植物組織培養(yǎng)技術(shù),李蘭芝生物安全科學技術(shù)學院,1,AGlimpseofPlantTissueCulture,2,主要內(nèi)容：,概述,植物組織培養(yǎng)含義,組織培養(yǎng)的類型,植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史,植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用,3,本節(jié)教學目的與要求,(1)掌握組織培養(yǎng)的概念和類型；(2)掌握組織培養(yǎng)的特點；(3)了解組織培養(yǎng)發(fā)展史；(4)初步掌握組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)實踐上的應(yīng)用。,4,一、什么是植物組織培養(yǎng)WhatIsTissueCulture?Orinvitroculture?Ormicropropagation?,5,（一）概念：,器官（organ)：根、莖、葉、花、果實、種子,組織（tissue)：花藥、胚珠、胚、胚乳、形成層等,植物組織培養(yǎng)（Tissueculture）是指用無菌方法使植物體的離體（invitro)器官、組織和細胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)（Invitroculture）或試管培養(yǎng)。,6,CharacteristicsofPlantTissueCultureTechniques,培養(yǎng)條件可以人為控制,生長周期短，繁殖率高,植物組織培養(yǎng)特點,管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制,7,（二）植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細胞全能性,1、細胞全能性（celltotipotency)：植物體的每一個具有完整細胞核的細胞都具有該物種全部遺傳的物質(zhì)，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。植物的脫分化和再分化能力使得細胞能產(chǎn)生整株植株，植物細胞的這種能力稱為細胞全能性。,為什么？,8,2、植物細胞全能性的表達,脫分化（dedifferentiation)：將已分化的不分裂的靜止細胞，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，細胞重新進入分裂狀態(tài)。一個成熟的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程叫脫分化。,一個細胞一旦沿著某一條特定的途徑分化發(fā)育后，一般不會再回復到未分化狀態(tài)，但在組織培養(yǎng)條件下，可能發(fā)生脫分化和再分化。,再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細胞在一定的培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同的細胞類型，形成完整植株的過程。,9,細胞分化愈傷組織中的細胞本質(zhì)上是薄壁組織細胞，在愈傷組織的再分化過程中，這些薄壁細胞能分化成各種類型的細胞。細胞的這種轉(zhuǎn)化稱為細胞分化。器官分化細胞最后分化成幼芽和胚胎，通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生形成再生植株。,10,脫分化,愈傷組織,再分化,根芽,再生植株,3、植物組織培養(yǎng)過程,合適的外植體離體的植物器官、組織、細胞,移栽,11,4、組織培養(yǎng)植株再生的途徑,魔芋胚狀體,1）、體細胞胚胎發(fā)生途徑（胚狀體發(fā)生途徑）：是指在組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚5個時期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)，而發(fā)育成再生植株的途徑。,12,胚狀體發(fā)生途徑,外植體,脫分化,愈傷組織,胚狀體,再生植株,再分化,13,2）、器官發(fā)生途徑：由愈傷組織或外植體誘導形成不定根或不定芽，再獲得再生植株的方法。,百合鱗葉培養(yǎng),外植體器官發(fā)生途徑,14,愈傷組織,芽分化,再生苗,胚狀體,小麥,愈傷組織器官發(fā)生途徑,15,外植體,愈傷組織,芽,根,再生植株,脫分化,再分化,高生長素(1,2-D),高(生長素/細胞分裂素),低(生長素/細胞分裂素),器官發(fā)生途徑,16,外植體（explant)：由活體（invivo)植物體上切取下來的，用于組織培養(yǎng)的各種接種材料。包括各種器官、組織、細胞或原生質(zhì)體等。,胡蘿卜離體根,愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團無序生長狀態(tài)的薄壁細胞。,17,愈傷組織,18,按培養(yǎng)材料分為（Gamborg等)：,愈傷組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)細胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng),從外植體脫分化得到愈傷組織，最為常見的組織培養(yǎng),懸浮細胞培養(yǎng)單細胞培養(yǎng),胚、胚乳、珠心、子房、根、莖、葉、花和幼果的部分組織的培養(yǎng),（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,種子培養(yǎng)胚胎培養(yǎng),在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)單個細胞或小團細胞,19,種子培養(yǎng),蘭花種子作為外植體進行組織培養(yǎng)，因為：種子小，不含存儲物質(zhì)，播種時容易丟失，成活率低。