中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)010中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布 2010布 2010施食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 of 12in 010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 幼兒食品和乳粉 維生素 本標(biāo)準(zhǔn)與 要變化如下： 標(biāo)準(zhǔn)名稱改為嬰幼兒食品和乳品中維生素 本標(biāo)準(zhǔn)附錄 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： 413 010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用萊士曼氏乳酸桿菌（ 維生素 量測(cè)定出試樣中維生素 測(cè)定用培養(yǎng)基中供給除維生素 樣微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的透光率就會(huì)同標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液及未知待測(cè)溶液中維生素 以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的透光率相對(duì)于各濃度水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出試樣中維生素 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 6682 規(guī)定的二級(jí)水。 株：萊士曼氏乳酸桿菌（ 830。 生素 12或 準(zhǔn)品：分子式 度 99%。 養(yǎng)基 酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。 酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：見附錄 A。 生素 附錄 A。 注： 一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。 g/L 氯化鈉溶液（生理鹽水） 稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 中，分裝于具塞試管，每管 10 121 滅菌 15 醇溶液：體積分?jǐn)?shù)為 25 %。 水磷酸氫二鈉（ 水偏重亞硫酸鈉（ 檬酸（含一個(gè)結(jié)晶水）（ 2O）。 準(zhǔn)溶液的制備 生素 10 g /精確稱取維生素 用乙醇溶液（ 容至維生素 0 g / 010 2 生素 100 ng/用乙醇溶液（ 5.0 生素 容至 500 生素 1 ng/用乙醇溶液（ 5.0 生素 容至 500 準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取兩個(gè) 5 生素 250 500量瓶中，用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為 ng/濃度溶液的濃度為 ng/ 注：所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲(chǔ)存于冰箱內(nèi)。 存期三個(gè)月， 用前配制。 5 儀器和設(shè)備 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 平：感量為 0.1 5.2 ：精度 光光度計(jì)。 旋混合器。 心機(jī)：轉(zhuǎn)速 2000 轉(zhuǎn) /分鐘。 溫培養(yǎng)箱： 36 1 。 箱： 2 5 。 菌吸管： 10 0.1 度）或微量移液器和吸頭。 口分液器： 0 10 形瓶： 200 量瓶（ A 類）： 100 250 500 刻度移液管（ A 類）：容量 5 斗：直徑 90 量濾紙：直徑 90 管： 18 180 注： 準(zhǔn)備玻璃儀器時(shí)， 使用活性劑對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗， 清洗之后要求在 200 干熱 2 h。 6 分析步驟 試菌液的制備 萊士曼氏乳酸桿菌 （ 830） 的凍干菌株 （ 活化后， 接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （ ， 36 1 培養(yǎng) 24 h。再轉(zhuǎn)種 2 代 3 代來增強(qiáng)活力。置 2 5 冰箱保存?zhèn)溆?。?15 d 轉(zhuǎn)種一次。 活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（ ， 36 1 培養(yǎng) 18 h 24 h，以 2000 轉(zhuǎn) /分鐘離心 2 3 去上清液，加入 10 理鹽水（ 混勻，再離心 2 3 去上清液，再加入 10 理鹽水（ 混勻。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 理鹽水（ 混勻。吸適量該菌懸液于 10 理鹽水（ ，混勻制成測(cè)試菌液。 分光光度計(jì)（ 以生理鹽水（ 空白，于 550 長(zhǎng)下測(cè)測(cè)試菌液（ 透光率，使其透光率在 60 % 80 %之間。 樣的處理 010 3 取無(wú)水磷酸氫二鈉（ 1.3 g，無(wú)水偏重亞硫酸鈉（ 1.0 g，檸檬酸（含一個(gè)結(jié)晶水） （ .2 g，用 100 溶解。 一定量的樣品 (精確到 g)， 含維生素 0 100 用 10 上述溶液 （ 合后，再加 150 ，于 121 水解 10 卻后調(diào) 用水定容至 250 濾。移取濾液 5 入水 20 30 水定容至 100 終溶液中維生素 ng/ng/重亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度小于 mg/ 準(zhǔn)曲線的制作 按表 1 順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（ 維生素 培養(yǎng)管中，一式三份。 