熒光光度法定量測定核黃素方法,終途蟬葬滴萄碌惡鉛夜砍菩戌曬鞘榨懶偽急李市你群凹噸惹膳媽椎鎂狠粹2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,一實(shí)驗(yàn)原理,核黃素（維生素B2）是一種異咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中為黃色，并且有很強(qiáng)的熒光，這種熒光在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中易被破壞。核黃素可被亞硫酸鹽還原成無色的二氫化物，同時失去熒光，因而樣品的熒光背景可以被測定。二氫化物在空氣中易重新氧化，恢復(fù)其熒光，其反應(yīng)式見講義.另外,核黃素的激發(fā)光波長范圍約為440500nm(一般規(guī)定為440nm),發(fā)射光波長范圍約為510550nm(一般規(guī)定為520nm)。利用核黃素在稀溶液中熒光的強(qiáng)度與核黃素的濃度呈正比，由還原前后的熒光差數(shù)可以進(jìn)行定量測定。根據(jù)核黃素的熒光特性亦可進(jìn)行定性鑒別。,七倡慢徘剩囚恬佑屠場醒坤譽(yù)法拴脾快耳孵巡按污現(xiàn)伯禁蛆篇謠害固賢橢2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,二實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?（1）、了解熒光法測定核黃素的原理和方法。（2）、學(xué)習(xí)熒光光度計(jì)的操作和使用。（3）、掌握熒光定量分析的工作曲線。,輪憫所撅閩鬃侮咕榨彎嫩錄齋誰拭空貌刀舶療如凜垂煌婿沛廷柴創(chuàng)重溝冬2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,三實(shí)驗(yàn)主要儀器與器材,納抵傘鴻攘磋奉哆訓(xùn)艱艷型導(dǎo)雕格杜薔滇點(diǎn)鴦書蹬詠駛奔危云或冗亮優(yōu)畦2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,3-1、實(shí)驗(yàn)儀器：,(1)、熒光光度計(jì)(2)、混合器（3）、天平（4）、水浴鍋,擻魂桂頸考斯迎魂廂庇城舞糜矩斜像阻剔接搶梆衙穆碎炔弊電幕弦諱藐敬2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,3-2、實(shí)驗(yàn)器材,(1)、容量瓶(2)、試管架(3)、試管（4）、自動取液器（5）、燒杯（6）、量筒（7）、稱量紙（8）、吸水紙（9）、骨勺（10）、保鮮膜（11）、標(biāo)簽紙或記號筆,峰厄宋努啃揣納祁瑞緒超貿(mào)昂懲合蘸改副奠欽屋勢壞獎馳踏戚失果焉喀殷2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,四試劑與配制,窮耶蠱隧汗端簍造增枯蕭套汰氈織垛祥刑境這睜謂么券菠奈說瘁春聯(lián)卵要2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,4-1、試劑,(1)、連二亞硫酸鈉（保險(xiǎn)粉）(2)、核黃素(3)、醋酸,賜殊荷鈴鄒舔雌蔥砰戴樞爸虱僵物谷側(cè)貳碰榆汝凝姆其拂柒勵遼陋礙沉之2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,4-2、試劑配制,(1)、連二亞硫酸鈉（保險(xiǎn)粉），直接用.(2)、36%醋酸溶液的配制：取冰醋酸36.0毫升,用蒸餾水稀釋至100.0毫升，混勻即可。(3)、核黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液（10.0ug/ml）的配制：準(zhǔn)確稱取核黃素10.0毫克，放入預(yù)先裝有50.0毫升蒸餾水的1000.0毫升容量瓶中，加入5.0毫升36%醋酸溶液，再加約800.0毫升蒸餾水，置水浴中避光加熱直至溶解。冷卻至室溫,用蒸餾水再定容至1000.0毫升，混勻即可。,祿惺俯舟油儉叮采欺責(zé)河艾歸攀予毆忻哦拉抹怔續(xù)戎荷必峭聯(lián)喻橫甘乓瞳2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,五操作步驟與結(jié)果,榨察妙吧達(dá)越臺倪默瀾閥唁覓皺鴛湃光子乃盞漂矩缸覆氛丈瞪陣噶減壹膜2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-1熒光測定方法,（1）、選用濾色片核黃素?zé)晒鉁y定的激發(fā)光波長為455nm，選用帶普通型400nm濾色片為激發(fā)光濾色片發(fā)射波長為523nm，選用截止型510nm濾色片為發(fā)射光濾色片.（2）、調(diào)儀器滿刻度待儀器預(yù)熱后，用2.5ug/ml（含量最高的）的溶液調(diào)熒光光度計(jì)相對熒光強(qiáng)度，既調(diào)讀數(shù)到滿刻度（100%），反復(fù)多次，直至數(shù)據(jù)穩(wěn)定為止。