項目名稱： 牙發(fā)生發(fā)育分子機理及牙齒再生研究 首席科學(xué)家： 田衛(wèi)東 四川大學(xué) 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 教育部 四川省科技廳 一、研究內(nèi)容 關(guān)鍵科學(xué)問題 1 闡明牙齒發(fā)育過程中上皮 2 探討牙源性上皮及間充質(zhì)干細胞的發(fā)育起源及牙向分化機制； 3 探索用于牙再生種子細胞（上皮及間充質(zhì)細胞）的替代細胞； 4 重建牙再生的微環(huán)境，在大動物體內(nèi)用牙源性干細胞及非牙源性成體干細胞復(fù)合生物支架材料進行牙再生研究。 主要研究內(nèi)容 本項目是圍繞牙齒發(fā)育和再生進行相關(guān)的基礎(chǔ)研究，首先要研究并明確牙齒發(fā)生、發(fā)育的分子調(diào)控機理，為全牙再生提供理論依據(jù)和實驗指導(dǎo)，并為牙發(fā)育和牙再生相關(guān)干細胞的分化調(diào)控及其機理研究奠定基礎(chǔ)；同時， 研制適于牙齒各種組織成份構(gòu)建的生物支架材料，為實現(xiàn)牙齒再生奠定實驗基礎(chǔ) ；上述各研究是有機結(jié)合、循序漸進的系統(tǒng)，其最終目標是明確牙齒發(fā)育機理并實現(xiàn)牙的再生。 本項目 包含以下主要研究內(nèi)容： 1 牙發(fā)育中上皮 在建立牙胚上皮 質(zhì)離解重組體外培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上， 應(yīng)用基因敲除、轉(zhuǎn)基因和 皮和間充質(zhì)各自 的作用機制；觀察不同外部微環(huán)境對于牙胚上皮 和間充質(zhì)干細胞的影響。 本課題研究目標： 通過對牙發(fā)生發(fā)育基因調(diào)控機制的研究，發(fā)現(xiàn)牙胚上皮和間充質(zhì)中起關(guān)鍵作用的信號分子；明確牙胚上皮和間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的分子機制；尋獲牙胚中干細胞和祖細胞誘導(dǎo)分化的微環(huán)境，進而獲得牙胚發(fā)育形態(tài)發(fā)生期間的分子作用機制。 2 牙源性干細胞成牙分化機制研究 牙發(fā)育過程中的各個階段理論上都存在牙源性干細胞，這些干細胞遵循發(fā)育程序和機理向進行分化直至形成牙齒，在成體牙中，有些牙源性干細胞如牙髓干細胞和牙周膜干細胞等得以部分保留。本課題擬對牙源性干細胞牙向分化的分子機制進行研究，并對牙源性干細胞的特異性調(diào)控因子、定向分化誘導(dǎo)技術(shù)體系和成牙能力等關(guān)鍵問題進行研究，以進一步闡明其在牙齒發(fā)生發(fā)育中的作用，并以此作為理論基礎(chǔ)指導(dǎo)牙再生研究。 本課題研究目標： 通過對牙源性干細胞發(fā)育起源及牙向分化的研究，探討不同發(fā)育時期的牙源性干細胞的基因差異表達、成牙分化能力、分子調(diào)控機制等，進一步闡明牙發(fā)育過程中牙源性干細胞牙向分化機制。 3 用 于牙再生的上皮與間充質(zhì)細胞來源的研究 進行牙齒再生研究必須具有再生的核心元素即種子細胞。因此，該課題擬對非牙源性成體干細胞的牙向誘導(dǎo)分化進行研究，利于將來控制這些干細胞向成牙種子細胞的定向分化，為牙齒再生提供種子細胞。 本課題研究目標： 明確多種非牙源性干細胞和 胞的成牙分化潛能，建立非牙源性干細胞和 胞牙向分化的誘導(dǎo)體系，探索可用于牙再生種子細胞（上皮及間充質(zhì)細胞）的替代細胞。 4 基于牙齒發(fā)育原理的牙齒構(gòu)建與再生 要形成在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上類似于天然牙的再生牙齒是我們的最終目標。本課題擬利用 牙 發(fā)生發(fā)育的原理，重建牙再生的微環(huán)境， 探討生物支架材料的成份和性能對 牙源性干細胞及非牙源性成體干細胞 的生長和牙向分化影響，并 進行種子細胞 /支架材料在不同微環(huán)境下的構(gòu)建和大動物體內(nèi)牙再生研究， 闡明牙再生相關(guān)機制。 