第八章基因工程和基因組學(xué)第一節(jié)基因工程一基因工程概述廣義的遺傳工程包括：基因工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程。習(xí)慣上所講的遺傳工程多指基因工程。,基因工程是一種操作，它不是通過一般傳統(tǒng)的有性雜交方法，而是采取類似于工程建設(shè)的方式，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，借助于實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)，將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去，使后者定向地獲得新的遺傳性狀，成為新的類型。,基因工程的施工程序大致分為四個(gè)步驟：1、為施工準(zhǔn)備材料，即“目的”基因、載體和工具酶等。2、把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子。,3、把重組DNA分子引入受體細(xì)胞，建立分子無(wú)性繁系(Clone)或稱克隆。4、從細(xì)胞群體中選出所需要的無(wú)性繁殖系，并使外源基因在受體細(xì)胞中正確表達(dá)。,二限制性內(nèi)切酶細(xì)菌細(xì)胞具有防御異源遺傳信息進(jìn)入的手段。異源DNA分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，在許多情況下遭到毀滅，這個(gè)過程稱為限制。限制的能力來源于微生物的一種特殊的酶，稱為限制性核酸內(nèi)切酶。這是一種水解DNA的磷酸二脂酶，它是遺傳工程上的一種極其重要的工具酶。,在酶解時(shí)，DNA雙鏈不在同一地方斷開，因而產(chǎn)生的片段兩端都帶有數(shù)個(gè)堿基的單鏈尾巴，這兩個(gè)單鏈尾巴帶有互補(bǔ)的堿基配對(duì)順序，可以互相自動(dòng)接合成為環(huán)狀DNA，因此稱為粘性末端。,三載體(一)質(zhì)粒質(zhì)粒是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，它是易于取出和引入的小型環(huán)狀DNA。一般有1200Kb左右(Kb為千堿基對(duì))它的DNA分子很小，一般為細(xì)菌染色體DNA的0.53%。,噬菌體噬菌體基因組全長(zhǎng)49kb,其核酸序列及基因功能和表達(dá)調(diào)控已研究得十分清楚。噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，位于兩端的為DNA左、右臂。研究表明，基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。,(三)柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒(cosmid)是利用部分噬菌體DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的(圖95)?？滤官|(zhì)粒具有噬菌體的cos序列(12bp)，細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)。,(四)穿梭載體穿梭載體(shuttlevectors)是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體。,(五)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)載體就是為了克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計(jì)構(gòu)建的。BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。,(七)Ti質(zhì)粒及其衍生載體應(yīng)用基因工程技術(shù)改良植物性狀時(shí)，需要適合于植物的載體系統(tǒng)，才能將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞并使目的基因表達(dá)。由Ti質(zhì)粒衍生的載體，是最早成功地把外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的植物表達(dá)載體。,四篩選基因庫(kù)(一)從基因庫(kù)中分離基因基因庫(kù)(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。,從基因庫(kù)中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫(kù)。只有利用合乎要求的基因庫(kù)才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學(xué)工作才能繼續(xù)深入下去。1.構(gòu)建基因庫(kù)(1)核基因庫(kù),核基因庫(kù)(genomiclibrary或genomicbank)是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。,通常的方法是，盡量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度(大于15kb)的DNA片段，與適宜的載體連接構(gòu)成重組DNA分子,根據(jù)所用的載體，選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。若載體是質(zhì)粒，則將連接的重組DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，收集所有菌落即成為質(zhì)?；驇?kù)。,(2)染色體基因庫(kù)將基因組的一部分如一根染色體用來構(gòu)建基因庫(kù)，對(duì)于選擇特異基因及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織十分有價(jià)值。例如果蠅X染色體上的一個(gè)片段，具有50多個(gè)多線染色體帶，利用微切割技術(shù)將這一段染色體切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌體上構(gòu)建成染色體片段基因庫(kù)。,(3)cDNA庫(kù)cDNA庫(kù)是以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)構(gòu)建的基因庫(kù)。,2.