.,維生素的作用維生素是維持人體正常生理功能必需的一類天然有機(jī)化合物，其主要功用是通過作為輔酶的成分調(diào)節(jié)代謝。維生素一般在體內(nèi)不能合成或合成數(shù)量較少，不能充分滿足機(jī)體需要，必須經(jīng)常由食物來供給。維生素的種類維生素的種類很多，可分為脂溶性維生素和水溶性維生素。脂溶性維生素有A、D、E、K等，水溶性維生素有維生素C和B。在這些維生素中，人體比較容易缺乏而在營(yíng)養(yǎng)上又較重要的維生素有：A、D、C、E、B1、B2、B6、煙酸。維生素的檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法中有紫外可見分光光度法、熒光光度法，這兩種是多種維生素的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。靈敏、快速，有較好的選擇性。另外，各種色譜法以其高分離效能，在維生素分析方面占有重要的地位。,.,1、維生素A的測(cè)定三氯化銻光度法維生素A的測(cè)定方法除三氯化銻光度法外，還有紫外分光光度法、熒光法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。（1）原理在氯仿溶液中，維生素A與三氯化銻可相互作用，生成藍(lán)色可溶性配合物，其顏色深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該藍(lán)色物質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)可用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度（于620nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰），其吸光度與維生素A的含量在一定的范圍內(nèi)成正比，故可比色測(cè)定。,一、脂溶性維生素的測(cè)定,.,（2）試劑無水硫酸鈉不吸附維生素A乙酸酐無水乙醚不含過氧化物無水乙醇不含醛類物質(zhì)三氯甲烷不含分解物250gL三氯化銻一三氯甲烷溶液1：1氫氧化鉀溶液（50%）0.5molL氫氧化鉀溶液維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液酚酞指示劑,.,（4）操作步驟樣品處理根據(jù)樣品性質(zhì)，可采用皂化法或研磨法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確取一定量的維生素標(biāo)準(zhǔn)液于個(gè)容量瓶中，以三氯甲烷配制標(biāo)準(zhǔn)系列。再取相同數(shù)量比色管順次取mL三氯甲烷和標(biāo)準(zhǔn)系列使用液mL，各管加入乙酸酐1滴制成標(biāo)準(zhǔn)比色系列。于620nm波長(zhǎng)外，以三氯甲烷調(diào)節(jié)吸光度至零點(diǎn)，將其標(biāo)準(zhǔn)比色系列按順序移入光路前，迅速加入mL三氯化銻三氯甲烷溶液。于s內(nèi)測(cè)定吸光度，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。,（3）儀器和設(shè)備分光光度計(jì)回流冷凝裝置,.,皂化法:適用于維生素A含量不高的樣品(可減少脂溶性物質(zhì)的干擾,但費(fèi)時(shí),維生素A易損失)1、皂化：稱取0.55克樣品于三角瓶中，加入10mL氫氧化鉀及2040mL乙醇，于電熱板上回流30min至皂化完全為止。2、提?。簩⒃砘?jī)?nèi)混合物移至分液漏斗，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振搖并注意放氣，靜置分層后，水層放入第二個(gè)分液漏斗中。皂化瓶再用約30mL乙醚分兩次沖洗，洗液傾入第二個(gè)分液漏斗。振搖后，靜置分層，水層放入三角瓶中，醚層與第一個(gè)分液漏斗合并。重復(fù)至水液中無維生素A為止。,樣品測(cè)定于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入滴乙酸酐為空白液。另一比色管中加入mL三氯甲烷，其余比色管中分別加入mL樣品溶液及1滴乙酸酐。以下步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。,.,3、洗滌：用約30mL水加入第一個(gè)分液漏斗中，輕搖，靜置片刻，放去水層，加1520mL0.5mol/L氫氧化鉀液于分液漏斗中，輕搖后，棄去下層堿液，除去醚溶性酸皂。再用水洗滌，每次用水約30mL，直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止。醚層液靜置1020min，小心放出析出的水。4、濃縮：將醚層液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25mL乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉2次，洗液并入三角瓶?jī)?nèi)。置水浴上蒸餾，收回乙醚。直到瓶中剩5mL時(shí)取下，用減壓抽氣法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)。