本課題研究目標： 基于牙發(fā)育中上皮 建牙再生的微環(huán)境，研制出適宜牙再生的生物支架材料，用牙源性干細胞及非牙源性成體干細胞作為種子細胞復(fù)合生物支架材料在大動物體內(nèi)實現(xiàn)牙再生，并明確牙再生相關(guān)機理。 二、預(yù)期目標 項 目總體目標 圍繞口腔醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的重大科學(xué)問題，闡明牙 發(fā)生發(fā)育過程中上皮立牙源性和非牙源性干細胞牙向 誘導(dǎo)分化體系，并基于牙發(fā)育機理和牙再生微環(huán)境的研究探索牙齒再生，重點研究牙根再生和生物性牙根，為臨床牙齒缺失修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。通過本項目的研究，搭建牙發(fā)育和牙再生研究平臺， 培養(yǎng)和建立一支學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強的研究人才隊伍 ， 使我國在相關(guān)領(lǐng)域的 研究 達到 國際 先進水平。 5年具體預(yù)期目標及考核指標 1、通過對牙發(fā)生發(fā)育基因調(diào)控機制的研究，發(fā)現(xiàn)牙胚上皮和間充質(zhì)中起關(guān)鍵作用的信號分子；明確牙胚上皮和間充質(zhì)相互誘導(dǎo) 的分子機制；尋獲牙胚中干細胞和祖細胞誘導(dǎo)分化的微環(huán)境，進而獲得牙胚發(fā)育形態(tài)發(fā)生期間的分子作用機制。 2、通過對牙源性干細胞發(fā)育起源及牙向分化的研究，探討不同發(fā)育時期的牙源性干細胞的基因差異表達、成牙分化能力、分子調(diào)控機制等，進一步闡明牙發(fā)育過程中牙源性干細胞牙向分化機制。 3. 明確多種非牙源性干細胞和 立非牙源性干細胞和 索可用于牙再生種子細胞（上皮及間充質(zhì)細胞）的替代細胞 。 4 基于牙發(fā)育中上皮 建牙再生的微環(huán)境，研制出適宜牙 再生的生物支架材料，用牙源性干細胞 及非牙源性成體干細胞作為種子細胞復(fù)合生物支架材料在大動物體內(nèi)進行牙再生研究，重點研究牙根再生和生物性牙根，并明確牙再生相關(guān)機理。 5發(fā)表具有較高影響因子的 0 40篇；申請發(fā)明專利 5 10項；培養(yǎng)博士后 10 20人，博士 40 60人，碩士 20 40人；爭取 1 2人獲得全國百篇優(yōu)秀博士論文；吸引國外優(yōu)秀的學(xué)者和留學(xué)博士回國工作。 三、研究方案 總體研究方案 進行牙齒再生，首先必須了解牙齒生長發(fā)育中上皮 明牙源性和非牙源性干細胞定向分 化誘導(dǎo)及其機制，并解決牙再生微環(huán)境和種子細胞來源等關(guān)鍵問題，因此，本項目 總體方案如下： 首先明確牙發(fā)生發(fā)育中上皮 明確牙源性干細胞成牙分化機制 ； 尋找牙再生種子細胞來源，進行非牙源性干細胞牙向分化研究 ； 基于牙齒發(fā)育原理在大動物體內(nèi)進行牙再生研究 ，重點研究牙根再生和生物性牙根。 技術(shù)路徑 創(chuàng)新點和特色 1 理論創(chuàng)新 ：本項目針對牙齒發(fā)育機制和牙再生微環(huán)境等關(guān)鍵科學(xué)問題進行研究，有望 闡明牙發(fā)生發(fā)育過程中上皮 出新的理論，發(fā)現(xiàn)新的關(guān)鍵調(diào)控基因； 明確微環(huán)境對牙再生的影響；探索出牙再生種子細胞新的來源及其牙向誘導(dǎo)分化體系。 以上研究均為國內(nèi)外前沿研究，為建立牙再生新理論和新技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)，具有原始創(chuàng)新性。 2 技術(shù)創(chuàng)新： 本項目將首次建立牙齒再生的微環(huán)境體系；研制出適用于牙再生的生物支架材料；利用成牙相關(guān)干細胞重建具有發(fā)育能力的牙胚；在大型動物（小型豬）進行牙再生研究。在技術(shù)上具有首創(chuàng)性。 