細(xì)胞與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實驗實驗設(shè)計實驗名稱B基因表達(dá)產(chǎn)物與心肌細(xì)胞缺血損傷的關(guān)系及B基因表達(dá)產(chǎn)物與A藥物保護(hù)心肌細(xì)胞的關(guān)系關(guān)于B基因表達(dá)產(chǎn)物與心肌細(xì)胞缺血損傷之間的關(guān)系及藥物與基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用的實驗一、實驗?zāi)康囊阎狝藥物具有保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血損傷的作用，且心肌細(xì)胞缺血過程中B基因的表達(dá)產(chǎn)物B蛋白表達(dá)量會發(fā)生改變。本實驗通過設(shè)計實驗來證明（1）B基因的表達(dá)產(chǎn)物與心肌細(xì)胞缺血之間的關(guān)系。（2）在A藥物保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血損傷過程中，B基因的表達(dá)產(chǎn)物是否參與其中。二、實驗原理（1）體外模擬心肌細(xì)胞缺血模型建立體外心肌細(xì)胞缺血模型，能夠使我們從細(xì)胞水平來研究心肌細(xì)胞缺血過程中，發(fā)生的改變與反應(yīng)。取小鼠的心肌細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，以缺血液（無糖）及高純氮氣（95N2、CO2）持續(xù)通氣，來建立心肌細(xì)胞的缺血模型。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)（IMMUNOCYTOCHEMISTRY）即將抗原、抗體間的免疫反應(yīng)引入細(xì)胞標(biāo)本，再用標(biāo)記了生物素、熒光素等的二抗結(jié)合一抗，二抗再與標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（鏈酶親和素等）結(jié)合，最后通過顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)來顯示細(xì)胞中的抗原。在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，籍此對細(xì)胞內(nèi)某抗原作定性、定位以及定量檢測。鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（SABC技術(shù)）利用鏈霉親和素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生物素標(biāo)記的酶，其對生物素分子親和力極高，對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，因此該方法背景很低。DAB顯色HRPH2O2HRPH2O2（HRP辣根過氧化物酶）HRPH2O2DH2HRPD2H2O（DAB3,3二氨基聯(lián)苯胺）產(chǎn)物為棕黃色（3）CCK8比色法細(xì)胞活力測定CCK8試劑中含有WST8（22甲氧基4硝基苯基34硝基苯基52,4二磺酸苯2H四唑單鈉鹽），它在電子載體1METHOXYPMS（1甲氧基5甲基吩嗪硫酸二甲酯）的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚，且生成甲瓚的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450NM波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。三、器材與試劑1材料小鼠2儀器96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)儀、移液槍、槍頭、滴管、顯微鏡、解剖刀、鑷子、離心機(jī)、離心管、缺氧培養(yǎng)箱3試劑缺血液、甲醇、PBS、封閉液、一抗、二抗、SABC、DAB、03H2O2PBS、DMEM培養(yǎng)液、II型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、A藥物、CCK8工作液（原液無血清高糖DMEM110）模擬缺血液NACL118MMOL/L，NAHCO324MMOL/L，KCL16MMOL/L，KH2PO410MMOL/L，CACL225MMOL/L，MGCL212MMOL/L，NAEDTA05MMOL/L，乳酸鈉20MMOL/L，將PH調(diào)為62，置于4C凍存。