,.,研磨法：適用于每克樣品維生素A含量大于510g樣品的測(cè)定（步驟簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確）1、研磨：精確稱取25g樣品，放入盛有35倍樣品質(zhì)量的無水硫酸鈉研缽中，研磨至樣品中水分完全被吸收，并均質(zhì)化。2、提取：小心地將全部均質(zhì)化樣品移入帶蓋的三角瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確加入50100mL乙醚，緊壓蓋子，用力振搖2min，使樣品中維生素A溶于乙醚中，使其自行澄清（或離心澄清）。3、濃縮：取澄清乙醚液25mL，放入比色管中，在7080水浴上抽氣蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解殘?jiān)?.,（5）結(jié)果計(jì)算X-樣品中維生素的含量，mg/100g（若按國(guó)際單位，每國(guó)際單位相當(dāng)于.3g維生素）；c-由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中含維生素的含量，gmL；m-樣品質(zhì)量，g；-提取后加三氯甲烷定量之體積，mL；100-以每100g樣品計(jì)。,.,（一）維生素C的測(cè)定維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。新鮮的水果蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、獼猴桃、柑橘等食品中含量尤為豐富。方法：測(cè)定維生素C常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、熒光法和高效液相色譜法等。以下介紹熒光法、2，4-二硝基苯肼光度法。1、熒光法（1）原理：試樣中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸后，與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹唔啉，其熒光強(qiáng)度與抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測(cè)定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。,二、水溶性維生素的測(cè)定,.,（2）試劑：偏磷酸冰醋酸溶液：稱取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀釋至500mL過濾后，貯存于冰箱中；硫酸：0.15mol/L偏磷酸乙酸硫酸溶液：稱取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀釋至500mL；乙酸鈉溶液：稱取500g乙酸鈉溶解并稀釋至1L；硼酸乙酸鈉溶液：稱取硼酸9g，加入35mL乙酸鈉溶液，用水稀釋至1000mL；鄰苯二胺溶液：稱取20mg鄰苯二胺鹽酸鹽溶于100mL水中；抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.500g抗壞血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至50mL；,.,抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：100g/mL百里酚藍(lán)指示劑(麝香草酚藍(lán))：變色范圍pH1.2(紅)2.8(黃)；活性炭：取50g活性炭加入250mL10%鹽酸，加熱至沸，減壓過濾，用蒸餾水沖洗活性炭，檢查濾液中無鐵離子為止，于110120烘干。（3）儀器：熒光分光光度計(jì)或具有350nm及430nm波長(zhǎng)的熒光計(jì)；搗碎機(jī)。（4）操作步驟：試樣的制備：稱取100克鮮樣,加100mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入搗碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，先取少量樣品加入1滴百里酚藍(lán)，若顯紅色(pH=1.2)，即用偏磷酸冰醋酸溶液定容至100mL；若顯黃色(pH=2.8)，即用偏磷酸冰醋酸硫酸溶液定容至100mL，定容后過濾備用。,.,測(cè)定：氧化處理：將上述濾液及抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液各100ml轉(zhuǎn)入三角瓶中加入12g活性炭振搖12分鐘，過濾。即試樣氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測(cè)定。各取10mL標(biāo)準(zhǔn)氧化液于2個(gè)100mL容量瓶中，分別標(biāo)明“標(biāo)準(zhǔn)”及“標(biāo)準(zhǔn)空白”各取10mL試樣氧化液于2個(gè)100mL容量瓶中，分別標(biāo)明“試樣”及“試樣空白”于“標(biāo)準(zhǔn)空白”及“試樣空白”中各加5mL硼酸-乙酸鈉溶液，混合搖動(dòng)15min，用水稀釋至100mL，在4冰箱中放置23小時(shí)，即得“標(biāo)準(zhǔn)空白”溶液及“試樣空白”溶液，備用。于“試樣”及“標(biāo)準(zhǔn)”中各加5mL/L乙酸鈉溶液，用水稀釋至100mL,即得“試樣”溶液及“標(biāo)準(zhǔn)”溶液，備用。