3 研究特色： 通過對牙齒發(fā)育過程中上皮 為機體其他器官發(fā)育與再生提供科學(xué)依據(jù)。利用小型豬這種大動物進行牙再生研究， 重點研究牙根 再生和生物性牙根， 有望為臨床應(yīng)用 奠定基礎(chǔ) 。 可行性分析 本項目組在牙齒生長發(fā)育及再生領(lǐng)域有雄厚的研究基礎(chǔ)，基本包括了國內(nèi)牙齒發(fā)育與再生及組織工程領(lǐng)域的重要研究團隊，已獲得大量的重要研究成果，論文發(fā)表于 雜志上。 1 理論和方法可行 ： 上皮 源性上皮與牙源性或非牙源性間充質(zhì)干細胞復(fù)合形成牙齒樣器官，以及非牙源性上皮表達牙源性上皮誘導(dǎo)信號的研究成果為我們在非牙源性細胞中找尋細 胞來源提供了有力的理論依據(jù)。在適宜的誘導(dǎo)條件下，非牙源性的表皮干細胞和間充質(zhì)干細胞可分化為具有成牙能力的細胞。重組技術(shù)是研究機體發(fā)育中多種組織相互作用、相互誘導(dǎo)的重要方法，牙齒再生研究采用重組技術(shù)已獲得不少可喜的成果。所以將成牙相關(guān)干細胞應(yīng)用于牙齒再生研究顯示了較強的理論可行性。 2 有前期研究工作基礎(chǔ)： 本 項目組 在牙齒發(fā)生發(fā)育研究領(lǐng)域具有較好的研究基礎(chǔ)，從牙發(fā)生發(fā)育的各個階段，系統(tǒng)全面地探討了多種信號通路及關(guān)鍵基因在牙發(fā)育中的作用；本項目組已成功掌握牙胚體外離解重組的技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)牙胚間充質(zhì)的完整性在維持牙 胚的發(fā)育方面起了關(guān)鍵的作用；前期關(guān)于小型豬牙齒生長發(fā)育組織學(xué)圖譜已基本建成，現(xiàn)正嘗試進行小型豬牙胚的體外培養(yǎng)。 通過對牙再生的研究發(fā)現(xiàn)牙胚間充質(zhì)的完整性在控制牙外形的正確性上起到至關(guān)重要的作用，在牙周及生物牙根再生領(lǐng)域已有多項突破性成果，首先分離牙髓干細胞、牙周膜干細胞和脫落乳牙干細胞，相關(guān)成果發(fā)表在國際著名雜志。在小鼠體內(nèi)已成功再生生物牙根，在全牙再生及牙上皮和間充質(zhì)干細胞領(lǐng)域也已有扎實的基礎(chǔ)，將牙上皮和間充質(zhì)細胞重組再植于動物體內(nèi)獲得一個類似全牙的組織，初步研究表明骨髓間充質(zhì)干細 胞等非牙源性成體干細胞可以作為牙再生的種子細胞。 此外，本項目組曾承擔(dān)“ 973” 計劃前期專項研究、“ 863”計劃”重大專項、國家自然科學(xué)基金等多項相關(guān)的國家科研計劃，為本研究提供了扎實的研究基礎(chǔ)。 3 實驗條件有保障： 本項目組在牙齒發(fā)育生物學(xué)和牙齒組織工程研究方面已建立了相應(yīng)的技術(shù)平臺，在細胞培養(yǎng)、組織器官重建、基因工程技術(shù)、各種蛋白和分子水平的分析與鑒定、體內(nèi)外分化模型的建立和應(yīng)用研究等與干細胞、組織工程和再生醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究技術(shù)方面積累了非常豐富的經(jīng)驗，從而為本項目的完成提供了技術(shù)保障。 本項目組由口腔疾病研究國家重點實驗室、組織工程國家工程研究中心、第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程研究中心、首都醫(yī)科大學(xué)牙齒再生實驗室及生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室聯(lián)合組成，擁有完善的實驗設(shè)施和條件，可提供本項目需要的全部大中型設(shè)備。本項目的上述研究成果均基于該研究平臺，尤其在牙齒發(fā)育與再生中的研究具有自己的特色，得到了國內(nèi)外同行的廣泛重視。與美國南加州大學(xué)、英國利茲大學(xué)和伯明翰大學(xué)等保持密切的合作。這些為本項目的實施提供了物質(zhì)保障。 