PBS磷酸鹽緩沖液（001M，PH72）封閉液5牛血清白蛋白（BSA，即用型）一抗小鼠IGG（抗小鼠、抗大鼠、抗人），用時PBS稀釋（1300）二抗山羊抗小鼠IGG生物素化SABCAVIDINBIOTINPEROXIDASECOMPLEX鏈酶親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物DABDIAMINOBENZIDINE顯色液試劑盒3,3二氨基聯(lián)苯胺、TBS、H2O2四、實驗步驟1B基因的表達(dá)產(chǎn)物與心肌細(xì)胞缺血間的關(guān)系（1）心肌細(xì)胞培養(yǎng)取小鼠10只，處死，取出心臟，用PBS清洗34次，去心包膜及心房。將心室剪碎至1MM3左右的顆粒，加入5ML透明質(zhì)酸酶II型膠原酶混合酶，于37C消化20MIN，輕輕吹打，靜置1MIN后收集上清液，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化。過濾，離心并棄上清液，加入4ML培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，接種于四個不同的96孔板（分別為對照組、缺血1H、2H、4H），每組3孔，37C、5CO2孵箱中培養(yǎng)，每24H換液一次。培養(yǎng)至第5天的細(xì)胞用于實驗。（2）體外心肌細(xì)胞缺血模型的建立吸棄原培養(yǎng)液，用PBS洗三次，每次都輕輕晃動96孔板。向缺血1H、2H、4H組加入缺血液，對照組依然加入DMEM培養(yǎng)液。將缺血組96孔板放入缺氧裝置中，沖入高純氮氣（95N2、CO2），流量10L/MIN，大約30MIN左右，用O2CO2濃度檢測儀測得O2濃度1時，同時關(guān)閉進(jìn)氣口與出氣口，放入孵箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)至預(yù)計時間后取出。（3）固定吸棄培養(yǎng)液，PBS洗，輕輕搖動后小心吸棄，重復(fù)3次，加入甲醇固定5MIN。（4）封閉PBS洗3次，加入25L封閉液，37C培養(yǎng)30MIN，吸棄上清液。（5）每孔加一抗25L，37C培養(yǎng)2H后置于4C冰箱過夜。（6）吸棄上清液并用PBS洗3次，加入二抗25L，37C培養(yǎng)2H。（7）吸棄上清液并用PBS洗3次，加入30L03H2O2PBS，37C培養(yǎng)30MIN。（8）吸棄上清液并用PBS洗3次，加入25LSABC工作液（即用型），37C培養(yǎng)30MIN。（9）吸棄上清液并用PBS洗3次，用三蒸水稀釋DAB顯色液（20倍），混勻后加入96孔板，每孔25L，鏡下控制，細(xì)胞被染上色后，即以蒸餾水終止反應(yīng)。（10）吸棄上清液，加入適量蒸餾水，觀察結(jié)果。2B基因的表達(dá)產(chǎn)物是否參與A藥物保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血損傷過程（1）分組傳代心肌細(xì)胞至96孔板，分四組（陰性對照組（缺血、不給藥）、加A藥物20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L），每組4孔（兩孔用作細(xì)胞活力檢測，兩孔通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測B基因表達(dá)產(chǎn)物）。另取一個96孔板，傳代心肌細(xì)胞至其中的4孔，用作陽性對照（不缺血、不加藥）（2）體外心肌細(xì)胞缺血模型的建立培養(yǎng)心肌細(xì)胞24H后，缺血組吸棄原培養(yǎng)液，加入適量缺血液，實驗組分別加入濃度為20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L的A藥物，96孔板放入缺氧裝置中，沖入高純氮氣（95N2、CO2），流量10L/MIN，大約30MIN左右，用O2CO2濃度檢測儀測得O2濃度1時，同時關(guān)閉進(jìn)氣口與出氣口，放入孵箱中培養(yǎng)4H后取出。（3）細(xì)胞活力測定（52孔）吸棄缺血液，用PBS洗三次，每孔加110ULCCK8工作液，作用1H，用酶標(biāo)儀在450NM波長處比色，測定吸光度。