體外播種易使種子形成不成熟胚，從而縮短生育周期種子生長環(huán)境適宜，避免菌類感染，萌發(fā)發(fā)育更迅速。,石斛蘭的實生苗,20,胚胎培養(yǎng),無菌狀態(tài)下體外分離成熟或不成熟的胚，將胚進行再培養(yǎng)獲得再生植株。適宜培養(yǎng)不能形成種子的雜交種。兩種類型:成熟胚胎培養(yǎng)（子葉期以后）和未成熟胚培養(yǎng)（子葉期以前）操作過程：取材消毒-胚的剝離-接種-（看護）培養(yǎng),21,22,23,植物胚胎培養(yǎng)的意義,1,克服雜種胚的敗育,獲得稀有雜種2,獲得單倍體和多倍體植株3,打破種子休眠,促進胚萌發(fā)4,快速繁殖良種,縮短育種周期5,克服種子生活力低下和自然不育性,提高種子發(fā)芽率6,提高后代抗性,改良品質(zhì)7,種子活力的快速測定8,種質(zhì)資源的搜集和保存9,研究胚胎發(fā)育的過程和控制機制,24,愈傷組織培養(yǎng),愈傷組織由薄壁細胞組成，但這些細胞并不是均一的一種一包，通常由分化細胞核未分化細胞兩種類型細胞組成。影響因素：外植體材料培養(yǎng)基：生長調(diào)節(jié)劑生長素、細胞分裂素培養(yǎng)條件：溫度、光等,25,愈傷組織的誘導與培養(yǎng),26,27,野生棉的愈傷組織,28,29,30,地同母體組織連著。,三、愈傷組織分化與植株再生,31,32,33,34,35,36,37,38,試管苗移栽,39,40,根據(jù)培養(yǎng)器官的不同：葉培養(yǎng)、根培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)等,煙草,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,41,根據(jù)培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)：將培養(yǎng)物放在含有瓊脂等固化劑的培養(yǎng)基表面進行培養(yǎng)。液體培養(yǎng)：將培養(yǎng)物放在未加固化劑的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，一般需進行震蕩，又稱液體震蕩培養(yǎng)。,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,固體培養(yǎng),液體培養(yǎng),42,(1)固體培養(yǎng)法是最常用的方法。該方法簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。(2)液體培養(yǎng)法由于液體中氧氣含量較少，常用振動培養(yǎng)的方法以確保氧氣的供給往復式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進行培養(yǎng)，速度一般為50-200rmin，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。,固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的特點：,43,根據(jù)培養(yǎng)物量的多少：大量培養(yǎng)、微量培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需光：光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方法的不同：平板培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,44,按培養(yǎng)過程分為:初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng),初代培養(yǎng)（Primaryculture）：指外植體的最初培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)（Subculture）：將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中這種反復多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,45,二、植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史,1、萌芽階段：(從20世紀初到30年代中）,1838-1839年，德國科學家Schleide和Schwann發(fā)表了細胞學說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。1902年，德國植物學家Haberlandt根據(jù)細胞學說，提出植物細胞全能性（totipotency）理論。1904年，Hanning最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。克服其種子發(fā)芽困難的問題1925年：Laibach亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種,玉米成熟胚的培養(yǎng),46,Haberlandt：,觀點：,貢獻：,提出細胞全能性,首次進行離體細胞培養(yǎng),高等植物的組織和器官可以分割成單個細胞,47,1934年，美國植物生理學家White用番茄根尖建立起第一個活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。