項(xiàng)目名稱： 免疫相關(guān)重要蛋白質(zhì)的生物學(xué)研究 首席科學(xué)家： 張學(xué)敏 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 總后勤部衛(wèi)生部 一、研究內(nèi)容 針對免疫識別、免疫應(yīng)答與免疫耐受的主要科學(xué)問題，研究從免疫細(xì)胞對抗原的識別至產(chǎn)生效應(yīng)的整個過程所涉及免疫細(xì)胞（ T、 B、 系列蛋白質(zhì)分子及其在免疫過程中的功能，從分子水平闡明機(jī)體產(chǎn)生各種正、負(fù)免疫應(yīng)答的細(xì)節(jié)和關(guān)鍵點(diǎn)，不同應(yīng)答效應(yīng)及其調(diào)控的機(jī)制，進(jìn)而掌握免疫過程及其調(diào)節(jié)的特點(diǎn)和規(guī)律。 1. 與免疫識別相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。研究 現(xiàn)天然免疫 “ 泛特異性識別 ” 的生物學(xué)特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)信息證據(jù)，發(fā)現(xiàn)新的天然免疫識別受體（或新功能）；研究以 析 討自主發(fā)現(xiàn)的天然識別受體 2. 與免疫應(yīng)答相關(guān) 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。揭示在腫瘤發(fā)生早期天然免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化及對腫瘤特應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活作用及其作用的分子機(jī)理。探討 配體介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境是否集聚處女 定 究 胞與 析 作用于激活期還是效應(yīng)期，闡明 析穿孔素及 “ 孤兒 ” 顆粒酶的晶體結(jié)構(gòu)，闡明穿孔素和 “ 孤兒 ”顆粒酶在 析自主發(fā)現(xiàn) 過 討 細(xì)胞、 NK 3. 與免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。探討 15個自主發(fā)現(xiàn)的新分子以及 5個關(guān)注的分子在免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受中的作用和分子機(jī)制，研究不同的分子在不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控模式，重點(diǎn)關(guān)注這些分子在 顧重要的分子在 細(xì)胞抗原受體 (的作用機(jī)制，同時研究這些分子在免疫調(diào)節(jié)中相互作用分子，并且建立動物模型，探討這 些分子在感染、抗原特異性免疫應(yīng)答以及免疫耐受中的作用。 4. 參與免疫信號通路調(diào)控的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。應(yīng)用最新質(zhì)譜技術(shù)等手段研究 導(dǎo)的 路激活過程中重要蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成及活化機(jī)制，并探討復(fù)合體關(guān)鍵組分對該通路的調(diào)控機(jī)制；深入研究 號通路的機(jī)制；深入研究 討 模型研究導(dǎo)致 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 從我國蛋白質(zhì)科學(xué)研究的重大需求以及挖掘重要免疫相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理等重大科學(xué)問題出發(fā)，建立基于蛋白質(zhì)科學(xué)的免疫學(xué)研究新模式，即應(yīng)用蛋白質(zhì)及其復(fù)合體結(jié)構(gòu)與功能研究的方法，深入發(fā)掘并解析免疫過程中新的蛋白質(zhì)分子、相互作用網(wǎng)絡(luò)、泛素化等翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其定位規(guī)律，在免疫識別、免疫應(yīng)答與耐受和免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)理研究上取得重要突破，為攻克感染、腫瘤或自身免疫疾病提供堅實(shí)的理論基 礎(chǔ)，為相應(yīng)的干預(yù)治療提供新的策略和新的靶點(diǎn)。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1、 通過質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定免疫識別、應(yīng)答活化及調(diào)節(jié)過程中重要信號通路中的蛋白質(zhì)復(fù)合體，發(fā)現(xiàn) 10外，揭示已有工作基礎(chǔ)的 15個免疫相關(guān)新蛋白質(zhì)分子在免疫識別、免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受中的作用和分子機(jī)制，為免疫相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供 2 2、 較完整闡明 2現(xiàn)并解析 1個新的天然免疫受體調(diào)控蛋白的功能結(jié)構(gòu)特征；解析 1個天然免疫識別受體的新結(jié)構(gòu)或天然免疫 識別受體相關(guān)的復(fù)雜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；闡明 1個基于天然免疫識別受體的免疫突觸的形成結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成。 