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試管號(hào) 2 4 6 8 10 水（ 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 ng/ 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 ng/ 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 測(cè)液的制作 按表 2 順序加水、樣品溶液（ 維生素 培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。 表2 待測(cè)液的制作 試管號(hào) 1 2 3 4 水（ 4 3 2 1 待測(cè)液（ 1 2 3 4 培養(yǎng)基（ 5 5 5 5 菌 將 所有的試管蓋上試管帽， 121 滅菌 5 品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行滅菌） 。 種 將上述試管迅速冷卻至 30 以下。用滴管或移液器向上述試管中各滴加 1 滴（約 50 L）測(cè)試菌液（ （其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中空白 外） 。 養(yǎng) 將試管放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)， 36 1 培養(yǎng) 19 h 20 h。 定 培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)每支試管進(jìn)行目測(cè)檢查，未接種試管 培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則測(cè)定無(wú)效。 接種空白管做對(duì)照，測(cè)定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的透光率， 2 h 后重新測(cè)定。兩次結(jié)果透光率差值若小于 2 %，則取出全部檢驗(yàn)管測(cè)其透光率。 未接種空白試管（ 空白，將分光光度計(jì)透光率調(diào)到 100 %（或吸光度為 0），讀出接種空白試管（ 讀數(shù)。再以接種空白試管（ 空白，調(diào)節(jié)透光率為 100 %（或吸光度為 0），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度）。 010 4 渦旋混合器（ 分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)為 550 讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時(shí)間要相同。以維生素 光率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 據(jù)待測(cè)液的透光率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測(cè)液中維生素 根據(jù)稀釋因子和稱樣量計(jì)算出試樣中維生素 光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S 3 S 10 范圍的試樣管要舍去。 每個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的試管，用每支試管的透光率計(jì)算每毫升該編號(hào)待測(cè)液維生素 計(jì)算該編號(hào)待測(cè)液的維生素 支試管測(cè)得的該濃度不得超過該平均值的 15 %，超過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的總管數(shù)的 2/3，用于計(jì)算試樣含量的數(shù)據(jù)是不充分的 , 需要重新檢驗(yàn)。如果符合要求的管數(shù)超過原來管數(shù)的 2/3，重新計(jì)算每一編號(hào)的有效試樣管中每毫升測(cè)定液中維生素 此平均值計(jì)算全部編號(hào)試樣管的總平均值為用于計(jì)算試樣中的維生素 注： 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，既可讀取透光率（ T %） ，也可讀取吸光度（ A） 。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中維生素 (1) 計(jì)算： 1001000= (1) 式中： X試樣中維生素 位為微克每百克表示（ g/100 g） ； 計(jì)算所得的總平均值，單位為納克（ ； m 試樣的質(zhì)量，單位為克（ g） ； f稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。 9 其他 本標(biāo)準(zhǔn)檢出限為 g/100g。 010 5 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 分 番茄汁 100 號(hào)蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，瓊脂 14.0 g，水 1000 25 5 ）。 法 先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) 加入瓊脂，加熱煮沸至完全溶解?；旌暇鶆蚝蠓盅b試管，每管 10 121 高壓滅菌 15 用。 酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 分 番茄汁 100 號(hào)蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，水 1000 25 5 ）。 法 先將上述成分（ 解于水中，調(diào)節(jié) 熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 121 高壓滅菌 15 用。 生素 成分 無(wú)維生素酸水解酪蛋白 15.0 g，葡萄糖 40.0 g，天門冬酰胺 0.2 g，醋酸鈉 20.0 g，抗環(huán)血酸 4.0 g，.4 g， .4 g，硫酸腺嘌呤 20.0 酸鳥嘌呤 20.0 嘧啶 20.0 嘌呤20.0