4 研究隊伍實力雄厚： 本項目組各課題負責(zé)人及學(xué)術(shù)骨干均為牙再生及組織工程領(lǐng)域的知名學(xué)者 ，本項目組成員施松濤教授、柴洋教授是國際牙發(fā)育及再生領(lǐng)域的著名學(xué)者，與本項目組有多年合作的研究基礎(chǔ)，在課題研究和人才培養(yǎng)方面將發(fā)揮重要的作用。各課題組均有年輕的優(yōu)秀人才在國外培養(yǎng)，為本課題建立了良好的國內(nèi)外交流途徑和人才儲備。 課題設(shè)置 本項目是圍繞牙齒發(fā)育和再生進行相關(guān)的基礎(chǔ)研究，首先要研究并明確牙齒發(fā)生、發(fā)育的分子調(diào)控機理，為全牙再生提供理論依據(jù)和實驗指導(dǎo)，并為牙發(fā)育和牙再生相關(guān)干細胞的分化調(diào)控及其機理研究奠定基礎(chǔ)；同時， 研制適于牙齒各種組織成份構(gòu)建的生物支架材料，為實現(xiàn)牙齒再生奠定實驗基礎(chǔ) ；上述各研 究是有機結(jié)合、循序漸進的系統(tǒng)，其最終目標是明確牙齒發(fā)育機理并實現(xiàn)牙的再生。 本項目擬設(shè)置以下四個課題： 課題一 牙發(fā)生發(fā)育中上皮 在建立牙胚上皮 質(zhì) 離解 重組體外培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因敲除、轉(zhuǎn)基因和 技術(shù)探討 在牙胚發(fā)育中上皮和間充質(zhì)相互作用的調(diào)控 機制；觀察不同外部微環(huán)境對于牙胚上皮 和間充質(zhì)干細胞相互作用的影響。 本課題研究目標： 通過對牙發(fā)生發(fā)育基因調(diào)控機制的研究，發(fā)現(xiàn)牙胚上皮和間充質(zhì)中起關(guān)鍵作用的信 號分子；明確牙胚上皮和間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的分子機制；尋獲牙胚中干細胞和祖細胞誘導(dǎo)分化的微環(huán)境，進而獲得牙胚發(fā)育形態(tài)發(fā)生期間的分子作用機制。 該課題的 第一 承擔(dān)單位是首都醫(yī)科大學(xué)。 課題二 牙源性干細胞發(fā)育起源及其牙向誘導(dǎo)分化機制研究： 應(yīng)用基因敲除、生物芯片、 技術(shù)研究顱神經(jīng)嵴及其不同發(fā)育階段牙源性干細胞牙向分化的分子調(diào)控機制，并對牙源性間充質(zhì)細胞（如：牙髓干細胞）和牙源性上皮細胞（如：頸環(huán)干細胞）的成牙分化及其機理等進行系統(tǒng)性研究。 本課題研究目標： 通過對牙源性干細胞發(fā)育起源及牙向分化的研究，探討 不同發(fā)育時期的牙源性干細胞的基因差異表達、成牙分化能力、分子調(diào)控機制等，進一步闡明牙發(fā)育過程中牙源性干細胞牙向分化機制。 該課題的承擔(dān)單位是四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室 。 課題三 用于牙再生的上皮與間充質(zhì)細胞的替代細胞誘導(dǎo)分化的研究： 建立微環(huán)境誘導(dǎo)體系，研究多種非牙源性成體干細胞（骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、表皮干細胞等）牙向分化能力及機制， 利用 能干細胞的特點，研究其向牙源性上皮及間充質(zhì)細胞分化的相關(guān)機制， 探索用于牙再生種子細胞（上皮及間充質(zhì)細胞）的替代細胞 。 本課題研究目標： 明 確多種非牙源性干細胞和 胞的成牙分化潛能，建立非牙源性干細胞和 胞牙向分化的誘導(dǎo)體系，探索可用于牙再生種子細胞（上皮及間充質(zhì)細胞）的替代細胞。 該課題的 第一 承擔(dān)單位是 中國人民解放軍 第四軍醫(yī)大學(xué)。 課題四，基于牙齒發(fā)育原理的大型動物體內(nèi)牙齒再生研究： 基于牙發(fā)育中上皮 建牙再生的微環(huán)境， 探討生物支架材料的成份和性能對 牙源性干細胞及非牙源性成體干細胞 的生長和牙向分化影響，并 進行種子細胞 /支架材料在不同微環(huán)境下的構(gòu)建和大動物體內(nèi)牙再生研究， 闡明牙再生相關(guān)機制。 