,2、奠基階段（從20世紀30年代末到50年代中）,1934年：Gautherete培養(yǎng)山毛楊、黑楊形成層組織產(chǎn)生了Callus,1937年：White發(fā)現(xiàn)3種B族維生素和IAA對植物生長有用,1939年：Gautherete培養(yǎng)胡蘿卜根小外植體成功,1939年：White培養(yǎng)煙草種間雜種幼莖切段原形成層成功,1939年：Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根塊莖薄壁組織成功,48,組織培養(yǎng)的奠基人,49,3、快速發(fā)展和應(yīng)用階段（從20世紀50年代末至今）,1958年，英國科學家Steward等用胡蘿卜根的愈傷組織細胞進行懸浮培養(yǎng)，成功誘導出胚狀體并分化為完整的小植株。這是第一次實現(xiàn)人工體細胞胚，是植物組織培養(yǎng)的第一個突破。1960年英國學者Cocking用酶法分離原生質(zhì)體成功。這是植物組織培養(yǎng)的第二個突破。1962年，Murashinge和Skoog在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。1964-1966年，印度科學家Guha和Maheswari在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導得到了單倍體植株。1972年，Carlson通過兩個種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個體細胞雜交的雜種植株。,50,三、應(yīng)用領(lǐng)域,1、快速繁殖,2、種苗脫毒,3、遠緣雜交,8、植物性藥物和生物制品的生產(chǎn),7、基因工程,6、種質(zhì)保存,4、突變育種,5、單倍體育種,51,四、植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展,研究材料范圍逐步擴大培養(yǎng)方法逐步完善培養(yǎng)基不斷改進實驗手段逐步完備,52,植物再生植株的途徑,53,小結(jié)：,(1)植物組織培養(yǎng)是指分離單個或多個細胞或植物體的一部分，在人工配制的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，使之長成一株完整植物體的過程。(2)類型：按照外植體的不同，分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)5種類型。(3)組織培養(yǎng)特點：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于工廠化生產(chǎn)的突出特點，因而發(fā)展迅速。(4)組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要體現(xiàn)于以下幾個方面：快速繁殖優(yōu)良苗木；獲得脫毒苗；育種上應(yīng)用；工廠化育苗。,54,植物組織培養(yǎng)實驗室構(gòu)建及操作技術(shù),植物組織培養(yǎng)學,55,本節(jié)教學目的與要求：,(1)掌握組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)計；(2)掌握組織培養(yǎng)常用的實驗儀器設(shè)備及其使用方法；(3)掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。(4)掌握滅菌和消毒的區(qū)別；(5)掌握滅菌的不同方法和具體操作過程；,56,商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備培養(yǎng)基及其配制外植體的選擇與培養(yǎng)試管苗的馴化與移栽,本節(jié)主要內(nèi)容,57,1、培養(yǎng)器皿的清洗；2、培養(yǎng)基的配制、分裝和高壓滅菌；3、無菌操作材料的表面滅菌和接種；4、將培養(yǎng)物放到培養(yǎng)室培養(yǎng)；5、試管苗的馴化、移栽和初期管理。,一商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備,一般組織培養(yǎng)的操作工序：,58,一、設(shè)計：,59,二、儀器設(shè)備和器皿用具,1、超凈工作臺或接種箱2、空調(diào)3、除濕機或加濕器4、恒溫培養(yǎng)箱5、高壓滅菌鍋6、冰箱7、天平8、顯微鏡9、水浴鍋10、搖床與轉(zhuǎn)床11、蒸餾水發(fā)生器12、酸度計13、離心機,（一）常見儀器設(shè)備,組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)計與主要設(shè)備,60,1、培養(yǎng)器皿：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、圓形培養(yǎng)瓶、果醬瓶2、分注器3、離心管4、刻度移液管5、細菌過濾器6、實驗器皿：量筒、燒杯、容量瓶、試劑瓶、塑料瓶、酒精燈等。,組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)計與主要設(shè)備,（二）各類玻璃器皿,61,1、鑷子：尖頭鑷子、槍形鑷子2、剪子3、解剖刀4、接種針5、鉆孔器,組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)計與主要設(shè)備,（三）器械用具,62,二培養(yǎng)基及其配制,本節(jié)目的要求：(1)一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點；(2)掌握基本培養(yǎng)基的配方；(3)一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；(4)掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法；(5)熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；(6)一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。