1、ctdna檢測技術(shù)cdna檢測技術(shù)循環(huán)腫瘤dna（irculting umo dna,ctda)來源于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的da片段,是循環(huán)游離a(circulag cll-fre da,fdna)的一部分1。ca含有與其來源腫瘤dna同樣的基因缺陷,如點突變，重排,擴(kuò)增等2;其在血液中的半衰期短，可實時反映腫瘤的動態(tài)變化3；作為液體活檢的一種，可克服組織活檢中由于腫瘤異質(zhì)性帶來的缺陷,檢測更全面,因此ctda的檢測可用于癌癥早期診斷與癌癥分期、腫瘤的療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷等。由ctdna的質(zhì)量和數(shù)量變化大,因此需要高特異性和高靈敏度的檢測方法。目前常用的方法有數(shù)字pc（gta

2、pcr,dpcr)、baig (bead, mlsn，ampfcion nd magnetic)、高通量測序（egeneationseencin， n)、rms等6。1數(shù)字cr199年voglstein等提出了數(shù)字pcr(dta r,dpcr）的概念。數(shù)字pr包括兩部分,即pcr擴(kuò)增和熒光信號分析。先將是樣品稀釋后分配到大量微小的反應(yīng)單元中，每個單元包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子，然后分別對目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。數(shù)字pcr采用直接計數(shù)的方法進(jìn)行定量分析, 有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子,記為1，無熒光信號的則即為0，理論上，在樣品

3、中極限稀釋的情況下，有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)da分子的拷貝數(shù)。但是有的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子，這時需要用泊松概率分布公式進(jìn)行計算。不同于傳統(tǒng)的pcr技術(shù)，數(shù)字pcr 不受擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(ct) 和擴(kuò)增效率的影響，無需參照,準(zhǔn)確性和重復(fù)性好,可實現(xiàn)絕對定量分析。根據(jù)反應(yīng)單元類型不同,數(shù)字cr分為三類:微反應(yīng)室/ 孔板數(shù)字pcr、微流控芯片和微滴數(shù)字pc系統(tǒng)。微反應(yīng)室/孔板數(shù)字pcr借助高通量自動上樣設(shè)備和增加的反應(yīng)單元數(shù)，實現(xiàn)快速精確取樣,提高檢測靈敏度。微流控芯片技術(shù)是一種基于含有數(shù)千個超高密度親疏水微孔芯片的dpr平臺,可實現(xiàn)高通量、低成本分析。微滴數(shù)字p(

4、drpletdigtal pcr，dpcr)是將含有目標(biāo)分子的樣品分成成千上萬個納升級的油包水微滴,再對每個微滴進(jìn)行擴(kuò)增，和熒光信號的采集,更容易實現(xiàn)小體積和高通量10。數(shù)字pcr可絕對定量,是目前靈敏度最高的檢測技術(shù)，但其也存在一定缺點,如生成的微滴必須服從泊松分布，所以不適合高濃度da樣本檢測,；只能檢測已知的突變且一次只能檢測一種突變11,12。2.aming技術(shù)beag技術(shù)在檢測tda內(nèi)體腫瘤突變具有非常高的靈敏度,它是結(jié)合了數(shù)字pcr以及流式技術(shù)的一種檢測方法，最早是由bert vgelstein提出。其方法是每一類dna分子都會專一的與磁性珠相連接,然后dn分子之間的差異可以通過流

5、式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記來做出評估。這種方法是基于小珠（bed)、乳濁液(eson）、擴(kuò)增(amplificatio）、磁性(mgneic),這四個主要組分來構(gòu)建的,所以被稱作為beamig。 beamg 技術(shù)的過程包括:首先是分離和純化血漿中的dna;接著是預(yù)擴(kuò)增步驟,通過使用常規(guī)pcr 擴(kuò)增目的基因片段,使用引物與已知的標(biāo)記序列混合;然后,這些dn 模板再通過乳液pcr擴(kuò)增，應(yīng)用引物探測這些序列，通過鏈酶親和素磁珠相互作用與有磁性的微膠珠結(jié)合。通過這種方式設(shè)計的系統(tǒng),在反應(yīng)結(jié)束之前,每個乳液液滴中生成的pcr 產(chǎn)物將保持對微膠珠的附著性，使其可以很容易地通過磁性進(jìn)行分離和純化14。并且，bem

6、g技術(shù)是利用磁珠來吸附游離da，它可以從萬個健康細(xì)胞dna中檢測出那一個ctdna分子,具有較高的敏感性，同時在很多研究中其在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的突變都和ctna部分突變是一致的15,16。bai技術(shù)相比其他檢測技術(shù)具有很多優(yōu)勢：(一）在常規(guī)實驗室條件下,數(shù)以萬計的dna分子可以通過該種方法來進(jìn)行評估。（二)特異的突變可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離篩選以備進(jìn)一步分析和研究。(三）baming技術(shù)可以用來對特定組織或者人群中罕見的突變，以及研究一般基因序列或轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的變異都可以提供相應(yīng)的鑒別和定量分析。由于外周血流中ctdna 拷貝的數(shù)量是很低的，特別是相較于野生型dna 來說。出于這個原因，使用pc