（11）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（52孔）吸棄缺血液，PBS洗3次，甲醇固定5MIN；PBS洗3次，加入25L封閉液，37C培養(yǎng)30MIN；吸棄上清液，加一抗25L，37C培養(yǎng)2H后置于4C冰箱過夜；PBS洗3次，加入二抗25L，37C培養(yǎng)2H；PBS洗3次，加入25LSABC工作液（即用型），37C培養(yǎng)30MIN；PBS洗3次，用三蒸水稀釋DAB顯色液（20倍），混勻后每孔加入25L，鏡下控制，細(xì)胞被染上色后，即以蒸餾水終止反應(yīng)；吸棄上清液，加入適量蒸餾水，觀察結(jié)果。五、預(yù)期結(jié)果1B基因的表達(dá)產(chǎn)物與心肌細(xì)胞缺血間的關(guān)系一系列操作后，B基因表達(dá)產(chǎn)物被染為金棕色，通過比較顏色的深淺，我們可以知道B基因表達(dá)產(chǎn)物量的多少。如果總體而言缺血組顏色比空白組深，說明心肌細(xì)胞缺血過程中，B基因表達(dá)產(chǎn)物會增加，暗示了缺血損傷可能引發(fā)了B基因相關(guān)的凋亡通路，或者B基因表達(dá)產(chǎn)物會引發(fā)CASPASE級聯(lián)反應(yīng)；還有一種可能，B基因表達(dá)產(chǎn)物參加某種細(xì)胞內(nèi)的自我保護(hù)機(jī)制，心肌細(xì)胞缺血后，這種保護(hù)措施被啟動，B基因表達(dá)產(chǎn)物增加。如果缺血組總體而言，顏色比空白組淺，說明B基因表達(dá)產(chǎn)物在缺血損失時表達(dá)減少，則B基因有可能是一種抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的基因。而通過比較缺血2H、4H、6H組的顏色差異，可以觀察B基因表達(dá)量隨缺血損失時間的改變情況，應(yīng)該會出現(xiàn)逐漸遞增或遞減的情況，也不排除在4H出現(xiàn)表達(dá)高峰或谷底的可能。2B基因的表達(dá)產(chǎn)物是否參與A藥物保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血損傷過程首先，通過比較吸光度的OD值，我們可以歸納出組間細(xì)胞活性的差異，OD值越大，細(xì)胞活性越大?？梢灶A(yù)期的是，陰性對照組的細(xì)胞活性低于陽性對照組的細(xì)胞活性。分別比較加A藥物20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L組與陰性陽性對照組的OD值差異，我們可以判斷在該種藥物濃度的保護(hù)下，細(xì)胞是否得到了保護(hù)，保護(hù)效果及程度如何，活性是更接近于未加入保護(hù)的缺血細(xì)胞（即保護(hù)作用比較有限），還是更接近于未進(jìn)行缺血損傷的陽性對照組（說明保護(hù)效果非常好）。通過比較三個加藥組之間細(xì)胞活性的差異，我們可以分析哪種藥物濃度具有最好的保護(hù)作用。其次，通過免疫細(xì)胞化學(xué)的顯色結(jié)果，我們可以得出B基因表達(dá)產(chǎn)物是否有量的改變，進(jìn)而得出B基因是否參與A藥物對心肌細(xì)胞缺血的保護(hù)作用。如果缺血并給藥組的細(xì)胞染色深淺介于陰性對照和陽性對照之間，則可以證明B基因表達(dá)產(chǎn)物在A藥物保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血損失的過程中發(fā)生了量的變化，是參與其中的。而通過比較加A藥物20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L組之間細(xì)胞顏色的差異，再結(jié)合3者細(xì)胞活性的差異，則可以判斷B基因的表達(dá)情況與保護(hù)效果的關(guān)系，如果細(xì)胞活性越高，B基因表達(dá)產(chǎn)物越多，說明B基因表達(dá)產(chǎn)物對A藥物的保護(hù)起到輔助作用；反之，如果活性高的細(xì)胞所表達(dá)的B基因產(chǎn)物反而更少，說明B基因是一種促進(jìn)凋亡的基因，A藥物通過減少B基因表達(dá)產(chǎn)物的量來抑制相關(guān)凋亡通路，繼而起到保護(hù)細(xì)胞缺血損失的作用。六、參考文獻(xiàn)1鐘理,宋治遠(yuǎn)模擬缺血再灌注