,63,一、培養(yǎng)基的成分,培養(yǎng)基及其配制,64,1、無機營養(yǎng)元素(inorganicelement),1)大量元素：指濃度大于0.5mmolL的元素。N、P、K、Mg、S和Ca等。,2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,培養(yǎng)基及其配制,65,2、有機化合物(organiccompound),最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。使用濃度在1%5%，常用3%作用：碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。,（1）碳水化合物,培養(yǎng)基及其配制,66,在細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動。種類：VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、VH(生物素)、VB11(葉酸)、VB12（鈷胺素)等。使用濃度：一般用量為0.11.0mgL。,（2）維生素(vitamin),培養(yǎng)基及其配制,67,又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃度：一般為lOOmgL，作用：適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。,（3）肌醇,培養(yǎng)基及其配制,68,作用：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用濃度：為10200mgL。,（4）氨基酸(alminoacide）,培養(yǎng)基及其配制,69,3、有機附加物（天然復合物）,10%20%,150-200mlL,150200gL,0.01%-0.05%,濃度：,培養(yǎng)基及其配制,70,4、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(hormone),赤霉素（gibberellicacid）,細胞分裂素類(cytokinin),生長素類(auxin),培養(yǎng)基及其配制,71,*作用：主要被用于誘導愈傷組織形成；促進細胞脫分化；促進細胞伸長；促進生根。在促進生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-510-8mgL)就可促進生長，其次是莖和芽。,（1）生長素類,培養(yǎng)基及其配制,72,吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid),*生長素種類：,培養(yǎng)基及其配制,73,IAA(吲哚乙酸),NAA(萘乙酸),IBA(吲哚丁酸),2,4D(2,4二氯苯氧乙酸),生長素作用強弱順序：,強,弱,培養(yǎng)基及其配制,74,種類：6BA(6芐基腺嘌呤)Kt(kinetin激動素)Zt(zeatin玉米素),（2）細胞分裂素類,細胞分裂素作用：促進細胞分裂與擴大。誘導芽分化，促進側(cè)芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。抑制根的分化。,培養(yǎng)基及其配制,75,Kt(激動素),6BA(6芐基腺嘌呤),Zt(玉米素),細胞分裂素作用強弱順序,強,弱,培養(yǎng)基及其配制,76,GA3（赤霉酸）：作用：促進幼芽伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株。赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當生長素赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。,（3）赤霉素,培養(yǎng)基及其配制,77,5、培養(yǎng)材料的支持物-瓊脂(agar),固體培養(yǎng)時最好的固化劑。用量：610gL。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。,培養(yǎng)基及其配制,78,固體培養(yǎng)基的特點（與液體培養(yǎng)基相比）:,優(yōu)點:操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。缺點:培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。,固體培養(yǎng),液體培養(yǎng),培養(yǎng)基及其配制,79,6、抗生物質(zhì)(antibiotic),種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：520mg/L。作用：可防止菌類污染。,培養(yǎng)基及其配制,80,7、活性炭(activecarbon),目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響；利于生根。使用濃度：15gL。它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。,培養(yǎng)基及其配制,81,8、水（water),作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。,培養(yǎng)基及其配制,82,二、培養(yǎng)基的PH值(pHvalue),1、多數(shù)植物要求pH5.6-5.82、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI調(diào)節(jié).3、注意：經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基pH會下降0.2-0.8,固調(diào)整pH值時,應(yīng)高于0.5；pH的大小會影響瓊脂的凝固能力，當pH6.0時，培養(yǎng)基將會變硬，pH5.0時，瓊脂凝固不好。