,醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗ExperimentofMedicalMicrobiology,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心病原生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室楊致邦2010.1,教材,高等醫(yī)學(xué)院?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)系列教材病原生物學(xué)實驗科學(xué)出版社，2008年6月主編楊致邦葉彬,掌握病原生物學(xué)的基本方法與基本操作技術(shù)；強化實驗室生物安全觀念，掌握無菌操作技術(shù)；加深對病原生物學(xué)基本理論知識的理解與認識；培養(yǎng)獨立操作、獨立觀察和思考、獨立分析問題和解決實際問題的能力；增強科技創(chuàng)新能力；培養(yǎng)嚴謹?shù)淖黠L(fēng)、科學(xué)的方法和嚴肅認真的工作態(tài)度。,實驗教學(xué)的目標,臨床醫(yī)學(xué)本科實驗內(nèi)容及安排,臨床藥學(xué)本科實驗內(nèi)容及安排,非臨床醫(yī)學(xué)本科實驗內(nèi)容及安排,實驗一,細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察ObserveonMorphologyandStructureofBacteria,【目的要求】1.熟悉實驗室生物安全規(guī)則,掌握無菌操作技術(shù)；2.掌握細菌標本革蘭染色的操作步驟和方法；顯微鏡(油鏡)下細菌形態(tài)的觀察;革蘭染色結(jié)果判斷；3.掌握細菌的特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽孢）的形態(tài)特點。,【實驗內(nèi)容】1.實驗室生物安全規(guī)則(P3)；2.細菌標本革蘭染色觀察（GramsStain)(每人做）(P10)；3.復(fù)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用(每人做）；4.細菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察（示教鏡）(P104)。,【實驗材料】(1)菌種:葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物。(2)試劑:革蘭染色液。(3)其他:生理鹽水、載玻片、酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、二甲苯等。,【實驗方法】1細菌涂片的制作步驟：涂片干燥固定注意點：1）無菌操作2）加生理鹽水（固體培養(yǎng)物）,生理鹽水生理鹽水生理鹽水+葡萄球菌大腸桿菌葡萄球菌+大腸桿菌,載玻片,2.革蘭染色1)方法初染:結(jié)晶紫和碳酸氫鈉各13滴,3s-5s，水沖凈,甩干。媒染:碘液13滴,3s-5s秒鐘，水沖凈,甩干。脫色:95%乙醇數(shù)滴,5s-10s,水沖凈,甩干。復(fù)染:稀釋石炭酸復(fù)紅液13滴,10s，水沖凈,甩干。關(guān)鍵步驟：掌握脫色程度。,【結(jié)果觀察】指標:形態(tài)、染色性、排列。染色性判斷：革蘭陽性菌染成藍紫色,革蘭陰性菌染成紅色。,3.觀察標本片自然干燥或在酒精燈火焰上烤干后,在涂菌處滴加1滴香柏油,油鏡下觀察。,GramsStain,1000,葡萄球菌:革蘭陽性球菌,成堆或呈葡萄狀排列。,大腸桿菌:革蘭陰性桿菌,不規(guī)則分散排列。,GramsStain,1000,4.細菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察,注意點：觀察時只能動顯微鏡的微調(diào),不要動位置。要求：畫圖記錄。,1）破傷風(fēng)桿菌的芽胞:,芽胞染色1000,鞭毛染色1000,2)變形桿菌的鞭毛:,3)肺炎鏈球菌的莢膜:,莢膜染色1000,【實驗注意點】1.生物安全、無菌操作,菌種管清理；2.顯微鏡(油鏡)的使用用后擦鏡頭；3.用過的載玻片放進有消毒水的玻缸。4.做好清潔衛(wèi)生。,【實驗報告內(nèi)容】,1.細菌標本革蘭染色觀察（方法、結(jié)果畫圖、討論）；2.細菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）觀察（畫圖）。,【實驗報告示范】,實驗一細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察,【實驗內(nèi)容】1.實驗室生物安全規(guī)則（每人掌握）；2.細菌標本革蘭染色觀察（GramsStain)(每人做）；3.復(fù)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用(每人做）；4.細菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察（示教鏡）。,【實驗材料和方法】,一、細菌標本革蘭染色觀察1細菌涂片的制作菌種：葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物方法：涂片干燥固定1）涂片：在酒精燈火焰旁用接種環(huán)無菌操作取生理鹽水和葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物，涂抹、混勻于載玻片上，如下圖：,生理鹽水生理鹽水生理鹽水+葡萄球菌大腸桿菌葡萄球菌+大腸桿菌,3）固定將載玻片以均勻的速度通過酒精燈火焰來回3次。,2）干燥將涂片在酒精燈火焰上方約20cm高處烤干。,2.革蘭染色1)方法初染:結(jié)晶紫和碳酸氫鈉各13滴,3s-5s，水沖凈,甩干。媒染:碘液13滴,3s-5s秒鐘，水沖凈,甩干。脫色:95%乙醇數(shù)滴,5s-10s,水沖凈,甩干。復(fù)染:稀釋石炭酸復(fù)紅液13滴,10s，水沖凈,甩干。,3.觀察將標本片在酒精燈火焰上烤干后,在涂菌處滴加1滴香柏油,油鏡下觀察。4.結(jié)果見圖1:,葡萄球菌:革蘭陽性球菌,成堆或呈葡萄狀排列,大腸桿菌:革蘭陰性桿菌,不規(guī)則分散排列,GramsStain,1000,圖1：,細菌標本革蘭染色觀察結(jié)果,5.討論本實驗結(jié)果表明,通過革蘭染色在油鏡下可清楚地觀察到標本片上細菌的形態(tài)、染色性和排列狀態(tài)。革蘭染色可將細菌分為2大類，即染成藍紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌。其原理是革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果不正確的影響因素分析：,二、細菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、