液相色譜的應用以及方法開發(fā),戴安中國有限公司,提綱：,一.HPLC的廣泛應用二.方法開發(fā)過程一）選擇HPLC檢測器二）分配色譜及選擇流動相三）方法開發(fā)的具體步驟四）梯度洗脫方法,一.HPLC的廣泛應用,據(jù)2004年統(tǒng)計，世界上化合物總數(shù)多達4700多萬種在全部有機化合物中僅有20左右的樣品適用于GC分析而HPLC可對80左右的有機化合物進行分離和分析,HPLC的廣泛應用,HPLC特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應用潛力。,HPLC的應用領(lǐng)域,在食品研究中的分析應用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸,HPLC的應用領(lǐng)域,在醫(yī)藥研究中分析應用藥物分析有USP、BP、CP等標準常用藥物研究中的應用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素類藥物研究中的應用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應用：光學異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強)醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。在獸藥研究中分析應用,HPLC的應用領(lǐng)域,在生物化學和生物工程中的應用氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)在精細化工分析中的應用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品,HPLC的應用領(lǐng)域,化妝品行業(yè)要控制和分析：防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；在公安、刑警破案工作需要投毒藥物、毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類和胺類的檢測,在無機離子分析中應用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析,二.方法開發(fā)的過程,Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.2,第一步干什么?,想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-儀器制造商的文獻，如Dionex,Waters對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品,分析時要了解哪方面的情況？,靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復雜?有多少組份要分析?對分析的精確度、準確度等有多高要求?是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?,分離(制備)時要了解哪方面的情況？,要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?是否需要保持生物活性?對分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?,使用文獻方法注意點,色譜柱填料的種類、品牌是否相同?注意文獻方法的流動相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）,一）選擇HPLC檢測器,對樣品有響應并有一個輸出信號應該提供在檢測器響應值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應該促進這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距,用于HPLC的檢測器,沒有任何一種單獨的檢測器可以適應所有的液相色譜分離！HPLC檢測器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型）對溶質(zhì)的物理或化學性質(zhì)響應，一般不反應流動相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測器（通用型）不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應（通用型）,理想的HPLC檢測器,高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性,靈敏度：信噪比,靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性,6:1,N,S,選擇液相色譜的檢測器,要考慮的因素：你要分離的化合物/樣品的化學特性化學結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測的需求,選擇液相色譜的檢測器,通用檢測器RIELSDMS靈敏度ugngpg線性范圍104否103流速敏感是否是溫度敏感是否否破壞性否是是,選擇性檢測器ABSFLECCondMS靈敏度ngpgfgpgpg線性范圍105103106105103流速敏感否否是是是溫度敏感否否是是是破壞性否否是否是,吸光度（UV/Vis）檢測原理,原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，AKCL優(yōu)點：1）對溫度和流速不敏感2）可用于梯度洗脫3）靈敏度較高，ng級檢測缺點：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì),吸光度（UV/Vis）檢測的應用,大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器-多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外/可見檢測器，25%是PDA）,背景吸收的影響,背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動相有紫外吸收,光電二極管矩陣（PhotoDiodeArray）,PhotoDiodeArray簡稱：PDA或DAD,光電二極管矩陣檢測器（PDA）的特點和用途,一種三維水平的吸光度檢測器-采集三維譜圖兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息在收集色譜圖的同時，得到光譜圖提供許多有用的功能-色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認-可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰-任意波長的色譜再處理-光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合,熒光（Fluorescence）檢測原理,原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達到激發(fā)態(tài)，當其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光優(yōu)點：熒光檢測器靈敏度高,pg級檢測缺點：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生,熒光檢測器原理,熒光檢測器的應用,環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥,氨基甲酸酯類殺蟲劑,黃曲霉毒素,多環(huán)芳烴（PAH）,維生素,示差折光（RefractiveIndex）檢測,示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀六十年代末、七十年代初）通常被認為是一種通用檢測器檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì)非特異性任何光學介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值,示差折光（RI）檢測的原理,原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣各組分濃度。