,培養(yǎng)基及其配制,83,培養(yǎng)基及其配制,不同植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求不同(見表),84,培養(yǎng)基(culturemedium)：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。,三、培養(yǎng)基的種類、配方及特點,培養(yǎng)基及其配制,85,1、根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基,2、根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基,3、根據(jù)作用不同：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基,4、根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、改良培養(yǎng)基。,（一）培養(yǎng)基的種類,培養(yǎng)基及其配制,86,若只含有大量元素與微量元素和碳水化合物的培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加各種各樣的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他有機附加物的培養(yǎng)基叫完全培養(yǎng)基。,初代培養(yǎng)基：指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：指用來接種繼初代培養(yǎng)之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基及其配制,87,（二）MS培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)基及其配制,88,1、MS培養(yǎng)基：它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設(shè)計的。是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。特點：是無機鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。,（三）常用的培養(yǎng)基及特點,培養(yǎng)基及其配制,89,2、White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。特點：無機鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。,3、N6培養(yǎng)基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。特點：是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)。,培養(yǎng)基及其配制,90,(4)B5培養(yǎng)基:是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計的。特點：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。,(5)KM8P培養(yǎng)基:它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。特點：是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素。,培養(yǎng)基及其配制,91,四、培養(yǎng)基的配制,（一）、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:保證各物質(zhì)成分的準確性配制時的快速移取便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。,培養(yǎng)基及其配制,92,單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml或mg/L表示?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。配制生長素類：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。濃度為：1-5mgml。配制細胞分裂素類：一般先用少量0.5-1N鹽酸加熱溶解。濃度為：1-5mgml。,培養(yǎng)基及其配制,母液的配制方法：,93,培養(yǎng)基母液的配制,培養(yǎng)基及其配制,94,（二）培養(yǎng)基的配制及其滅菌,1.配制方法：1、將母液按順序擺放2、取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器3、按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)4、加入蔗糖(30g/L)溶解5、加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min5、定容6、調(diào)PH值(pH=5.8)7、分裝培養(yǎng)瓶，封口8、高壓滅菌,培養(yǎng)基及其配制,95,組織培養(yǎng)常見的滅菌方法,消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。,滅菌:是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。,培養(yǎng)基及其配制,96,常用的滅菌方法,物理方法,化學方法,干熱滅菌(烘燒和灼燒),濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮),射線處理(紫外線、超聲波、微波),過濾除菌,大量無菌水沖洗,升汞(氯化汞),甲醛(福爾馬林),過氧化氫,高錳酸鉀,來蘇兒,漂白粉,次氯酸鈉,酒精,培養(yǎng)基及其配制,97,2.