,.,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取上述“標(biāo)準(zhǔn)”溶液（抗壞血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和2.0mL標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于10mL帶蓋試管中，再用水補(bǔ)充至2.0mL。取中“標(biāo)準(zhǔn)空白”溶液，“樣品空白”溶液及中“樣品”溶液各2mL，分別置于10mL帶蓋試管中。在暗室迅速向各客中加入5mL鄰苯二胺溶液，振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，于激發(fā)光波長(zhǎng)338nm、發(fā)射光波長(zhǎng)420nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，其直線回歸方程供計(jì)算時(shí)使用。,.,（5）結(jié)果計(jì)算：式中X-試樣中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g；c-由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得試樣溶液濃度，g/mLm-試樣的質(zhì)量，g；V-熒光反應(yīng)所用試樣體積，mL；F-試樣溶液的稀釋倍數(shù)。,.,（1）測(cè)定原理總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸，樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4二硝基苯肼作用生成紅色脎，根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比，進(jìn)行比色定量。,2、2，4-二硝基苯肼光度法,.,（2）試劑本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。試劑純度均為分析純。4.5mol/L硫酸：謹(jǐn)慎地加250mL硫酸（比重1.84）于700mL水中，冷卻后用水稀釋至1000mL。85%硫酸：謹(jǐn)慎地加90mL硫酸（比重1.84）于100mL水中。2，4二硝基苯肼溶液2%：溶解2g2，4二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸內(nèi)，過濾。不用時(shí)存于冰箱內(nèi)，每次用前必須過濾。草酸溶液2%：溶解20g草酸（H2C2O4）于700mL水中，稀釋至1000mL。草酸溶液1%：稀釋500mL2%草酸溶液到1000mL。硫脲溶液1%：溶解5g硫脲于500mL1%草酸溶液中。硫脲溶液2%：溶解10g硫脲于500mL1%草酸溶液中。鹽酸1mol/L：取100mL鹽酸，加入水中，并稀釋至1200mL?？箟难針?biāo)準(zhǔn)溶液：溶解100mg純抗壞血酸于100mL1%草酸中，配成每毫升相當(dāng)于1mg抗壞血酸?；钚蕴浚簩?00g活性炭加到750mL1mol/L鹽酸中，回流12h，過濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無鐵離子(Fe3+)為止，然后置于110烘箱中烘干。,.,檢驗(yàn)鐵離子方法：利用普魯士藍(lán)反應(yīng)。將2%亞鐵氰化鉀與1%鹽酸等量混合，將上述洗出濾液滴入，如有鐵離子則產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。（3）儀器和設(shè)備恒溫箱：370.5；可見紫外分光光度計(jì)；搗碎機(jī)。,.,（4）操作步驟樣品的制備：a、鮮樣的制備：稱100g鮮樣和100g2%草酸溶液，倒入搗碎機(jī)中打成勻漿，取1040g勻漿（含12mg抗壞血酸）倒入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。b、干樣制備：稱14g干樣（含12mg抗壞血酸）放入乳缽內(nèi)，加入1%草酸溶液磨成勻漿，倒入100mL容量瓶?jī)?nèi)，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。將上述濾液過濾，濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液，過濾，備用。氧化處理：取25mL上述濾液，加入2g活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10mL此氧化提取液，加入10mL2%硫脲溶液，混勻。,.,標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：a、加2g活性炭于50mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中，搖動(dòng)1min，過濾。b、取10mL濾液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀釋至刻度，抗壞血酸濃度20g/mL。c、取5mL，10mL，20mL，25mL，40mL，50mL，60mL稀釋液，分別放入7個(gè)100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最