優(yōu)點：通用型檢測器缺點：1）對溫度變化敏感2）不能用于梯度檢測3）靈敏度低，ug級檢測,返回,示差檢測器的應用,示差折光檢測器是通用型檢測器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以檢測特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物,例如糖類,醇類,酯類以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及復雜樣品純化,蒸發(fā)光散射（ELSD）原理,用氮氣把流動相吹成細霧狀流動相的液滴通過一個預加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比例關(guān)系,ELSD優(yōu)點及應用領(lǐng)域,通用型比流動相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測可以作梯度實驗；檢測下限可到納克級水平對環(huán)境條件不敏感；可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相應用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物,ELSD缺點,不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮氣或空氣）不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術(shù)蒸發(fā)出的溶劑要引到戶外或通風櫥里對揮發(fā)性化合物的檢測不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器,二）色譜基本分類,色譜基本分類：按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質(zhì)可以分為：1.分配色譜分配系數(shù)*2.親和色譜親和力3.吸附色譜-吸附力4.離子交換色譜離子交換能力5.凝膠色譜（體積排阻色譜）-分子大小引起的體積排阻,分配色譜,分配色譜分為：正相色譜：固定相（填料）為極性，流動相為非極性反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。用得最多，約占60-70%相對應的色譜柱：反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS）C8,C4,C3，苯基等正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團為-CN氰基，-NH2氨基等,分配色譜的分離機理,分配色譜概述,反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫,流動相極性,流動相洗脫強度,反相色譜最常用的流動相及其洗脫強度：水甲醇乙腈乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水”正相色譜最常用的流動相及其洗脫強度：正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇*應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法,流動相的選擇原則,樣品易溶，且溶解度盡可能大化學性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收*黏度低，流動性好*無毒或低毒，易于操作易于從其中回收樣品易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境,三）方法開發(fā)的具體步驟,先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標準品先用高強度的洗脫液調(diào)節(jié)k值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性通過改變流動相的pH值，使樣品成中性加入“對離子”，使樣品呈中性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度,反相色譜的方法開發(fā),開發(fā)過程實例色譜條件色譜柱：C18，4.6mm15mm流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度）舉例中用不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱流速：1ml/min樣品：對羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)對羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)對羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben),1.改變?nèi)萘恳蜃覭,譜圖,同樣強度的不同溶劑，改變了流動相值改變色譜柱,2.調(diào)節(jié)值改變選擇性,離子型化合物的色譜分離,離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性,3.離子抑制色譜,離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離使樣品成中性適用于弱酸性化合物的分離加入TFA,磷酸鹽等降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi),離子抑制色譜實例,而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。,對甲氧基苯甲酸,苯甲酸納,苯甲醛,三甲氧基-四羥基苯甲醛,離子抑制色譜的使用范圍,下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法”,4.離子對色譜法,在反相色譜流動相內(nèi)加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組份形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型季銨鹽、叔胺鹽（正離子），適用于弱酸烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負離子），適用于弱堿烷基長度不同，形成對離子的能力不同,離子對色譜機理,抗組胺及減充血劑藥物的分析,離子對色譜的應用,離子對色譜分析水溶性維生素,用離子對、還是用離子抑制方法？,方法開發(fā)的其他因素,流速對柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進樣量(濃度)對柱效的影響樣品的進樣體積對柱效的影響溶劑粘度對柱效的影響以上因素均影響分離度,色譜方法轉(zhuǎn)換,如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進樣量轉(zhuǎn)換流速,四）液相色譜方法開發(fā),梯度洗脫方法,在這一部分您將學習:,關(guān)于梯度洗脫過程及其優(yōu)點.如何優(yōu)化梯度分離.有關(guān)梯度分離的一些實用考慮.,液相色譜泵,穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準確及重現(xiàn)的自動溶劑混合準確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮滯后體積梯度分析更為關(guān)注目的：在任何情況下保持最高精度,梯度的洗脫方式,高壓梯度及低壓梯度,梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響,注意滯后體積包括進樣器、阻尼器、混合器及其管路,梯度滯后大小的影響,滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