培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法,培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。,培養(yǎng)基及其配制,98,將鍋內(nèi)空氣完全排除后，關(guān)閉放氣閥。當壓力表上升達108kPa時，鍋內(nèi)溫度達121（在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢），維持20-30min。,培養(yǎng)基及其配制,滅菌方法：,99,過濾滅(除)菌（不耐熱的物質(zhì)）,一些生長調(diào)節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過濾滅菌-細菌過濾器方法。防細菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.45m以下，可阻止細菌細胞和真菌的孢子通過。,培養(yǎng)基及其配制,100,空間及物體表面滅菌,培養(yǎng)基及其配制,熏蒸劑:甲醛和高錳酸鉀。,(1)紫外線滅菌,(2)熏蒸滅菌,101,2.培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法,培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。,培養(yǎng)基及其配制,102,第四節(jié)植物抗病細胞突變體篩選,103,抗病細胞突變體基本原理抗病細胞突變體篩選程序抗病細胞突變體篩選實例,本節(jié)主要內(nèi)容,104,基本原理,植物抗病細胞突變體篩選,利用植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的變異，或由物理、化學因素誘發(fā)變異，給予一定的選擇壓力，篩選出符合育種目標的無性系。,105,基本程序,植物抗病細胞突變體篩選,選擇壓力,選擇突變體,分離突變體,鑒定突變體,愈傷組織細胞原生質(zhì)體,保持和利用突變體,106,愈傷組織：最簡單的細胞材料，缺點多，普遍采用。細胞培養(yǎng)物：由少數(shù)細胞集合而成，可彌補愈傷組織的不足。原生質(zhì)體：最理想的細胞材料，但分離和培養(yǎng)技術(shù)不完善，不能普遍采用。,植物抗病細胞突變體篩選,材料選擇,107,負選擇法：選擇一種培養(yǎng)基，使得突變細胞不能生長，野生型細胞生長。然后加負選擇劑，可殺死生長分裂細胞，保留不能生長的突變細胞。正選擇法：將細胞置于有害或有毒的培養(yǎng)基中，能生長的為突變細胞。,植物抗病細胞突變體篩選,突變體的分離,108,突變體的4個特征：突變體以低頻率發(fā)生離開選擇壓，突變體穩(wěn)定植株再生后，突變細胞系穩(wěn)定，從再生植株發(fā)生的愈傷組織，表達其被選擇出的表現(xiàn)型選擇出的表現(xiàn)型能通過有性傳遞保證它是突變的。,植物抗病細胞突變體篩選,突變體的鑒定,109,儲藏再生植株種子突變細胞系再生成植株，取其莖尖無菌無性系不能再生植株細胞系與液氮中低溫儲藏,植物抗病細胞突變體篩選,突變體的保存,110,抗病蟲細胞工程育種,(1)概念和類型；(2)抗病蟲花培單倍體育種；(3)抗病蟲體細胞雜交育種；,111,（一）概念：,無性系變異離體篩選,花藥或花粉離體培養(yǎng),抗病蟲細胞工程育種是指用細胞工程技術(shù)有目的地改造植物的抗性，以獲得抗病蟲的新品種或新物種。三條途徑：,抗病蟲細胞工程育種,體細胞雜交引入抗病蟲性狀,112,定義：指通過花藥或花粉離體培養(yǎng)再生單倍體植株，然后經(jīng)過染色體加倍和常規(guī)選育獲得抗病蟲植物品種的育種方法。,抗病蟲細胞工程育種,抗病蟲花培單倍體育種,113,育種程序,1.選擇親本進行有性雜交,2.取雜交后代的花藥或花粉培養(yǎng)，獲得各種類型的單倍體植株,3.染色體加倍，得到純合二倍體株系,4.鑒定抗病蟲的優(yōu)良品系,5.通過區(qū)試和品種審定，得到抗病蟲的優(yōu)良品種,抗病蟲細胞工程育種,114,外植體的選擇與預(yù)處理,材料的表面消毒,花藥培養(yǎng)的一般步驟,接種和預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)與植株再生,生根壯苗與移摘,花蕾或幼穗，保濕，低溫處理,預(yù)培養(yǎng)可提高花粉植株的誘導率,115,花粉植株倍性鑒定與染色體加倍,倍性鑒定：取花粉植株的莖尖或根尖組織，制成臨時裝片，在顯微鏡下對細胞進行染色體計數(shù)。加倍：0.02%0.4%秋水仙堿處理。,抗病蟲細胞工程育種,116,定義：利用植物體細胞雜交技術(shù)并結(jié)合常規(guī)育種培育出抗病蟲品種的育種方法。植物體細胞雜交：指將植物不同種、屬或科間的體細胞原生質(zhì)體通過人工方法誘導融合形成雜種細胞，然后進行離體培養(yǎng)使其再生成植株的技術(shù)。,抗病蟲細胞工程育種,抗病蟲體細胞雜交育種,117,育種程序,1.選擇親本進行體細胞雜交,2.原生質(zhì)體的制備,3.原生質(zhì)體融合,4.雜種細胞的篩選與鑒定,5.雜種細胞的培養(yǎng)與植株再生,抗病蟲細胞工程育種,5.結(jié)合常規(guī)育種培育出抗病蟲品種,118,選擇材料：雙子葉（葉肉細胞，下胚軸細胞）單子葉（幼胚、幼穗等）酶解分離原生質(zhì)體：除細胞壁（纖維素酶、果膠酶等）不同材料所選用的酶濃度和處理時間不同。原生質(zhì)體純化：沉降法、漂浮法、梯度離心法,原生質(zhì)體的制備,抗病蟲細胞工程育種,119,PEG誘導融合法：PEG（聚乙二醇）作為一種高分子化合物，2050的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高Ca高pH法進行清洗使原生質(zhì)體融合得以完成。電融合法：借助于電場和脈沖