中華人民共和國國家標準010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù) of 華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布 2010布 2010施 010 I 前 言 本標準代替 品衛(wèi)生微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)。 本標準與 要修改如下： 修改了標準的中英文名稱； “第二法 大腸菌群平板計數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“ 15 150 刪除了“第三法 大腸菌群 試片法”。 本標準的附錄 A、附錄 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： T T B 010 1 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù) 1 范圍 本標準規(guī)定了食品中大腸菌群（ 數(shù)的方法。 本標準適用于食品中大腸菌群的計數(shù)。 2 術語和定義 腸菌群 在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 可能數(shù) 基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。 3 設備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下： 溫培養(yǎng)箱： 36 1 。 箱： 2 5 。 溫水浴箱： 46 1 。 平：感量 0.1 g。 質(zhì)器。 蕩器。 菌吸管： 1 度）、 10 0.1 度）或微量移液器及吸頭。 菌錐形瓶：容量 500 菌培養(yǎng)皿：直徑 90 或 色管或精密 紙。 落計數(shù)器。 4 培養(yǎng)基和試劑 桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ 湯：見附錄 A 中 010 2 綠乳糖膽鹽（ 湯：見附錄 A 中 晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ 見附錄 A 中 酸鹽緩沖液：見附錄 A 中 菌生理鹽水：見附錄 A 中 菌 1 附錄 A 中 菌 1 附錄 A 中 010 3 第一法 大腸菌群 數(shù)法 5 檢驗程序 大腸菌群。 圖1 大腸菌群 數(shù)法檢驗程序 6 操作步驟 品的稀釋 體和半固體樣品： 稱取 25 g 樣品 ,放入盛有 225 酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi) , 8000 r/10000 r/質(zhì) 1 2 放入盛有 225 酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 2 成 1:10 的樣品勻液。 體樣品：以無菌吸管吸取 25 品置盛有 225 酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。 品勻液的 應在 間，必要時分別用 1 1 節(jié)。 36 1 48h2148 h2 樣 25 g(品 +225 釋液，均質(zhì) 10 倍系列稀釋 選擇適宜 3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種 湯管 產(chǎn) 氣 不產(chǎn)氣 湯不產(chǎn)氣 產(chǎn) 氣 大腸菌群陽性 大腸菌群陰性 查 報告結(jié)果 010 4 1 菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 管壁緩緩注入 9 酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支 1 菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。 據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用 1 支 1 菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 發(fā)酵試驗 每個樣品，選擇 3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種 3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ 湯，每管接種 1接種量超過 1 用雙料 36 1 培養(yǎng) 24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生， 24 h2 未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h2 h，產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 發(fā)酵試驗 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的 環(huán)， 移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯 （ 管中， 36 1 培養(yǎng) 48 h2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。 腸菌群最可能數(shù)（報告 按 索 附錄 B），報告每 g（ 品中大腸菌群的 第二法 大腸菌群平板計數(shù)法 7 檢驗程序 大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗程序見圖 2。 圖2 大腸菌群平板計數(shù)法檢驗程序 8 操作步驟 檢 樣 25 g(品 +225 釋液，均質(zhì) 10 倍系列稀釋 36 118h24湯36 124h48 個 3 個適宜稀釋度的樣品勻液，接種 板 010 5 品的稀釋 按 板計數(shù) 選取 2個 3個適宜的連續(xù)稀釋度 , 每個稀釋度接種 2個無菌平皿，每皿 1 時 取 1 及時將 15 20 6 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ 傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加 3 4 轉(zhuǎn)平板，置于 36 1 培養(yǎng) 18 h 24 h。 板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在 15 150 間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為 0.5 更大。 實試驗 從 板上挑取 10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于 湯管內(nèi)， 36 1 培養(yǎng) 24 h 48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡 湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。 腸菌群平板計數(shù)的報告 經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以 乘以稀釋倍數(shù)，即為每 g（ 品中大腸菌群數(shù)。例： 10 00個典型和可疑菌落，挑取其中 10個接種 證實有 6個陽性管， 則該樣品的大腸菌群數(shù)為： 1006/10104/g（ =05 g（ 010 6 附錄A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 桂基硫酸鹽胰蛋白胨（湯 分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（ g 磷酸二氫鉀（ g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL 制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) 裝到有玻璃小倒管的試管中，每管 10 121 高壓滅菌 15 綠乳糖膽鹽（湯 分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛膽粉（ 液 200 綠水溶液 13.3 餾水 800 mL 制法 將蛋白胨、乳糖溶于約 500 入牛膽粉溶液 200 20.0 00 節(jié) 用蒸餾水稀釋到 975 節(jié) 加入 綠水溶液 13.3 蒸餾水補足到 1 000 棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管 10 121 高壓滅菌 15 晶紫中性紅膽鹽瓊脂（分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化鈉 5.0 g 膽鹽或 3號膽鹽 1.5 g 中性紅 g 結(jié)晶紫 g 瓊脂 15 g 18 g 蒸餾水 1 000 mL B 010 7 法 將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調(diào)節(jié) 沸 2 培養(yǎng)基冷卻至 45 50 傾注平板。使用前臨時制備，不得超過 3 h。 酸鹽緩沖液 分 磷酸二氫鉀（ 34.0 g 蒸餾水 500 mL 制法 貯存液：稱取 34.0 00 大約 175 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蒸餾水稀釋至 1 000 稀釋液：取貯存液 蒸餾水稀釋至 1 000 裝于適宜容器中， 121 高壓滅菌 15 無菌生理鹽水 成分 氯化鈉 8.5 g 蒸餾水 1 000 制法 稱取 000 121 高壓滅菌 15 1 成分 40.0 g 蒸餾水 1000 制法 稱取 40 000 121 高壓滅菌 15 1 成分 90 餾水 1 000 制法 移取濃鹽酸 90 蒸餾水稀釋至 1 000 121 高壓滅菌 15 010 8 附錄B （規(guī)范性附錄） 大腸菌群最可能數(shù)（索表 大腸菌群最可能數(shù)（索表 每 g（ 樣中大腸菌群最可能數(shù)（ 檢索見表 腸菌群最可能數(shù)（索表 陽性管數(shù) 95%可信限 陽性