3、 揭示在腫瘤發(fā)生早期天然免疫對獲得性免疫的激活作用機(jī)制，探明細(xì)胞毒性 示抗腫瘤免疫效應(yīng)的功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，加深對免疫系統(tǒng)排斥腫瘤機(jī)理的認(rèn)識。 4、 發(fā)表高水平研究論文 30篇以上，其中 0論文 3篇， 0論文 5篇。獲得一批高水平的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的技術(shù)成果，申請專利 10項(xiàng)以上。 5、 培養(yǎng)一批在免疫學(xué)和蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域具有國際競爭力的優(yōu)秀中青年科學(xué)家和后備人才；造 就一支跨學(xué)科、跨領(lǐng)域、精誠合作、團(tuán)結(jié)奮進(jìn)的科研隊伍。 三、研究方案 學(xué)術(shù)思 路 對 免疫識別 、 免疫應(yīng)答 /耐受 、 免疫調(diào)節(jié)過程 中的 的極其復(fù)雜的免疫蛋白質(zhì)系統(tǒng)，目前缺乏整體了解，特別是對 一些重要 蛋白質(zhì)在空間和時間上的表達(dá) 、 修飾 、 定位，以及相互作用和在執(zhí)行功能上的相互關(guān)系了解甚少。 本項(xiàng)目 以免疫識別 耐受 以 有較好研究基礎(chǔ)的免疫細(xì)胞為主要模型 ， 通過蛋白質(zhì)技術(shù) 發(fā)現(xiàn)新 的 免疫 相關(guān)蛋白質(zhì)及其復(fù)合體， 解析結(jié)構(gòu)信息，探討其在 免疫識別 、 免疫應(yīng)答 /耐受 、 免疫調(diào)節(jié)過程 中的功能 ；分析 磷酸化、泛素化等翻譯后修飾 對其功能的影響， 并 揭示免疫 信號通路 的 調(diào)控 機(jī)制。 本項(xiàng)目還將深入研究已 自主發(fā)現(xiàn)的 系列 新分子以及 其它重要蛋白質(zhì) 在免疫 過程 中的 功能 和機(jī)制 。 以上努力，使我們可能解決免疫學(xué)中一系列亟待突破的重要科學(xué)問題： 1） 天然免疫識別 “泛特異性 ”的生物學(xué)特點(diǎn)及 識別受體的 結(jié)構(gòu) 與功能； 2） 天然免疫對獲得性免疫細(xì)胞活化的分子機(jī)理和抗腫瘤 分子機(jī)制 ; 3） 免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的分子機(jī)制，特別是免疫應(yīng)答過程中的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制 ; 4）參與 免疫調(diào)節(jié) 重要信號通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)與功能揭示。 這些重 要 免疫學(xué)科學(xué)問題的 研究一旦有所突破，將對人類疾病的防治帶來巨大益處。 技術(shù)途徑 1. 表達(dá)模式研究 ：所需使用的免疫細(xì)胞一方面使用既有細(xì)胞系，另一方面通過原代分離和體外培養(yǎng)產(chǎn)生。 2. 免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)研究 3. 信號傳導(dǎo)通路研究 4. 相互作用分子研究 四、年度計劃 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 選擇一批受體結(jié)構(gòu)域基因片段進(jìn)行克隆表達(dá) ；進(jìn)行 天然免疫識別相關(guān)蛋白的基因表達(dá)、蛋白純化和批量制備 。 2. 構(gòu)建不具活性的穿孔素前體 ； 分離鑒定與 顆粒酶 K 相作用的底物 ；表達(dá)顆粒酶 H 和 M； 表達(dá)重組行結(jié)晶條件摸索和高質(zhì)量結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，衍射分析 3. 初步完成所關(guān)注免疫分子在免疫識別以及免疫調(diào)節(jié)中的表達(dá)調(diào)控模式，完成一些重要表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定以及一些細(xì)胞系的建立鑒定 。 4. 建立激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路細(xì)胞模型 ；觀察 活信號 通路 的動態(tài)變化過程情況 ； 研究 相互作用及其動態(tài)變化 ；分析 酸化水平調(diào)控以及激酶活性。 5. 探討 徑發(fā)揮抑制作用所依賴的關(guān)鍵 結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵氨基酸 ； 探討 互作用 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制 ； 檢測 1. 建立天然免疫受體表達(dá)的研究平臺和相關(guān)技術(shù)； 1 2. 表達(dá)具生物活性的穿孔素及其功能片段 ； 分離鑒定顆粒酶 K 的作用底物 ； 確定 的結(jié)構(gòu)模型。 3. 完成 10建原核和真核等表達(dá)載體30立穩(wěn)定干擾或過表達(dá)細(xì)胞系 20 4. 建立 活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路細(xì)胞模型 ； 明確 5. 明確 揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) ；明確 互作用 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制 ； 明確 6. 發(fā)表 第 二 年 1. 天然免疫識別相關(guān)蛋白的克隆、表達(dá)、純化、單抗制備； 初步 研究 以開展天然免疫識別相關(guān)蛋白受體 /配體的相互作用研究。 2. 解析穿孔素及其功能片段的結(jié)構(gòu) ；1. 