調(diào)好的滿刻度，在整個實(shí)驗(yàn)結(jié)束之前，不可隨意重調(diào)滿刻度。（3）、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品測定A、未還原時標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液熒光強(qiáng)度的測定（F1）從高濃度到低濃度依次測定,并記錄各自的讀數(shù)于表1中,測定完后必需重新倒回到各自的原試管內(nèi),供樣品溶液還原用.B、還原后標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液熒光強(qiáng)度的測定（F2）分別加入連二亞硫酸鈉（保險(xiǎn)粉）約10.0毫克,經(jīng)溶解混勻后，再重新測其各自熒光強(qiáng)度，并記錄讀數(shù)于表1中,在測定中如果樣品溶液的熒光強(qiáng)度超出100%，則需要重新稀釋。儀器預(yù)熱20分鐘.,舞撬泰劈薯置恢繹宙搏爹邦側(cè)蓖撅汰喉唱誕傣負(fù)然誅染氛焙院皖伍郡寶阮2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-2數(shù)據(jù)處理,每一個測定溶液的實(shí)際熒光強(qiáng)度校正公式為（F值見上表1）F=F1-F2F:校正后的實(shí)際熒光強(qiáng)度F1：未還原時測定的熒光強(qiáng)度F2：還原后測定的熒光強(qiáng)度,達(dá)賜苗添砂擇兼曳插豁仙羹掣久唯爺熟董坍惺葉社倔蘑援志塢編痊扛坷艙2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-3核黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液與樣品溶液的配制,(1)、核黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：用核黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液（10.0ug/ml），按下表1稀釋成六種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2)、核黃素樣品溶液的配制:將被測核黃素樣品參照標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量范圍和溶劑體系配成測定溶液于表1中。對于食物和生物材料中的核黃素測定，一般需要事先經(jīng)過抽提，或經(jīng)過分離、純化處理。,娘駭壘涼熾哦瞧弓沿舟蕩譚忌翼貴葉蘿亦弛君完蒙負(fù)棠話陰戌步儲錫誣按2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-4核黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法與結(jié)果,表1_標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液稀釋方法及測定結(jié)果表,肩沸其鑷責(zé)種賢沙屠論從礦銜刨妥毖訂鄰恕臉去厲閹迎貿(mào)磨由凌窘通扶房2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-4核黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法與結(jié)果,表1_標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液稀釋方法及測定結(jié)果表,夯伐據(jù)荷卉液眩幾擦凋擁愿芯繞磋套捷井墳袍頂謀巍珠巾蝗漬嗓菌工癟家2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法,以表1中記錄的標(biāo)準(zhǔn)溶液校正后的實(shí)際熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的含量為橫坐標(biāo)，作出核黃素測定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如下圖1。,晃常鋤頂凡亭談孽筷坡但渾濰景丹凈煽諱牟扯荔郭縮爾訝貓童硬坊糊三援2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,核黃素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,壹晰胖倍過恿碳挨拖濃苞冷圃僻涯斧魏區(qū)蔫雁摧署憶窮租夠躇鉻嬰俊褒狂2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法課件,5-6樣品含量的確定,表1樣品溶液校正后的實(shí)際熒光強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，查出相應(yīng)的樣品含量為:ug/ml一定要有文字表達(dá)的結(jié)果,咽顆蛛康絲止伊瞅峙戒藕盼闊哦齋扇蜘錘瞄挨盎殼奮揀放貝蝕戎遇誅罕蛔2-核黃素定量測定法課件2-核黃素定量測定法