7、r 進(jìn)行d 擴(kuò)增是beaming 過程中的一個重要部分，是確?？煽繖z測的保證。然而，beaming 這項檢測技術(shù)只能檢測已知突變，且成本較高17 同時，它的操作也較復(fù)雜,通量低,且單分子擴(kuò)增在非均一的微滴中實現(xiàn),需要rcr預(yù)擴(kuò)增，會增加試驗誤差2。3.基于ns技術(shù)的檢測方法tda檢測技術(shù)，除了基于pcr檢測方法之外,還有一種以高通量測序技術(shù),又稱“下一代”測序技術(shù)（ngs）為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法主要是選定十幾到幾十個腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行測序,測序通量和效率高。根據(jù)富集策略的不同，基于gs的技術(shù)目前又可分為靶向擴(kuò)增子測序(tas)及目標(biāo)序列捕獲測序（c)。靶向擴(kuò)增子測序（tas)技術(shù)是針對目的基

8、因設(shè)計幾十對甚至上百對cr引物，利用多重pcr擴(kuò)增富集。代表性方法有標(biāo)記擴(kuò)增深度測序(-q）。forsh等18 通過ta-seq測序技術(shù),檢測患者癌細(xì)胞中ctdna片段,從而找到腫瘤樣品中的遺傳突變。這種方法無需外科手術(shù)或者活檢，就可以找到癌癥突變。目標(biāo)序列捕獲測序(ts)技術(shù)是針對目的基因設(shè)計探針,通過捕獲雜交的方法富集，代表性方法有深度測序腫瘤個體化建檔法（cap-seq）。newn等19從腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫找復(fù)發(fā)突變相關(guān)的外顯子,再從腫瘤基因圖譜庫的47位非小細(xì)胞肺癌患者全基因組測序結(jié)果篩選。然后應(yīng)用迭代算法使每個非小細(xì)胞肺癌患者樣本的錯義突變最大化來簡化篩選器(elector)的大小，

9、最后的elecor能識別13個復(fù)發(fā)突變基因中的個外顯子和12個內(nèi)含子，長度約為25kb，平均能夠識別4個單核苷酸突變（snv），在96%的肺腺癌或鱗癌患者身上有效?；趎gs技術(shù)的檢測方法靈敏度高,能同時檢測多個基因的多種變異。但是其技術(shù)復(fù)雜,數(shù)據(jù)處理困難，實驗室水平差異較大,儀器與試劑的成本相對較高。想要臨床應(yīng)用,首先要將其標(biāo)準(zhǔn)化12。4.rm技術(shù)arms，全稱為突變擴(kuò)增系統(tǒng)(plifain refractrymuaon ssem），是由neton等人首先建立并用于檢測基因已知突變的方法20。利用pcr引物3端堿基必須與其模板dn互補(bǔ)才能進(jìn)行有效擴(kuò)增的基本原理,根據(jù)已知突變位點設(shè)計引物，使3

10、末端堿基分別與突變和野生型模板堿基進(jìn)行互補(bǔ)，實現(xiàn)擴(kuò)增，達(dá)到將“突變”模板與“野生”模板區(qū)分的目的12。arms法的主要特點有高特異性,高靈敏度以及耗時短，成本低，操作簡單等特點。其檢測結(jié)果的高特異性關(guān)鍵在于引物設(shè)計。arm法所用的引物是通過篩選能夠識別單個位點等位基因的引物,進(jìn)而保證了結(jié)果的高特異性。而r法檢測點突變的檢出率還取決于pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化和防止引物與靶a錯配可能發(fā)生的錯配延伸。pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化可以通過改變引物濃度、靶na濃度、taq酶濃度以及反應(yīng)體系溫度進(jìn)行調(diào)整2。此外,在反應(yīng)體系中加入甲酰胺可以減少非特異性擴(kuò)增,在引物3末端引入第二個錯配堿基也可以提高引物的特異性21。通過

11、在體系中加入多對引物可以實現(xiàn)多重擴(kuò)增,實現(xiàn)基因的多位點突變檢測。ams法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法，可檢測出樣品中含量低至01%1.0的突變基因;且該方法結(jié)合pcr技術(shù),操作簡單,耗時短，成本低,結(jié)果直觀3。目前,rs法已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢已被業(yè)內(nèi)專家廣泛認(rèn)可。但該方法只能用于檢測已知突變,在一定程度上限制其應(yīng)用。arms法檢測可以分為實時熒光定量pc和巢式ars法電泳檢測。實時熒光定量pr是指arms技術(shù)結(jié)合探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在實時定量p平臺上實現(xiàn)對樣品da中稀有突變的檢測4。而巢式rms法電泳檢測是利用凝膠電泳技術(shù)檢

12、測擴(kuò)增帶，從而實現(xiàn)結(jié)果分析。隨著rm技術(shù)的發(fā)展,商品化的am試劑盒相繼問世，包括人表皮生長因子受體(egr)基因突變檢測試劑盒,人kars基因突變檢測試劑盒，四項耳聾基因檢測試劑盒等?？偨Y(jié) 作為重要的腫瘤分子標(biāo)志物,ctdn在腫瘤的診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后等方面發(fā)揮著重要的作用，而da測序技術(shù)的發(fā)展使得通過檢測tna來指導(dǎo)腫瘤的臨床進(jìn)展變得更加切實可行。數(shù)字cr技術(shù)、beaming技術(shù)、ngs技術(shù)、arms技術(shù)在tna的檢測中各具其獨特的優(yōu)勢和不足之處,實際應(yīng)用時應(yīng)結(jié)合具體條件決定采用何種檢測方法。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步,ctda 將會逐漸從科研領(lǐng)域向臨床轉(zhuǎn)化發(fā)展。參考文獻(xiàn)1 yong . cane

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