本課題研究目標： 基于牙發(fā)育中上皮 建牙再生的微環(huán)境，研制出適宜牙再生的生物支架材料，用牙源性干細胞及非牙源性成體干細胞作為種子細胞復(fù)合生物支架材料在大動物體內(nèi)實現(xiàn)牙再生， 重點研究牙根再生和生物性牙根，并明確牙再生相關(guān)機理。 該課題的承擔(dān)單位為組織工程國家工程研究中心 （上海國睿生命科技有限公司組織工程（上海）國家工程研究中心） 。 各課題間相互關(guān)系以及與總體目標和 5年目標的關(guān)系 進行牙齒再生，首先必須闡明牙齒發(fā)生發(fā)育分子機理，因此，通過研究牙胚上皮 確牙胚上皮和間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的分 子機制 (課題一 )，并探討牙源性干細胞起源和牙向分化機制，以及不同發(fā)育時期的牙源性干細胞的基因差異表達、成牙分化能力、分子調(diào)控機制等，進一步揭示牙發(fā)育機理（課題二），這是實現(xiàn)牙齒再生的基礎(chǔ)和首要任務(wù)；在此基礎(chǔ)之上，以牙源性干細胞牙向誘導(dǎo)分化為理論依據(jù)，研究非牙源性干細胞誘導(dǎo)成牙及其機制，解決牙再生微環(huán)境和種子細胞來源等關(guān)鍵問題（課題三）；繼而，基于上述牙發(fā)育理論，進行大動物體內(nèi)的牙再生研究， 重點研究牙根再生和生物性牙根（課題四） 。綜上，各課題之間層次分明且環(huán)環(huán)相扣，其共同目的均為明確牙發(fā)育機理和探索牙再生， 服務(wù)于項目總體目標。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標 第 一 年 1） 牙胚上皮 重組體外培養(yǎng)模型的建立 2） 牙發(fā)生發(fā)育過程中不同階段的 牙源性 上皮和間充質(zhì) 干細胞發(fā)育起源研究 3） 進行各種 非牙源性干細胞 的生物學(xué)特性，及其 向牙源性上皮細胞分化的研究 4） 探討多種生物材料的不同生物理化特性，進行 牙再生生物支架材料的研發(fā) 1) 通過對牙發(fā)生發(fā)育基因調(diào)控機制的研究，發(fā)現(xiàn)牙胚上皮和間充質(zhì)中起關(guān)鍵作用的信號分子； 通過對牙源性干細胞發(fā)育起源及牙向分化的研究，探討不同發(fā)育時期的牙源性干細胞的基因差 異表達 ； 明確多種非牙源性干細胞和 基于牙發(fā)育中上皮 建牙再生的微環(huán)境 2) 發(fā)表具有較高影響因子 7篇 3) 申請國家發(fā)明專利 23項 第 二 年 1） 在牙胚發(fā)育中的調(diào)控作用，從而研究其在牙發(fā)生發(fā)育過程中的 作用機制 2) 牙發(fā)生發(fā)育過程中不同階段牙源性上皮和牙源性間充質(zhì)干細胞在 牙向分化 過程中，其 關(guān)鍵基因調(diào)控 作用 的研究 3） 各種 非牙源性干細胞 生物學(xué)特性及其 向牙源性間充質(zhì)細胞 誘導(dǎo) 分化及 機理 的研究 4） 應(yīng)用種子細胞和生物材料技術(shù)，研究 具有牙周膜結(jié)構(gòu)的生物牙根構(gòu)建 1) 明確牙胚上皮和間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的分子機制； 探討不同發(fā)育時期的牙源性干細胞成牙分化能力 ； 建立非牙源性干細胞和 胞牙向分化的誘導(dǎo)體系 ； 研制出適宜牙再生的生物支架材料 2) 發(fā)表具有較高影響因子 9篇 ;申請國家發(fā)明專利 23項。 3) 培養(yǎng)博士后 34人，博士生 5 9人，碩士 6 10人 研究內(nèi)容 預(yù)期目標 第 三 年 1) 利用基因敲除 等 技術(shù)研究 分析發(fā)生發(fā)育過程中對 牙齒形態(tài)發(fā)育的作用 2） 牙發(fā)生發(fā)育過程中 牙源 性間充質(zhì)干細胞牙向誘導(dǎo)分化的研究 3） 多能誘導(dǎo)干細胞 力及相關(guān)分子機理 的研究 4) 應(yīng)用生物材料和細胞生物學(xué)技術(shù)研究牙根 再生機理 1) 尋獲牙胚中干細胞和祖細胞誘