獲得 1步獲得以 得 1個天然免疫受體蛋白微晶 。 2. 獲得穿孔素活性片段的晶體結(jié) 構(gòu)；年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 研究顆粒酶 對細(xì)胞的殺傷效應(yīng)及殺傷機(jī)制 ； 探索顆粒酶 的結(jié)晶條件，進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析。 3. 檢測 細(xì)胞和 P 實(shí)驗(yàn)，差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 4. 完成所關(guān)注免疫分子對免疫細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，初步完成相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路的研究 。 5. 檢 測 病毒及 :C)激活的 錄活性 、 響并進(jìn)一步驗(yàn)證 ； IB磷酸化水平以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的調(diào)控分析。 6. 檢測 制 徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白 ； 探討 制 徑所依賴的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵氨基酸 ； 探討互作用在腫瘤和自身免疫病中的可能應(yīng)用。 確定 顆粒酶 在 確定 和 胞的功能影響 ； 明確和 3. 完成 8免疫分子對樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌等基本免疫學(xué)功能的影響研究；完成 8免疫分子在免疫細(xì)胞內(nèi)在受到 處理后信號傳導(dǎo)通路 變化的檢測 。 4. 質(zhì)譜鑒定刺激不同時間形成的 初步 明確 5. 揭示 徑抑制作用的機(jī)理 ； 明確 6. 發(fā)表 第 三 年 1. 摸索天然免疫識別相關(guān)蛋 白晶體生長條件；制備單抗和小分子靶點(diǎn)探針；驗(yàn)證以 核心 突觸蛋白的核心成分并對其進(jìn)行成像分析； 2. 天然免疫識別相關(guān)蛋白的突觸形成和 測定穿孔素對細(xì)胞的損傷作用 ； 分析線粒體膜通透性 、 活性氧自由基 、促凋亡因子 等 的 變化； 激活 用 過繼轉(zhuǎn)移到荷瘤鼠，分析這些細(xì)胞的增殖作用 ； 驗(yàn)證 1. 力爭獲得 1 個能夠適合于 X 射線晶體衍射的晶體 ； 獲得 2點(diǎn)探針；明確核心的突觸蛋白的成分及其分布； 2. 研究穿孔素對漿膜及對線粒體的損傷作用 ； 確定 系； 明確和 3. 明確 8免疫分子的基本信號傳導(dǎo)通路，初步確立 6 4. 初步揭示 控 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 3. 檢測 和 通過 感染清除中的作用。 4. 驗(yàn)證復(fù)合體成分 ； 檢測 酸化、二聚化以及入核能力的影響 ； 檢測 否參與調(diào)控 分析已知 控子在 酶活性中的作用模式。 5. 探討 達(dá)紊亂 與腫瘤和自身免疫病 發(fā)病機(jī)制 的關(guān)系； 探討 探討 5. 了解 達(dá)紊亂與腫瘤和自身免疫病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系 ； 明確 明確 的 結(jié)構(gòu)突變。 6. 發(fā)表 申請專利 1項(xiàng)。 第 四 年 1. 研究 2. 觀察穿孔素或 /和顆粒素 作用下，顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞的部位 ； 分析2胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生 ； 研究 利用 3. 建立相關(guān)重點(diǎn)關(guān)注基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，初步探討所關(guān)注免疫分子在疾病模型中的作用以及其體內(nèi)介導(dǎo)免疫識別、免疫調(diào)節(jié)、免疫耐受的作用，驗(yàn)證這些分子與相互作用分子的相互調(diào)節(jié) 。 4. 檢測 況； 研究 培養(yǎng)上清中病毒滴度變化的 影響； 分離原代巨噬細(xì)胞，檢測 培養(yǎng)上清中泌量的變化 ； 分1. 完成 1 個免疫受體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)測定，收集復(fù)合物晶體的衍射數(shù)據(jù)；初步明確 初步明確天然免疫識別相關(guān)蛋白在腫瘤免疫逃逸中作用； 2. 探明穿孔素如何介導(dǎo)顆粒酶進(jìn)入腫瘤靶細(xì)胞 ； 明確 3. 建立 8基因小鼠動物模型，了解 4一步確認(rèn)免疫分子的相互作用蛋白質(zhì)和作用的效應(yīng)和機(jī)制 。 4. 初步 闡明新的 合體成分的功能及其調(diào)控機(jī)制 ；初步 闡明控 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 析 腫瘤壞死因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控 作用 。 5. 探討 途徑和 徑 的高水平活化。 5. 了解 達(dá)紊亂與腫瘤和自身免疫病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系 ； 明確 達(dá)異常 與 促進(jìn)途徑和 水平活化的 關(guān)系 。 6. 發(fā)表 文 5 ， 申請專利2第 五 年 1. 多個免疫受體蛋白及其復(fù)合物的晶體生長及解析；利用單抗、小分子靶點(diǎn)探針等研究受體 /配體的相互作用。 2. 研究 胞與 導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞排斥 的關(guān)系； 分析