 鳥嘌呤脫氨酶）也對(duì)其抗性有一定的貢獻(xiàn)(001)對(duì)煙芽夜蛾慮到在一些昆蟲中對(duì)試了編碼前所知在昆蟲中腸中有兩種類型的昆蟲腸道中幫助消化蛋白的一種酶）和鈣粘著蛋白（一些位于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)粘著物）。001）很快排除了兩個(gè)在煙芽夜蛾中已經(jīng)分離得到的70體A）通過20么另一類型目前在煙芽夜蛾中目前還沒有分離出這種蛋白，他們用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離了一個(gè)鈣粘著蛋白基因的一個(gè)片段并定為在了