篩選基因庫(kù)從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件。大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，作探針，篩選基因庫(kù),3.陽(yáng)性克隆的分析與鑒定從基因庫(kù)中篩選出的陽(yáng)性克隆，還需進(jìn)一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因。,限制性酶圖譜構(gòu)建陽(yáng)性克隆的限制性酶圖譜常是分析陽(yáng)性克隆的第一步。根據(jù)同源性分析，可以了解陽(yáng)性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對(duì)位置，用于進(jìn)一步亞克隆或同已知的其它序列比較。,圖912表示一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建方法。,這個(gè)方法首先是將DNA用限制性酶酶切，然后將酶切的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過變性處理后，將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到膜上，再用經(jīng)過放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交，洗去膜上非特異性結(jié)合的探針后，用X-光片放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào),核酸分子雜交Southern雜交分析(Southernblotting)是基因工程中常用的方法。,核酸序列測(cè)定只有將克隆后的DNA片段進(jìn)行核酸序列測(cè)定后，才能最后確定這個(gè)DNA片段的序列是否正確。大多數(shù)核酸序列測(cè)定采用由Sanger于1977年發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈終止法。,核酸序列分析測(cè)定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，還要用計(jì)算機(jī)軟件或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析，才能最后得出結(jié)論。,(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain),PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：變性：在94-95使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。復(fù)性：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-70。延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。,(三)人工合成基因根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合成基因。,第二節(jié)基因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)是遺傳學(xué)研究進(jìn)入分子水平后發(fā)展起來的一個(gè)分支，主要研究生物體全基因組(genome)的分子特征。一個(gè)物種的單倍體的染色體數(shù)目稱為該物種的基因組或染色體組，它包含了該物種自身的所有基因。,1、基因組圖譜的構(gòu)建,在進(jìn)行大規(guī)模序列測(cè)定之前，構(gòu)建基因組圖譜是測(cè)定大基因組全部核苷酸序列的重要一環(huán),a、克隆連續(xù)序列法(clonecontig)，將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0.1Mb-1Mb的大片段，克隆到Y(jié)AC或BAC載體上，分別測(cè)定單個(gè)克隆的序列，再裝配、連接成連續(xù)的DNA分子。,b、定向鳥槍射擊法(directedshotgun)，以基因組圖譜中的標(biāo)記為依據(jù)，測(cè)序、裝配和構(gòu)建不同DNA片段的序列。,(一)遺傳圖譜圖譜標(biāo)記圖譜構(gòu)建中需要可以鑒別的標(biāo)記(marker)，在構(gòu)建遺傳圖譜中，可用基因和DNA作為標(biāo)記。,(1)基因標(biāo)記基因控制性狀的表現(xiàn)，所以也就是利用可以鑒別的形態(tài)、生化等表型性狀作標(biāo)記,(2)DNA標(biāo)記,A、限制性內(nèi)切酶多型性,B、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多型性,a、多次重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeats，VNTRs)，也稱為微隨體(minisatellite)。這種重復(fù)序列長(zhǎng)度為幾十個(gè)核苷酸。,b、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simpletandemrepeats，STRs)又稱為小隨體(microsatellite)。,C、單核苷酸多型性單核苷酸多型性(simplenucleotidepolymorphisms，SNPs)是基因中的點(diǎn)突變，存在的數(shù)量多，其中有些可產(chǎn)生RFLP，但多數(shù)突變不是發(fā)生在酶切位點(diǎn)。,遺傳圖譜的構(gòu)建(1)人類基因組遺傳圖譜的構(gòu)建,(2)植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建,A、選擇親本,B、產(chǎn)生構(gòu)圖群體,C、遺傳標(biāo)記的染色體定位,D、標(biāo)記間的連鎖分析,(二)物理圖譜,基因組物理圖譜的構(gòu)建不需要經(jīng)過減數(shù)分裂的世代群體，可以直接利用DNA分子分析，主要有以下三種不同途徑。1.限制性酶圖譜,A、用識(shí)別較多核苷酸的內(nèi)切酶,B、選用其酶切位點(diǎn)在基因組中出現(xiàn)頻率低的內(nèi)切酶。,2.熒光原位雜交,3.序列標(biāo)簽位點(diǎn),(1)特異DNA序列A、表達(dá)的序列標(biāo)簽(expressedsequencetag，EST)，表達(dá)的序列來自cDNA(圖910)，一些cDNA的短